Method Article

에서 항 정신병 약물의 작용 메커니즘을 공부하는 방법 예쁜 꼬마 선충

DOI:

10.3791/50864

⸱

February 4th, 2014

 , 
1Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 2Mailman Research Center, McLean Hospital

In This Article

Summary

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예쁜 꼬마 선충에서 항 정신병 약물 (APDS)의 효과를 테스트하기위한 접근 방법을 설명합니다. 분석법 개발과 생존에와 인두 펌핑 속도에 약물 효과를 테스트하기 위해 설명되어 있습니다. 이러한 방법은 APDS 이외의 다른 약 종류와 약물 유전 학적 실험에 적용 할 수 있습니다.

Abstract

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예쁜 꼬마 선충은 앞으로 대규모의 의무와 유전 화면과 화학 유전 화면을 반전 간단한 유전 유기체이다. C. elegans의 게놈은 신경 전달 물질의 합성과 시냅스의 구조와 기능에 필요한 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하여 잠재적 인 항 정신병 약물 (APD) 인간의 보존 목표를 포함한다. APD 노출은 농도 의존적​​으로 발달 지연 및 / 또는 선충의 치사율을 생성한다. 이러한 표현형 1,2 펌핑 인두의 APD 유발 억제에 의해 부분적으로 발생합니다. 따라서, 개발 표현형 진통제의 약물 유전 학적 연구에 유용하고, 신경 근육 학 기초를 가지고 있습니다. 여기에서 우리는 선충 개발 및 인두 펌핑에 APD의 효과를 시험하기위한 세부 절차를 보여줍니다. 개발 분석의 경우, 동기화 된 배아는 선충의 성장 매체 APDS를 포함 (NGM) 접시, 및 애니을 개발하는 단계에 배치됩니다MALS 그런 다음 매일 채점됩니다. 인두 펌핑 속도 분석을 위해, 젊은 성인 동물 APDS를 포함 NGM 플레이트에 시험 무대. 단위 시간당 인두 펌프의 개수가 기록되고, 펌핑 속도가 계산된다. 이러한 분석법은 작은 분자 또는 큰 분자의 다른 많은 유형을 연구를 위해 사용될 수있다.

Introduction

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예쁜 꼬마 선충은 대규모의 순방향 및 역방향 유전자 화면과 화학 유전 화면에 순종 간단한 유전 유기체이다. C. elegans의 생리 활성 화합물의 광범위에 민감하고, 따라서 이러한 화합물의 여러 가지의 작용 메커니즘을 정의하는 데 성공적으로 사용되어왔다. 예를 들어, 생체 활성 화합물은 웜 약물 유전학은 아세틸 콜린 수용체 작용제 (예를 들어 레바 미솔, 니코틴, morantel 및 pyrantel), 마취제 (예 : 할로 탄), 카페인, 콜린 에스 테라 제 억제제 (예 알디 카르 브, lannate 및 trichlorfon), 플루오 라이드, GABA-관련을 포함하여 연구 화합물 (예를 들어, GABA 및 muscimol), 이버 멕틴, 파라콰트, 포르 볼 에스테르, 세로토닌 관련 약물 (예, 세로토닌과 imiprimine) 3. 또한, C. 엘레하므로 대규모 저분자 스크린에 사용 된 새로운 생리 활성 화합물의 발견s 및 새로운 유전자 표적 4의 식별.

C. elegans의 게놈은 신경 전달 물질의 합성과 시냅스의 구조와 기능 5에 필....

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Protocol

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1. 발달 지연 / 치사율 분석 : 야생형 (N2)와 두 개의 돌연변이 (Mut1 및 Mut2) 균주가 12 - 웰 플레이트에 세 클로자핀 농도 테스트

