Summary
Dit protocol beschrijft een werkwijze voor snelle verzameling afbeeldingen van Arabidopsis zaailingen reageren op een stimulus zwaartekracht met behulp van commercieel verkrijgbare flatbed scanners. De methode maakt het mogelijk voor goedkope, high-volume vastleggen van beelden met hoge resolutie vatbaar voor downstream analyse algoritmen.
Abstract
Onderzoek in de biologie steeds meer behoefte aan het gebruik van methodologieën die high-volume collectie van hoge-resolutie data mogelijk te maken. Een uitdaging laboratoria kan worden geconfronteerd is de ontwikkeling en verwezenlijking van deze methoden. Observatie van fenotypes in een proces van belang is een typische doelstelling van onderzoekslaboratoria bestuderen van gen-functie en dit wordt vaak bereikt door middel van het vastleggen van beelden. Een bijzonder proces dat vatbaar is voor observatie met behulp van beeldvormingstechnieken is de corrigerende groei van een zaailing wortel die is verplaatst van de aanpassing aan de zwaartekracht vector. Imaging platformen aan de wortel gravitropic respons te bepalen kan duur, relatief lage doorzet en / of arbeidsintensief. Deze kwesties zijn aangepakt door de ontwikkeling van een high-throughput image capture methode met behulp van goedkope, maar kwalitatief resolutie flatbed scanners. Met behulp van deze methode, kunnen de beelden worden vastgelegd om de paar minuten op 4800 dpi. De huidige opstelling maakt verzameling van 216 individuele rNTWOORDEN per dag. Het beeld verzamelde gegevens is van voldoende kwaliteit voor beeldanalyse toepassingen.
Introduction
Collectie van hoge-resolutie fenotypische gegevens nuttig zijn in studies die gericht zijn op het samenspel van genen en omgeving te begrijpen in het bemiddelen organismal functie 1,2. Studies van deze aard zijn ook inherent grote omvang, waardoor het bovendien noodzakelijk dat methoden voor het meten fenotypen in dit verband een hoog debiet 3,4. De vaststelling van methoden phenomics grootschalig onderzoek, afwegingen tussen doorvoer en resolutie in het spel komen. Methoden die hoger zijn overslag ook de neiging lager te zijn in de resolutie, waardoor het moeilijker om kleine effecten van genetica of omgeving 5 detecteren. Als alternatief, methoden die een gewenste fenotype meer zorgvuldig meet ook de neiging lager te zijn van de overslag, waardoor het moeilijk is om genetische en milieu-effecten in grote lijnen overzien. Bovendien kan handmatige methoden voor het kwantificeren fenotypes, zoals visuele inspectie worden gewijzigd op door verschillen in menselijke perperceptie 6.
Imaging technologieën kan een nuttige brug tussen doorvoer en resolutie voor het verkrijgen van fenotypische waarnemingen 7-9. In het algemeen, een beeld is relatief eenvoudig te vangen vergemakkelijken doorvoer, en wanneer genomen in voldoende resolutie, subtiele fenotypes gedetecteerd 1,2,7. Imaging technologieën hebben de neiging aanpasbaar aan een systeem of proces van belang om fit te zijn en zijn over het algemeen schaalbaar 10-12. Hierdoor beeldvormende technieken zijn ideaal voor de ontwikkeling van grootschalige studies organismale functie.
De reactie van de primaire wortel naar een zwaartekracht prikkel is een ingewikkeld fysiologisch proces dat plaatsvindt binnen een morfologisch eenvoudige orgel. De reactie omvat activatie van signaaltransductiewegen die zich voortplanten door de wortel orgaan en de progressie bepaald wordt door omgevingsfactoren en genetische factoren, waaronder genetische factoren beïnvloed door de omgeving 12-14 12,14,15. Het verkrijgen van een gedetailleerd begrip van de dynamiek van deze reactie is belangrijk vinden van manieren om het vermogen van zaailingen met succes worden binnen een bepaalde omgeving 16 vastgesteld verbeteren. Bovendien is de vorm van de wortels is het vatbaar voor beeldbewerkingstoepassingen 8,12,17. Samen genomen, de wortel gravitropic respons is een ideaal systeem voor de ontwikkeling van high-throughput imaging technologie voor het verrichten van genomics-niveau studies van organismal functie.
