Cet article décrit un protocole d'hybridation in situ optimisé pour la détection colorimétrique de l'expression de micro-ARN dans des sections de rein fixés au formol.
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Dans cet article, on décrit un procédé de détection colorimétrique de miARN dans le rein par hybridation in situ avec de la digoxigénine marqué dans les sondes de microARN. Ce protocole, développé à l'origine par Kloosterman et ses collègues pour une large utilisation de sondes Exiqon miRNA 1, a été modifié pour surmonter les difficultés inhérentes à l'analyse des miRNA dans les tissus rénaux. Il s'agit notamment des questions telles que l'identification de la structure et difficile à retirer la sonde résiduelle et anticorps. L'utilisation de relativement mince, 5 mm d'épaisseur, les coupes de tissus autorisés pour une visualisation claire des structures du rein, alors qu'un signal de la sonde solide a été maintenu dans les cellules. En outre, la concentration de la sonde et des conditions d'incubation ont été optimisés pour faciliter la visualisation de l'expression de microARN avec faible bruit de fond et le signal non spécifique. Ici, le protocole optimisé est décrit, couvrant la collecte de tissu initial et de la préparation à travers le montage de lames à la fin de la procédure. Le compone de basents de ce protocole peuvent être modifiés pour l'application à d'autres tissus et des modèles de culture cellulaire.
Introduction
MicroARN sont de petite taille (environ 22 nucléotides de long) non codantes des ARN qui sont produites de façon endogène. Ils fonctionnent généralement à supprimer l'expression de la protéine par la répression de translation ou la dégradation de l'ARNm. miARN se lient à des cibles ARNm avec complémentarité incomplète, ce qui permet à un seul miARN pour supprimer plusieurs cibles.
Comprendre les types et les structures cellulaires expriment miARN est une partie importante de la compréhension des mécanismes par lesquels des modifications dans miRNA influence d'expression cellulaire et des phénotypes de tissus. Bien que les méth....
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Protocole
Une. coupes de tissus rénaux
- Fixés au formol (10%) des sections de rein paraffine sont coupés sur des lames de microscope à 5 mm d'épaisseur en utilisant un Microm HM 355 S. Les lames peuvent être stockées pendant plusieurs mois avant l'analyse.
2. Préparation de la solution
- Préparer 1 L de PBS 1x dans le trou DDH 2 O dans une bouteille avec vis autoclavable. Remplir une autre bouteille de 1 L de ddH 2 O. Ajouter 1 ml de DEPC à chaque bouteille, couvercle et agiter vigoureusement. Que les solutions reposer toute la nuit à température ambiante pour détruire RNAses puis autoclave. Aj....
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Résultats
Les zones d'une section de tissu qui se dessécher pendant les hybridations, des incubations ou étapes de lavage généralement finissent par coloration plus sombre lors de l'élaboration du NBT / BCIP. Figure 1 montre une partie d'une section de rein, dans lequel le HybriSlip glissé hors du bord d' le tissu, lui permettant de devenir partiellement déshydraté. Malgré la réhydratation et la couverture dans les étapes restantes, le signal dans la partie déshydraté est artificiellement élevé. <.......
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Discussion
Le but de cet article est de décrire un protocole de miARN hybridation in situ qui fonctionne bien dans les tissus rénaux fixés au formol. Tout en travaillant sur ce protocole plusieurs sources importantes d'artefact coloration ont été identifiés. Une attention particulière à ces points peut aider à éviter la coloration artefact et augmenter la probabilité d'une course de ISH succès.
Une des causes les plus évitables de artefact coloration peut se produire lorsque des coupes.......
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Déclarations de divulgation
Il n'y a rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par les US National Institutes of Health accorde HL082798 et HL111580.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Paraformaldéhyde | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 70011044 | |
| Pyrocarbonate de diéthyle | Sigma | D5758 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Xylenes | Sigma | 534056 | |
| Ethanol | Ultra Pure | 200CSPTP | |
| Tris-HCl | Life Technologies | 15506-017 | |
| CaCl2 | Sigma | C2536 | |
| Glycine | J.T. Baker | 4059-00 | |
| Acide citrique | Sigma | C2404 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| 20x SSC Buffer | Life Technologies | 15557-044 | |
| Héparine | SAGENT | 25021-400-30 | |
| ARN de levure | Life Technologies | AM7118 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-1004 | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | |
| Protéinase K | Fermentas | EO0491 | |
| 3' DIG- sonde miARN | Exiqon | miR dépendant-05 | |
| 3' DIG- Sonde miR brouillée | Exiqon | 99004-05 | |
| 3' DIG- U6 sonde miR | Exiqon | 99002-05 | |
| Anti-Digoxigénine-Ab Fab | Roche | 11093274910 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Couvre-lames | Fisher | Fit to tissue size | |
| Microtom HM 355 S | Thermo Scientific | 23-900-672 | |
| Four d’hybridation coulissant | Boekel | 241000 | |
| Ensemble de plateau en aluminium | Boekel | C2403973 | |
| Insert de grille en acier inoxydable | Boekel | C2403754 |
Références
- Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney. Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).
- Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A.
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