Summary
يصف هذا البروتوكول عملية لجمع السريع للصور لشتلات نبات الأرابيدوبسيس الاستجابة لحافز الجاذبية باستخدام الماسحات الضوئية المسطحة المتاحة تجاريا. يسمح أسلوب غير مكلفة، والقبض على ارتفاع حجم الصور عالية الدقة قابلة للتحليل الخوارزميات المصب.
Abstract
الجهود البحثية في علم الأحياء تتطلب بشكل متزايد استخدام المنهجيات التي تمكن مجموعة كبيرة الحجم من البيانات ذات الدقة العالية. وثمة تحد يمكن أن يواجه مختبرات هو تطوير وتحقيق هذه الأساليب. رصد الظواهر في عملية الاهتمام هو هدف نموذجي من مختبرات البحوث دراسة وظائف الجينات، وغالبا ما يتحقق ذلك من خلال التقاط الصور. عملية خاصة ان هو قابل للمراقبة باستخدام أساليب التصوير هو نمو التصحيحية من جذر الشتلة التي شردوا من المواءمة مع متجه الجاذبية. منصات التصوير المستخدمة لقياس استجابة gravitropic الجذرية يمكن أن تكون مكلفة، منخفضة نسبيا في الإنتاجية، و / أو كثيفة العمالة. وقد تم تناول هذه القضايا من خلال تطوير الإنتاجية العالية طريقة التقاط الصور باستخدام غير مكلفة، ولكن عالية الدقة، والماسحات الضوئية المسطحة. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن التقاط الصور كل بضع دقائق في 4،800 نقطة في البوصة. الإعداد الحالية يمكن جمع 216 ص الفرديةesponses يوميا. بيانات الصورة التي تم جمعها هو من نوعية وافرة لتطبيقات تحليل الصور.
Introduction
جمع البيانات المظهرية عالية الدقة مفيد في الدراسات التي تهدف إلى فهم التفاعل بين الوراثة والبيئة في التوسط العضوي وظيفة 1،2. دراسات من هذا النوع هي أيضا كبيرة بطبيعتها في نطاق واسع، مما يجعل من الضروري بالإضافة إلى أن الأساليب المستخدمة لقياس الظواهر في هذا السياق أن تكون عالية في الإنتاجية 3،4. في وضع أساليب البحث phenomics النطاق، المفاضلات بين الإنتاجية والقرار حيز اللعب. الأساليب التي هي أعلى في الإنتاجية تميل إلى أن تكون أقل في القرار، مما يجعل الأمر أكثر صعوبة للكشف عن آثار صغيرة من الوراثة أو البيئة 5. بدلا من ذلك، الأساليب التي تقيس أكثر بعناية النمط الظاهري المطلوب تميل إلى أن تكون أقل في الإنتاجية، مما يجعل من الصعب مسح التأثيرات الجينية والبيئية على نطاق واسع. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن الطرق اليدوية لقياس الظواهر، بما في ذلك التفتيش البصري، وتكون خاضعة للتغيير بسبب الاختلافات في نصيب الإنسانception 6.
يمكن توفير تقنيات التصوير جسر مفيدة بين الإنتاجية والقرار في الحصول على الملاحظات المظهري 7-9. بشكل عام، وهي صورة من السهل نسبيا لالتقاط، وتسهيل الإنتاجية، وعندما تؤخذ في القرار كافية، الظواهر خفية يمكن الكشف 1،2،7. تقنيات التصوير تميل إلى أن تكون قابلة للتعديل لتناسب نظام أو عملية والفائدة هي قابلة للتطوير بشكل عام 10-12. وبسبب هذا، تقنيات التصوير هي مثالية لتطوير الدراسات على نطاق واسع من وظيفة العضوي.
استجابة الجذر الأساسي لحافز خطورة هو عملية الفسيولوجية المعقدة التي تحدث داخل جهاز بسيط شكليا. ينطوي على استجابة تفعيل مسارات الإشارات التي تنتشر من خلال الجهاز الجذر ويتم تحديد التقدم من خلال العوامل البيئية والجينية، بما في ذلك العوامل الوراثية تتأثر البيئة 12-14 12،14،15. اكتساب فهم مفصل لديناميات هذا الرد مهم في إيجاد سبل لتحسين قدرة الشتلات لتصبح بنجاح المنشأة في بيئة معينة 16. بالإضافة إلى ذلك، شكل الجذر يجعل من قابلة لتطبيقات معالجة الصور 8،12،17. أخذت معا، واستجابة الجذر gravitropic هو النظام المثالي لتطوير تكنولوجيا التصوير عالية الإنتاجية لغرض إجراء دراسات على مستوى الجينوم من وظيفة العضوي.