In dit rapport wordt een high-throughput, hoge-resolutie methode voor het vastleggen van de wortel gravitropic respons met behulp van goedkope, commercieel verkrijgbare flatbed scanners gepresenteerd. Het overzicht van deprotocol wordt getoond in figuur 1. Zaailingen geplant op agar platen werden geplaatst op verticaal georiënteerde flatbed scanners uitgerust met op maat plexiglas plaat houders. Beelden werden om de paar minuten op 4800 dpi verzameld en opgeslagen op een lokale schijf of dataserver. Metadata gekoppeld aan elke afbeelding serie wordt opgeslagen in een database en de opgeslagen beelden worden verwerkt. De aanpak maakt gebruik van de VueScan software voor het vastleggen van beelden. VueScan kan worden gebruikt om meer dan 2100 verschillende scanners op Windows, Mac of Linux besturingssystemen draaien (zie ook Materiaal tabel). Een scanresolutie van 4800 dpi werd gebruikt in deze toepassing om de resolutie bereikt in eerdere studies met behulp van vaste CCD-camera's 1,8,12 passen. De flexibiliteit van de VueScan software samen met de gemeenschappelijke interface die hij voor elke scanner loopt stelt gebruikers in staat om gemakkelijk vast te stellen vrijwel elke scanner hardware van voldoende resolutie om het protocol in dit document. Huidige doorvoer zorgt voor het verzamelen van216 individuele antwoorden per dag. De technologie is aanpasbaar en schaalbaar voor gebruik bij instellingen, variërend van hoge scholen tot universiteiten onderzoek. Bovendien zijn de verzamelde beelden zijn van voldoende kwaliteit voor beeldanalyse toepassingen.
Protocol
1. Image Acquisition Protocol
Overwegingen:
Dit protocol wordt efficiënter uitvoert met twee mensen, hoewel het mogelijk voor iemand om alleen te werken. De regeling werkt het beste in dit laboratorium was voor een persoon om platen te bereiden voor het scannen terwijl een andere werken op de scanner setup, waarna beiden werken samen om borden te plaatsen in scanners en start het scanproces.
Het is ook belangrijk op te merken dat de scanners in dit project verticaal georiënteerd zijn met de scanner deksels rust aan de achterkant van de scanner. Een aangepaste ondersteuning werd gemaakt om gerechten te houden in deze verticale positie en werd aangebracht op de flatbed oppervlak met 3M Command Strips (figuur 2). De afneembare deksel die bij de scanner wordt gebruikt in dit protocol (een Epson V700) werd gevoerd aan de ene kant met zwart vilt. De deksel werd geplaatst tegen de flatbed met een bungee koord omHoud de platen op hun plaats en beeldcontrast (figuur 3) te verstrekken.
Elke scanner van voldoende resolutie kan worden gebruikt voor het vastleggen van beelden. De Epson Perfection V700 werd gekozen omwille van zijn vierkant profiel (waardoor het gemakkelijk is om verticaal te plaatsen), de hoge resolutie en de extra opties te scannen vanuit de zowel het bed en het deksel en het infrarode kanaal te gebruiken. Deze extra opties werden niet gebruikt in dit protocol.
Nadat de platen zijn verwijderd uit de klimaatkast, is het noodzakelijk dat het protocol tot het einde.
Plaat Voorbereiding
Standaard platen met 10 ml transparante medium en 9 zaden geplant in het midden van elke plaat werden gebruikt. Procedures voor plaat etikettering, media voorbereiding en planten zijn te vinden op: http://www.doane.edu/doane-phytomorph
- Solliciteer Triton X-100 (een detergent) om deksel met een Kimwipe - wees gul.
(Merk op dat Triton X-100 helpt voorkomen dat de opbouw van condensatie op het deksel als de plaat wordt gescand. Een royaal applicatie (genoeg om een film op het deksel oppervlak te creëren) zal helpen ervoor te zorgen dat het deksel blijft transparant gedurende de hele scanner run .) - Wikkel de plaat met microporie tape om het deksel veilig te stellen, en te zorgen voor ventilatie.
Scanner Setup and Image Collection
Dit protocol veronderstelt dat meer dan 1 scanner wordt gebruikt, en geeft instructies om meerdere scanners een computer te starten.