  1. 1 일에 (2cm 직경 아니라 각) 12 - 웰 플레이트의 각 웰에 2 ㎖ NGM 매체 (10)을 부어 하룻밤 실온 (RT)에 벤치에 강화 할 수 있습니다. 같은 날, 하룻밤 220 rpm으로 회전에서 대장균 OP50 박테리아의 식민지를 선택 50 ㎖ LB 솔루션의 병을 감염, 그리고 37 ° C 통 문화를.
  2. 2 일에, 각 웰 NGM의 중심에 20 μL OP50 박테리아 문화를 전송할 수 있습니다. 37 ° C 배양기에서 접시를 품어 또는 세균 잔디가 두껍게 성장 할 수 있도록 실온에서 밤새을 둡니다.
  3. DMSO (디메틸 설폭 사이드) 용매에 클로자핀을 용해하여 80 mM의 클로자핀 주식 솔루션을 확인합니다. 그 후 1.7 mM의 아세트산 B에게 희석 원액과 80 ㎕의 작업 솔루션을표 1에 ased.
    참고 : 관심의 특정 약물에 대한 작업 솔루션은 돌연변이 체에서 야생 유형을 구별하기위한 가장 적절한 농도를 찾기 위해 예비 농도 일련의 테스트를 수행....

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Results

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1. 발달 지연 / 주죠 분석 결과

발달 지연 / 주죠 분석의 전형적인 결과는도 1a에서 설명하고 1B된다. 컨트롤 그룹에있는 야생 형 동물이 임신하는 성인 단계 (그림 1a)로 성장했을 때, 클로자핀에 노출 된 야생 형 동물은 죽은 (그림 1b). 그림 1C는 비교 대표적인 결과를 보여줍니다 젊은 유생 단계에 아직도 또는이다 억제 돌연변이 (Mut1)와 세 가지 클로자핀 농도에서 야생 유형 증강 돌연변이 (Mut2). 세 클로자핀 농도에서, Mut1의 치사율은 야생형보다 낮은와 Mut2의 치사율은 높다. 생존 Mut2 동물 야생형에 비해 발달 지연을 표시하면서 생존 Mut1 동물, 야생 타입보다 더 진보 된 애벌레 단계로 진행.

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Discussion

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여기, 우리는 C의 개발 및 행동에 APDS의 효과를 테스트하는 방법을 설명합니다 엘레. 약이 물에 상대적으로 불용성이기 때문에 DMSO 또는 에탄올, 클로자핀을 용해하는 데 사용됩니다. 용매는 C. 영향을 미치는 것으로보고되었다 있으므로 엘레 생물학 (12), DMSO 형 또는 에탄올 형 제어 그룹은 필수적이다. 우리의 분석에 사용 된 DMSO의 높은 농도는 C.에 명백한 영향을주지 않습니다 최대 3 %이며, 개발 엘레 간스. DMSO 심지어 많은 작은 분자, 또는 큰 분자, 예를 들면 지질 류에 사용될 수있다.

이러한 분석에 사용 된 APD 농도는 인간에게 주어진 것보다 더 높다. 이것은 C에서 가장 작은 분자 연구에 일반적입니다 elegans의 높은 농도는 C의 침투에 필요하기 때문에 표피 <.......

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Disclosures

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저자는 참여 관심 충돌이없는 것을 선언합니다.

Acknowledgements

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작품은 NIH 임상 과학자 개발 수상 K08NS002083, Shervert 프레이 연구소 그랜트, 에드거 A. Buttner에 NARSAD 젊은 탐정 수상에 의해 지원되었다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ClozapineSigmaC6305
Dimethyl sulfoxide (DMSO)SigmaD8418
Acetic acid (HAC)FisherBP2401
Sodium hydroxide (NaOH)EMDSX0590-13
HypochloriteSigma-Aldrich425044
Centrifuge 5810Eppendorf5810 000.017
인큐베이터 쉐이커New Brunswick ScientificM1246-0006
저온 인큐베이터 815Precision ScientificJ1790-1B
실체현미경OlympusSZX12
페트리 접시 35 x 10 mmFisher ScientificNC9434271
12-well Tissue Culture plateBD FalconREF 353043

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Donohoe, D. R., Jarvis, R. A., Weeks, K., Aamodt, E. J., Dwyer, D. S. Behavioral adaptation in C. elegans produced by antipsychotic drugs requires serotonin and is associated with calcium signaling and calcineurin inhibition. Neurosci. Res. 64, 280-289 (2009).
  2. Karmacharya, R., et al.

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Antipsychotic DrugsC elegansDevelopmental AssayPharyngeal PumpingNematode Growth MediumSynchronized EmbryosDrug ExposureGenetic ScreensPharyngeal Pumping RateDevelopmental Delay

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