في هذا التقرير، يتم تقديم الإنتاجية العالية، وارتفاع القرار، طريقة لالتقاط الصور من الاستجابة gravitropic الجذر باستخدام غير مكلفة، والماسحات الضوئية المسطحة المتاحة تجاريا. لمحة عامة عنويرد البروتوكول في الشكل 1. تمركزت الشتلات المزروعة على لوحات أجار على الماسحات الضوئية المسطحة الموجهة عموديا مزودة أصحاب زجاجي مخصص لوحة. وقد تم جمع الصور كل بضع دقائق على 4،800 نقطة في البوصة وحفظها على القرص المحلي أو ملقم البيانات. يتم تخزين البيانات الوصفية المرتبطة بها مع كل سلسلة صورة على قاعدة البيانات وتتم معالجة الصور المخزنة. النهج يستخدم البرنامج فويسكان لالتقاط الصور. فويسكان يمكن استخدامها لتشغيل أكثر من 2،100 الماسحات الضوئية المختلفة على ويندوز، ماك، أو أنظمة التشغيل لينكس (انظر الجدول مواد). تم استخدام الماسح الضوئي القرار من 4،800 نقطة في البوصة في هذا الطلب لتتناسب مع قرار المحرز في دراسات سابقة باستخدام الكاميرات CCD الثابتة 1،8،12. مرونة البرنامج فويسكان جنبا إلى جنب مع واجهة مشتركة لأنه يستخدم أي جهاز ماسح ضوئي تشغيله تسمح للمستخدمين اعتماد بسهولة تقريبا أي جهاز ماسح ضوئي من القرار كافية لبروتوكول المقدمة في هذه الورقة. الإنتاجية الحالية تسمح لجمع216 الاستجابات الفردية في اليوم الواحد. التكنولوجيا هي قابلة للتكيف وقابلة للاستخدام في المؤسسات بدءا من المدارس الثانوية والجامعات للبحث. وعلاوة على ذلك، فإن الصور التي تم جمعها هي من نوعية كافية لتطبيقات تحليل الصور.
Protocol
1. الصورة بروتوكول اقتناء
الاعتبارات:
يتم تنفيذ هذا البروتوكول الأكثر كفاءة مع شخصين، على الرغم من أنه من الممكن لأحد أن يعمل وحده. كان ترتيب أفضل عمل في هذا المختبر لشخص واحد لإعداد لوحات للمسح الضوئي في حين آخر يعمل على إعداد الماسح الضوئي، ثم كل من العمل معا لوضع لوحات في الماسحات الضوئية وبدء عملية المسح.
من المهم أيضا أن نلاحظ أن الماسحات الضوئية في هذا المشروع موجهة عموديا مع الأغطية الماسح الضوئي يستريح على الجزء الخلفي من الماسحة الضوئية. وقدم الدعم المخصص لعقد الأطباق في هذا الوضع الرأسي وكان الملصقة على سطح مسطحة مع شرائط 3M قيادة (الشكل 2). وقد اصطف غطاء الوثيقة القابلة للنقل التي تأتي مع الماسحة الضوئية المستخدمة في هذا البروتوكول (إبسون V700) على جانب واحد مع شعر أسود. تم وضع غطاء ثيقة ضد مسطحة مع الحبل بنجي لتعقد لوحات في مكان وتوفير تباين الصورة (الشكل 3).
ويمكن استخدام أي جهاز ماسح ضوئي من القرار كافية لالتقاط الصورة. تم اختيار الكمال V700 إبسون بسبب صورتها مربع (مما يجعل من السهل وضع عموديا)، وارتفاع القرار، وخيارات إضافية لفحص من كل من السرير والغطاء واستخدام قناة الأشعة تحت الحمراء. لم تستخدم هذه الخيارات الإضافية في هذا البروتوكول.
مرة واحدة تم إزالة لوحات من غرفة النمو، لا بد أن البروتوكول تستمر حتى النهاية.