- Maak mappen voor het opslaan van beelden van elke scanner. Elke scanner houdt twee platen, dus houd hier rekening mee bij het maken van mappen. Eenkan kiezen om metadata te gebruiken als componenten van de bestandsnaam, zoals unieke ID's voor elke plaat, zaailing leeftijden, zaadgrootte en id's van de voorraden geplant. Een voorbeeld van een mapnaam gebruikt bij het verzamelen van gegevens die deze metadata is "1652-2-sm-9-92-17-1653-2-LG-88-79-161".
- Stel uitlaat timers voor inzamelpunten tijd (9 uur werd gebruikt in dit laboratorium). Zorg ervoor dat u extra tijd (een uur of zo) in te stellen voor de voorbereiding.
(Merk op dat de scanners moeten worden aangesloten op stopcontact timers om de overname te stellen. Terwijl de VueScan software kan de gebruiker beelden herhaaldelijk te verzamelen, is het niet mogelijk de gebruiker aan te geven hoeveel beelden te verzamelen of hoe lang om beelden te verzamelen voor .) - Zet de eerste scanner en wacht ongeveer 10 seconden voor de scanner te gaan door middel van haar eerste warming-ups.
- Open zodra de VueScan programma. VueScan versie 9.0.20 werd gebruikt in dit protocol (zie ook Materiaal tabel), kan maar meer recente versies gebruikt worden met weinig modificatie. Zorg ervoor dat de knop 'Meer' is ingedrukt op het onderste paneel van de gebruikersinterface om de menu-opties die hieronder worden beschreven geven.
- Stel de Auto repeat: drop-down box voor niemand onder het tabblad Invoer en onder het tabblad Crop ingesteld Voorvertoning: op Maximum (figuur 4). Druk op 'Preview'.
- Maak een gewas doos die de regio van belang met behulp van de muis te klikken en te slepen over het gebied van de rente op het preview-beeld zou vangen. Instellingen kunnen worden gewijzigd voor de regio van belang zijn in het tabblad Crop. De typische instellingen gebruikt voor het vak gewas waren: x-offset 0.675;-y offset 1.924 in, maar dit is aangepast aan de zaailing gebied voor elke scanner vangen. Het gewas maat van de doos gebruikt was 7,246 in breed en 1.1 in hoog (figuur 5).
- Om het bijsnijdvak te verplaatsen, houdt u de Shift-toets ingedrukt tijdens het slepen met de muis. Zorg ervoor dat het vakje gewas bevat alle zaailingen te scannen plus eventuele gewenste metadata die kunnen worden opgenomen op een etiket (figuur 5).
- Onder het tabblad Crop, stelt het voorbeeldgebied: tot Crop doos en Druk op 'Preview'.
- Ga naar het tabblad Uitvoer en selecteer het juiste bestand voor de scanner (figuur 5).
- Herhaal stap 1,7-1,12 alle scanners voor een computer. Kies de 'ja' optie wanneer wordt gevraagd of u meer dan een exemplaar van VueScan openen.
- Ga door elk tabblad en controleer de instellingen correct zijn. (Merk op dat alle specificaties kan worden aangepast aan de behoeften van een individuele laboratorium zoals beeld-kleur, resolutie, etc passen. Echter, de instellingen die in dit protocol direct worden toegepast op de particular scannen hardware van een bepaald lab vanwege de gemeenschappelijke interface van de VueScan software. Raadpleeg de bijgevoegde lijst specificaties om de parameters gebruikt in dit project, met behulp van VueScan versie 9.0.20) te bekijken.
- Onder het tabblad Input kiezen Continu in Auto repeat: gebied, of kies een langere tijdsinterval tussen beelden indien gewenst. Het tijdsinterval is de lengte van de tijd de scanner pauzeert na het opslaan van de laatste afbeelding en beginnende verzameling van de volgende afbeelding. In Continu-modus, kan 3-4 min. resolutie zijn verkrijgbaar op 4800 dpi.
- Herhaal stap 1,14-1,15 voor de rest van de scanners aangesloten op een computer.
- Plaats voorbereid platen in de juiste scanners met zaailingen horizontaal georiënteerd (niet gravistimulate).
- Tijdelijk plaatsen van een zwarte, vilten achtergrond tegen de platen, zodat ze niet uit plexiglas sjabloon vallen. Herhaal dit voor alle scanners.
(Opmerking: In dit project werden zwarte stukken vilt aan de document omvat voorzien van apparatuur om verblinding te voorkomen en contrast tegen wortelweefsel over een specifieke achtergrondkleur zal afhangen van de kleur van weefsel worden afgebeeld.). - Laat een persoon zet de platen 90 ° (platen werden naar links draait in dit protocol) en onmiddellijk vervangen van de vilt achtergrond.
- De andere persoon moet staan op de computer, zodat ze onmiddellijk kunnen op de 'Scan' knop.
- Maak de achtergrond van de scanner met een bungee koord (figuur 3). Laat een persoon de achtergrond in plaats terwijl de andere posities van de bungee koord.
(Let op: Direct na gravistimulation (rotatie van de platen van 90 °) en de plaatsing van het vilt achtergrond, moet 'Scan' worden ingedrukt). - Herhaal stap 1.17-1.21 voor de rest van de scanners op een compuER.
- Herhaal stap 1,6-1,22 voor de volgende reeks van scanners, indien van toepassing.
- Laat de scanners niet verlaten tot verschillende beelden zijn verzameld om ervoor te zorgen dat ze correct opslaat.
- Het is ideaal om de scanners in een gebied dat vrij is van verstoringen voor de aangewezen scantijd zal houden. Het is ook verstandig om de milieuomstandigheden in het te scannen gedeelte beschouwen als ideale fenotypische reacties te garanderen.
- Bij het verzamelen van gegevens is voltooid, drukt u op de groene knop Afbreken te klikken op elke VueScan venster dat samenvalt met elke scanner.
- Sluit uit alle programma's op de computer.
- Herstart de computer en schakel alle scanners voor het begin van een nieuwe ronde van beeldcollectie.
Representative Results
Vertegenwoordiger Afbeeldingen
Deze benadering maakt een snelle productie van hoge-resolutie tijdreeksen van Arabidopsis zaailingen groei. Eerste en laatste beelden van een scanner proef zijn weergegeven in de figuren 7A en 7B. Figuren 7C en 7D tonen een optimaal resultaat van een half beeld vol scanner van. Sommige problemen die van invloed kunnen de beeldkwaliteit worden getoond in figuren 7A en 7B. Deze problemen zijn onder variatie in kieming, variatie in zaailing groei traject bij de start van de run, en opbouw van condens tijdens het scannen. Condensatie kan grotendeels worden opgelost door de hoeveelheid Triton X-100 aan de binnenzijde van de deksel plaat. Andere factoren die nauwkeurige beeldcollectie kan remmen zijn onjuiste configuratie van de doos gewas ten opzichte van de plaat positie en positionering platen zodanig dat ze scheef ten opzichte van de doos gewas.
Image Analysis Application: Afbeeldingscompressie
Zodra een tijdreeks scanner opnamen is verkregen, moet veilig opgeslagen in een netwerk toegankelijke wijze beeldanalyse vergemakkelijken. De beeldbestanden in verband met een individuele scanner run nemen een aanzienlijke hoeveelheid harde schijf ruimte. Een TIFF-bestand verzameld op 4800 dpi is ongeveer 220 MB en een typische scanner run genereert 200 beeldbestanden. Daarom, ongeveer 44 GB harde schijf ruimte nodig is per run. Opslag en netwerk transmissie kosten beeldanalyse verminderen wenselijk om de hoeveelheid ruimte die nodig is om het opslaan van gegevens, terwijl op hetzelfde moment geminimaliseerd verlies van gegevens te beperken. Stroomafwaarts analyse zal identificatie van elke zaailing betrekken bij latere beeldbestanden geassocieerd met een experimentele run. Daarom segmenteren out single zaailingen van het imago van de scanner kan stroomafwaarts analyse te vergemakkelijken. Door segmentatie van de zaailing van de rest van de ee beeld kan ook aanzienlijk opslag onnodige achtergrondpixels verminderen, deze aanpak leidt tot aanzienlijke vermindering datagrootte. Bovendien, als stroomafwaarts analyse gericht op wortelweefsel kan het niet noodzakelijk zijn om kleurinformatie behouden aangezien de wortel pixels relatief smal in de kleurenruimte. Is ontwikkeld Een computerbeeld verwerking protocol en code om data te verkleinen door zowel segmenteren uit individuele zaailingen en het omzetten van beelden naar grijstinten. De aanpak resulteert in een 60% vermindering van opslagruimte eisen.