إعداد لوحة
واستخدمت أطباق بتري تحتوي على 10 مل القياسية من وسط شفاف و 9 بذور زرعت في منتصف كل لوحة. إجراءات لوضع العلامات لوحة، وإعداد وسائل الاعلام وزراعة ويمكن الاطلاع على: http://www.doane.edu/doane-phytomorph
- تطبيق تريتون X-100 (المنظفات) لغطاء مع Kimwipe - تكون سخية.
(لاحظ أن تريتون X-100 يساعد على منع تراكم التكثيف على الغطاء كما يتم فحص اللوحة. سوف تطبيق سخية (ما يكفي لخلق الفيلم على سطح الغطاء) مساعدة في التأكد من أن غطاء شفاف يبقى في جميع أنحاء تشغيل الماسح الضوئي بأكمله .) - التفاف لوحة مع الشريط من micropore لتأمين الغطاء، والسماح للتهوية.
إعداد الماسح الضوئي وجمع صورة
يفترض هذا البروتوكول أن أكثر من 1 الماسح الضوئي الذي يتم استخدامه، ويقدم الإرشادات للبدء الماسحات الضوئية متعددة من جهاز كمبيوتر واحد.
- إنشاء مجلدات لتخزين الصور من الماسح الضوئي كل. سيكون لكل الماسح الضوئي عقد اثنين من لوحات، لذلك تضع ذلك في الاعتبار عند إنشاء المجلدات. واحدقد تختار لاستخدام البيانات الوصفية كمكونات من اسم الملف مثل معرفات فريدة لكل لوحة، والشتلات الأعمار، وحجم البذور، ومعرفات الأسهم المزروعة. مثال على اسم مجلد المستخدمة في جمع البيانات التي تحتوي على هذه البيانات الوصفية هو "1652-2-SM-9-92-17-1653-2-LG-88-79-161".
- ضبط توقيت منفذا لجمع الوقت المعين (تم استخدام 9 ساعة في هذا المختبر). تأكد من تعيين الوقت الاضافي (ساعة أو نحو ذلك) لإعداد.
(لاحظ أن الماسحات الضوئية ينبغي موصول توقيت منفذ من أجل تعيين اكتساب الوقت. في حين أن البرمجيات فويسكان يسمح للمستخدم لجمع الصور مرارا وتكرارا، أنها لا تسمح للمستخدم للإشارة إلى كيفية العديد من الصور لجمع أو كم من الوقت لجمع الصور ل .) - تشغيل الماسح الضوئي الأولى وانتظر حوالي 10 ثانية لالماسح الضوئي من خلال الذهاب الى ديتين الأولي من العام.
- فتح البرنامج فويسكان مرة واحدة. تم استخدام برنامج VueScan 9.0.20 الإصدار في هذا البروتوكول (انظر الجدول مواد)، على الرغم من الإصدارات الأحدث يمكن استخدامها مع modific قليلاأوجه. تأكد من تم الضغط على زر "المزيد" في لوحة السفلي من واجهة المستخدم من أجل عرض الخيارات القائمة الموضحة أدناه.
- تعيين تكرار السيارات: المنسدلة مربع مقابل لا شيء ضمن علامة التبويب المدخلات وتحت علامة التبويب المحاصيل تعيين منطقة المعاينة: إلى الحد الأقصى (الشكل 4). اضغط على "معاينة".
- إنشاء مربع المحاصيل التي من شأنها التقاط المنطقة ذات الاهتمام باستخدام الماوس للنقر وسحب جميع أنحاء المنطقة من الفائدة على صورة المعاينة. يجوز تغيير إعدادات المنطقة من الاهتمام في علامة التبويب المحاصيل. كانت الإعدادات النموذجية المستخدمة في مربع المحاصيل: إزاحة س 0.675؛ 1.924 في، على الرغم من هذا تم تعديل لالتقاط منطقة الشتلات لكل الماسح الضوئي لموازنة ذ. كان حجم مربع المحاصيل المستخدمة في 7.246 اسعة بنسبة 1.1 في طويل القامة (الشكل 5).
- لنقل مربع المحاصيل، والاستمرار على مفتاح التحول أثناء سحب مع الماوس. تأكد يحتوي على مربع المحاصيل جميع الشتلات التي يتم مسحها ضوئيا بالإضافة إلى أي بيانات التعريف المطلوب الذي يمكن أن يرد على تسمية (الشكل 5).