De gebruikte deze datacompressie bereiken workflow wordt beschreven in de volgende stappen:
- Begin met een tijdreeks van de scanner beeldbestanden in een map.
- Voor elk beeld, converteren van een RGB naar grijs schaal (figuur 8, top).
- Splits het beeld in linker-en rechterkant.
- Uittreksel elke zaailing uit de afbeelding in een eigen bestand (figuur 8).Dit gebeurt door een drempel pixels converteren naar zwart, wit en dan het totale pixel intensiteit van elke afbeelding rij. De regel met de hoogste intensiteit wordt geïdentificeerd en elk beeldpunt geclassificeerd als "plant" of "nonplant 'op basis van de intensiteit van zijn buren. Het centrum van elke 'fabriek' in deze rij is gevonden en vanaf dat punt een gewas doos van een vooraf bepaalde grootte wordt getrokken (figuur 8, onder).
- Maak een aparte map voor elke zijde van de afbeelding (links en rechts) met aparte submappen voor elke zaailing voor de opslag van de individuele tijd afbeelding serie bestanden.
- Archiveer de resulterende mappen in een gecomprimeerd ZIP-bestand.
Een code die deze stappen volbrengt is ontwikkeld met behulp van de programmeertaal Python 20. Het algoritme zorgt voor een reductie ongeveer 60% in gegevensgrootte en is succesvol in het identificeren alle individuele zaailingen in 90% van de scanner IMAGe bestanden dusver geanalyseerd. De codes zijn vrij beschikbaar voor download onder de GNU General Public License versie 3 (zie ook Materiaal tabel).
Figuur 1. Het scannen procedure begint met zaad planten (maximaal negen Arabidopsis zaden per plaat) en eindigt met dataopslag en beeldverwerking. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 2. T emplate voor de bouw van petrischaal ondersteuning. Ple xiglas werd zodanig gesneden dat de breedte past de flatbed (in dit geval 227 mm) en de lengte is 128 mm. Twee cirkels met een 88 mm werden uit de resterende stuk zodat zij gelijkmatig waren verdeeld over de breedte en lengte van de drager snijden. De steun werd aangebracht op de flatbed met 3M Command Strips. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 3. Scanner configuratie na zaailingen zijn gravistimulated en het deksel gepositioneerd. Dit is de configuratie van de scanner bij stap 1.21 van Scanner Setup and Image Collection."_blank"> Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 4. Screen shot van instellingen geselecteerd voor stap 1.8 van Scanner Setup and Image Collection. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 5. Screen shot van VueScan software tijdens de stappen 1.9 en 1.10 van Scanner Setup and Image Collection. Het rode vak benadrukt de omvang van de oogst, terwijl het blauwe vak belicht specifieke instellingen fo r x-en y offset gebruikt om zaailingen en labelinformatie vangen. De regio van de flatbed te scannen wordt weergegeven als een stippellijn in het voorbeeldgebied. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 6. Selectie van de doelmap voor stap 1.12 van Scanner Setup and Image Collection. Door op de @ knop naast het dialoogvenster Default Folder doos (rode pijl) kan de gebruiker naar de juiste bestemming map te selecteren. Klik hier voor grotere afbeelding .
re 7 "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50878/50878fig7highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50878/50878fig7.jpg "width =" 600px "/>
Figuur 7 (AD). Bovenstaande afbeeldingen zijn voorbeelden van die verzameld volgens de in dit document beschreven werkwijze. Panelen A, B en C, D zijn de eerste en laatste beelden respectievelijk een zoekperiode enkele. A, B tonen volledige gescande gebied, terwijl de C, D zijn een bijgesneden deel van het gescande gebied, met een enkele plaat. Verschillende inconsistenties kunnen worden waargenomen. Paneel A toont variatie in kieming en groei traject. Paneel B (dezelfde zaailingen als afbeelding A; 9 uur later) laat zien dat platen condensatie kan ophopen. Panelen C en D worden beschouwd als goede resultaten door robuuste groei o zijnf zaailingen en beeldkwaliteit over het gehele run. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 8. Het beeld compressie-algoritme ontwikkeld zet scanner beeld op schaal (top) grijs. Het beeld wordt verdeeld in rechter en linker helften en beeldranden verwijderd (niet getoond). De posities van de individuele zaailingen op elke helft worden geïdentificeerd door het vinden van de rij met de grootste totale pixelintensiteit. Die posities worden gebruikt om een nieuw gewas gebied, toegepast op alle zaailingen op de plaat (onder) te definiëren. Klik hier voor grotere afbeelding .
Discussion
Nauwkeurige fenotypische waarneming is cruciaal voor het begrijpen van de manifestaties van genfunctie in een organisme. Een manier om fenotypische informatie te verkrijgen is door het vastleggen van de beeldgegevens met een hoge resolutie. De-scanner gebaseerd platform ontwikkeld heeft verzameling van vele beelden (200 beelden / scan periode) ingeschakeld bij een hoge resolutie (4800 dpi) gedurende een aantal uren. Bovendien is dit platform gemakkelijk worden aangepast aan een verscheidenheid van laboratorium en klaslokaalmilieu vanwege de flexibiliteit van de VueScan software om duizenden verschillende scanners via een gemeenschappelijke interface 18 draaien.
De hier gepresenteerde methode vult een leegte in high-throughput beeldregistratie dat zich uitstrekt van grootschalige fenotypering installaties en geautomatiseerde systemen implementeerbaar in een laboratorium. De high-throughput platformen die momenteel beschikbaar zijn hebben de neiging om gespecialiseerde beeldvormende apparatuur, waaronder camera's gemonteerd op robot ondersteunt, om hoge-resolutie afbeeldingen van p vastleggenrimarily bovengronds plantenweefsel (bv. Centre for Integrative Plant Technology en de Scanalyzer HTS door LemnaTec) 20,21. Gespecialiseerde beeldvormende systemen met behulp van röntgen-en MRI-technieken zijn ook ontwikkeld om de afbeelding onder de grond weefsels met opmerkelijke resolutie als ze groeien in de bodem omgeving (bijv. Centre for Integrative Plant Technology) 11,22,23. De ontwikkeling van gespecialiseerde technieken algemeen ten koste van doorvoer, waardoor dynamische fenotypische studies bemoeilijkt. Belangrijk is dat de kosten en de behoefte aan infrastructuur voor deze high-end platforms maken ze meestal niet haalbaar voor implementatie in kleinere laboratoria.
Platforms zijn ook ontwikkeld die meer standaard image capture technologie en zijn goed geschikt voor het meten van dynamische reacties zoals de wortel reactie op een zwaartekracht stimulus. Bijvoorbeeld, zijn CCD-camera gebruikt om individuele zaailing antwoorden vangen licht en dichtheid bij hogeruimtelijke en temporele resolutie 1,8,12. Andere systemen zijn ontwikkeld waardoor de meting van de wortel tip oriëntatie van meerdere wortels uit een enkel beeld (bijvoorbeeld RootTipMulti door de iPlant Collaborative) 17,24. In het eerste geval wordt throughput relatief laag aangezien slechts een zaailing wordt afgebeeld door elke camera tegelijk, terwijl in het laatste geval debiet hoger, maar gewoonlijk ten koste van resolutie.
De procedure die in dit document stelt een platform voor het vastleggen van hoge-resolutie afbeeldingen in high throughput met apparatuur en software die direct beschikbaar en relatief betaalbaar zijn. Met behulp van deze opstelling, kan 1.080 individuele wortel reacties worden verzameld elke week in een laboratorium uitgerust met een bank van zes scanners. In 15 maanden verzamelen gemiddeld 864 individuele reacties per week, in totaal 41.625 zaailingen werden gescand voor genomics onderzoek. Ongeveer 15% van de individuele collecties mislukte vanwege een verkeerde instelling fout, netwrk storing of defect aan de apparatuur. Een andere respons van 22% niet te wijten aan gebrek aan kieming of onvoldoende wortelgroei een groei reactie uit te lokken. De uiteindelijke dataset bestaat uit 27.475 individuele zaailing antwoorden op een zwaartekracht stimulans van 163 recombinante inteeltlijnen plus 99 in de buurt van isogene lijnen. De gegevens werden verzameld in een laboratorium, waardoor dit een zeer high-throughput aanpak. Ook gezien het feit dat de voor overname apparatuur is relatief goedkoop, het is betrouwbaar gefunctioneerd meer dan twee jaar zelfs met zwaar gebruik.