- تحت علامة التبويب المحاصيل، وتعيين ناحية معاينة: لمربع المحاصيل و'معاينة' برس.
- انتقل إلى علامة التبويب الإخراج وحدد الملف الصحيح لالماسح الضوئي (الشكل 5).
- كرر الخطوات 1،7-1،12 على جميع الماسحات الضوئية لجهاز كمبيوتر واحد. اختيار "نعم" عندما سئل عما إذا كان الخيار لفتح أكثر من مثيل واحد من برنامج VueScan.
- تذهب من خلال كل علامة تبويب والتحقق من صحة الإعدادات. (لاحظ أن جميع المواصفات ويمكن تعديلها لتناسب احتياجات مختبر الفردية بما في ذلك لون الصورة، القرار، الخ. ومع ذلك، فإن الإعدادات المستخدمة في هذا البروتوكول يمكن تطبيقها مباشرة إلى السلطة الفلسطينيةrticular مسح الجهاز من مختبر معين بسبب واجهة مشتركة من البرنامج فويسكان. الرجوع إلى قائمة المواصفات المرفقة لعرض المعايير المستخدمة في هذا المشروع، وذلك باستخدام برنامج VueScan 9.0.20 نسخة).
- ضمن علامة التبويب إدخال اختيار مستمر في تكرار السيارات: الحقل، أو اختيار فترة زمنية أطول بين الصور اذا شئت. الفاصل الزمني هو طول الوقت مؤقتا الماسح الضوئي بعد حفظ الصورة الأخيرة وبدأت مجموعة من الصورة التالية. في الوضع المستمر، ويمكن الحصول على 3-4 دقائق قرار في 4،800 نقطة في البوصة.
- كرر الخطوات 1،14-1،15 لبقية الماسحات الضوئية المتصلة جهاز كمبيوتر واحد.
- المكان المعد لوحات في الماسحات الضوئية الصحيح مع الشتلات الموجهة أفقيا (لا gravistimulate).
- وضع مؤقتا سوداء، ورأى الخلفية ضد وحات حتى لا تسقط من القالب زجاجي. تكرار المسح الضوئي لجميعشركاهم.
(ملاحظة: في هذا المشروع، كانت تعلق قطعة من اللباد الأسود ليغطي قدمت وثيقة مع أجهزة لمنع الوهج وتوفير النقيض ضد أنسجة الجذر لون الخلفية المحددة المستخدمة سيعتمد على لون الأنسجة التي يجري تصويرها). - لديها شخص واحد يتحول لوحات 90 درجة (عكس اتجاه عقارب الساعة لوحات تحولت في هذا البروتوكول) وعلى الفور استبدال الخلفية شعر.
- الشخص الآخر ينبغي أن يقف على الكمبيوتر بحيث يمكن الضغط على زر "مسح" على الفور.
- تأمين الخلفية لالماسح الضوئي مع الحبل بنجي (الشكل 3). لديهم شخص واحد عقد الخلفية في المكان في حين المناصب أخرى الحبل بنجي.
(ملاحظة: مباشرة بعد gravistimulation (دوران بنسبة 90 ° لوحات) ووضع الخلفية اللباد، "المسح الضوئي" ينبغي الضغط). - كرر الخطوات 1،17-1،21 لبقية الماسحات الضوئية على حاسوب واحدإيه.
- كرر الخطوات 1،6-1،22 للمجموعة التالية من الماسحات الضوئية وجدت.
- لا تترك الماسحات الضوئية حتى تم جمع العديد من الصور للتأكد من أنها تقوم بحفظ بشكل صحيح.
- وهو مثالي للحفاظ على الماسحات الضوئية في المنطقة التي سوف تكون خالية من الاضطرابات للمرة مسح المعينة. بل هو أيضا من الحكمة للنظر في الظروف البيئية في منطقة المسح الضوئي لضمان الاستجابات المظهرية المثالي.
- عند جمع البيانات كاملة، اضغط على الزر الأخضر على إحباط كل نافذة فويسكان التي تتزامن مع بعضها الماسح الضوئي.
- إغلاق الخروج من كافة البرامج على الكمبيوتر.
- إعادة تشغيل الكمبيوتر واغلاق كل من الماسحات الضوئية قبل بدء جولة أخرى من جمع الصور.