Hoewel dit protocol zeer nuttig voor het onderzoek doelstellingen van deze groep is geweest, een aantal beperkingen bestaan nog steeds. Door het debiet van ongeveer 50 GB ongecomprimeerde beeldgegevens per dag, bleek dat een grote hoeveelheid ruimte nodig was om huis beelden tenzij effectieve compressie schema kunnen worden ontwikkeld. De opslag probleem werd tijdelijk opgelost door de aankoop van externe harde schijven voor elke computer. Bovendien, twee 10 TB netwerk verbonden opslag-apparaten werden aangeschaft. Later werden compressie algoritmen ontwikkeld, zoals hierboven beschreven, die kunnen helpen om de gegevensgrootte met maximaal 60% (figuur 8). Het is belangrijk op te merken dat de snelheid waarmee gegevens kunnen worden opgeslagen op een netwerk verbonden opslag apparaat is afhankelijk van de snelheid van de netwerkverbinding. Compressie schema zijn ook beperkt als gevolg van de wens om het verlies van beeldgegevens te voorkomen.
Andere beperkingen die specifiek zijn voor een-scanner gebaseerd imaging systeem worden ook overwogen. Bijvoorbeeld, in een scanner aanpak zaailingen worden blootgesteld aan licht van hoge intensiteit in het witte en mogelijk infrarode bereik tijdens elke scan. Dit beïnvloedt waarschijnlijk zaailingsgroei, maar zaailingen nog waarneembaar robuuste reacties ondergaan om een zwaartekracht stimulus (figuur 7). Een toekomstige verbetering zou inhouden programmering scanners zoals dat alleen infrarood LED's actief zijn. Een gebied in actieve development is creatie van algoritmes goed afgestemd op de resolutie en doorvoer van deze beeldgegevens. De grote dataset gegenereerd met behulp van deze-scanner gebaseerde methode is ideaal voor de ontwikkeling van robuuste gereedschappen voor high-throughput fenotypering van zaailing beelden geweest. De compressie-algoritme toegepast op de afbeeldingen weergegeven in figuur 7 ondersteunt de bewering dat ze vatbaar zijn voor beeldanalyse toepassingen. Bovendien kan de gegenereerde beelden worden geanalyseerd door de eerder gepubliceerde algoritme RootTrace 17,24, als ze verzameld op lagere resolutie (minder dan 1.200 dpi), en individuele zaailingen zijn gesegmenteerd uit het beeld met het compressiealgoritme hierboven beschreven voor de analyse. Wortelgroei gegevens kunnen worden geëxtraheerd uit beelden gereduceerd tot 1200 dpi, terwijl tip hoek van gegevens van afbeeldingen teruggebracht tot 900 dpi (niet gepubliceerde waarneming) kan worden gewonnen.
De procedure die in dit document past in zijn eigen niche in de wereld van de root beeldvorming doordat het hoge doorvoer en hoge resolutie en toch relatief betaalbaar. Een bijkomend voordeel van deze benadering is dat het gemakkelijk kan worden aangepast aan de beeldvorming behoeften van een bepaalde onderzoeksgroep tegemoet.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van de National Science Foundation (award aantal IOS-1031416) en is uitgevoerd in samenwerking met Nathan Miller, Logan Johnson en Edgar Spalding van de Universiteit van Wisconsin en Brian Bockelman, Carl Lundstedt en David Swanson van de Universiteit van Nebraska Holland Computing Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epson Perfection V700 Photo Scanners | Epson | B11B178011 | - |
| Plexiglas Scanner Template | - | - | Custom made. See Figure 2. |
| Smart Strap Bungee Cords | SmartStraps | Wal-Mart 1079478 | |
| Brinks Digital Outdoor Timers | Brinks | Wal-Mart 42-1014-2 | |
| VueScan Software | Hamrick Software | http://www.hamrick.com | |
| Segmentation Software | Chris Wentworth, Doane College | https://sites.google.com/a/doane.edu/compphy-doane/projects/root-gravitropism/image-segmentation | |
| 3M Micropore Tape | Fisher Scientific | 19-061-655 | - |
| Holding racks | - | - | Custom made by gluing two cookie racks together. |
References
- Miller, N. D., Brooks, T. L. D., Assadi, A. H., Spalding, E. P. Detection of a gravitropism phenotype in glutamate receptor-like 3.3 mutants of Arabidopsis thaliana using machine vision and computation. Genetics. 186, 585-593 (2010).
- Clack, N. G. Automated Tracking of Whiskers in Videos of Head Fixed Rodents. PLoS Comp. Biol. 8, (2012).
- Lussier, Y. A., Liu, Y. Computational approaches to phenotyping: high-throughput phenomics. Proc. Am. Thoracic Soc. 4, 18-25 (2007).
- Houle, D. Colloquium Paper: Numbering the hairs on our heads: The shared challenge and promise of phenomics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1793-1799 (2009).
- Elwell, A. L., Gronwall, D. S., Miller, N. D., Spalding, E. P., L, T. D. B. Separating parental environment from seed size effects on next generation growth and development in Arabidopsis. Plant Cell Env. 34, 291-301 (2011).
- Silk, W. K. Quantitative Descriptions of Development. Ann. Rev. Plant Physiol. 35, 479-518 (1984).
- Cronin, C. J., Feng, Z., Schafer, W. R. Automated imaging of C. elegans behavior. Methods Mol. Biol. 351, 241-251 (2006).
- Miller, N. D., Parks, B. M., Spalding, E. P. Computer-vision analysis of seedling responses to light and gravity. Plant J. 52, 374-381 (2007).
- Iyer-Pascuzzi, A. S. Imaging and Analysis Platform for Automatic Phenotyping and Trait Ranking of Plant Root Systems. Plant Physiol. 152, 1148-1157 (2010).
- Houle, D., Mezey, J., Galpern, P., Carter, A. Automated measurement of Drosophila wings. BMC Evol. Biol. 3, 25 (2003).
- Jahnke, S. Combined MRI-PET dissects dynamic changes in plant structures and functions. Plant J. 59, 634-644 (2009).
- Durham Brooks, T. L., Miller, N. D., Spalding, E. P. Plasticity of Arabidopsis Root Gravitropism throughout a Multidimensional Condition Space Quantified by Automated Image Analysis. Plant Physiol. 152, 206-216 (2010).
- Perrin, R. M. Gravity signal transduction in primary roots. Ann. Botany. 96, 737-743 (2005).
- Strohm, A. K., Baldwin, K. L., Masson, P. H. Molecular mechanisms of root gravity sensing and signal transduction. Dev. Biol. 1, 276-285 (2012).
- Harrison, B. R., Masson, P. H. ARL2, ARG1 and PIN3 define a gravity signal transduction pathway in root statocytes. Plant J. 53, 380-392 (2007).
- Beeckman, T. Root Development. , Wiley-Blackwell. 157-174 Forthcoming.
- French, A., Ubeda-Tomás, S., Holman, T. J., Bennett, M. J., Pridmore, T. High-throughput quantification of root growth using a novel image-analysis tool. Plant Physiol. 150, 1784-1795 (2009).
- Granier, C. PHENOPSIS, an automated platform for reproducible phenotyping of plant responses to soil water deficit in Arabidopsis thaliana permitted the identification of an accession with low sensitivity to soil water deficit. New Phytol. , 169-623 (2006).
- Walter, A. Dynamics of seedling growth acclimation towards altered light conditions can be quantified via GROWSCREEN: a setup and procedure designed for rapid optical phenotyping of different plant species. New Phytol. 174, 447-455 (2007).
- Gregory, P. J. Non-invasive imaging of roots with high resolution X-ray micro-tomography. Plant Soil. , 255-351 (2003).
- Pierret, A., Kirby, M., Moran, C. Simultaneous X-ray imaging of plant root growth and water uptake in thin-slab systems. Plant Soil. 255, 361-373 (2003).
- Naeem, A., French, A. P., Wells, D. M., Pridmore, T. P. High-throughput feature counting and measurement of roots. Bioinformatics. 27, 1337-1338 (2011).