Representative Results
صور ممثل
هذا النهج يتيح إنتاج السريع لعالية الدقة سلسلة زمنية من نبات الأرابيدوبسيس نمو البادرات. وتظهر الصور الأولى والأخيرة من شوط الماسح الضوئي في أرقام 7A و7B. أرقام 7C و 7D تظهر النتائج المثلى من نصف صورة الماسح الضوئي الكامل. يتم عرض بعض القضايا التي يمكن أن تؤثر على جودة الصورة في أرقام 7A و7B. وتشمل هذه القضايا الاختلاف في الإنبات، والتباين في مسار نمو البادرات في بداية الشوط، وتراكم التكثيف خلال المسح. يمكن إلى حد كبير التكثيف يمكن حلها عن طريق زيادة كمية تريتون X-100 تطبيقها على الداخل من لوحة الغطاء. العوامل الأخرى التي يمكن أن تمنع دقيقة جمع الصور هي التكوين غير صحيح من مربع المحاصيل فيما يتعلق الموقف وتحديد المواقع لوحة لوحات بحيث يتم منحرفة فيما يتعلق مربع المحاصيل.
تحليل صورة التطبيق: ضغط الصور
مرة واحدة تم الحصول على تسلسل زمني للصور الماسح الضوئي، ويجب تخزينها بشكل آمن بطريقة الشبكة الوصول إليها لتسهيل تحليل الصور. ملفات الصور المرتبطة المدى الماسح الضوئي الفردية تحتل كمية كبيرة من مساحة القرص الصلب. ملف TIFF واحدة جمعها في 4،800 نقطة في البوصة حوالي 220 MB وتشغيل الماسح الضوئي نموذجي يولد 200 ملفات الصور. وبالتالي، مطلوب حوالي 44 غيغابايت من مساحة القرص الصلب في التشغيل. للحد من تكاليف التخزين ونقل البيانات في الشبكات المرتبطة مع تحليل الصور من المستحسن أن يتم تقليل كمية المساحة اللازمة لتخزين بيانات الصورة بينما في الوقت نفسه التقليل من فقدان البيانات. وسوف تشمل تحليل المصب تحديد كل البادرات في ملفات الصور اللاحقة المرتبطة تشغيل تجريبي. وبالتالي، بتجزئة من الشتلات واحد من الصورة الماسح الضوئي يمكن أن تسهل تحليل المصب. لأن تجزئة من الشتلات بعيدا عن بقية من اليمكن الصورة الإلكترونية أيضا تقلل إلى حد كبير من التخزين غير الضرورية بكسل الخلفية، ويؤدي هذا النهج أيضا إلى خفض كبير في حجم البيانات. وعلاوة على ذلك، إذا تم تحليل المصب ركزت على أنسجة الجذر فإنه قد لا يكون من الضروري الاحتفاظ بالمعلومات اللون منذ بكسل الجذر ضيقة نسبيا في الفضاء لونها. وقد تم وضع بروتوكول معالجة الصور الكمبيوتر ورمز لتقليل حجم البيانات من قبل كل من بتجزئة الشتلات الفردية وتحويل الصور إلى اللون الرمادي الحجم. النتائج النهج في تخفيض 60٪ في متطلبات مساحة التخزين.
يوصف سير العمل المستخدمة لتحقيق هذا ضغط البيانات في الخطوات التالية:
- تبدأ سلسلة زمنية من ملفات الصور الماسح الضوئي في مجلد واحد.
- لكل صورة، وتحويل من RGB إلى رمادي مقياس (الشكل 8، أعلى).
- تقسيم الصورة إلى الجانبين الأيسر والأيمن.
- استخراج كل الشتلات من الصورة في ملف خاص بها (الشكل 8).يتم ذلك عن طريق تطبيق عتبة لتحويل بكسل إلى الأسود أو الأبيض ثم حساب مجموع كثافة بكسل من كل صف الصورة. يتم التعرف على التوالي وفقا لأعلى كثافة ويتم تصنيف كل بكسل باسم 'محطة' أو 'nonplant' استنادا إلى شدة جيرانها. تم العثور على مركز كل "محطة" ضمن هذا الصف، ومن هذه النقطة يتم رسم مربع المحاصيل ذات حجم محدد سلفا (الشكل 8، أسفل).
- إنشاء مجلد منفصل لكل جانب من الصورة (اليسار واليمين) مع المجلدات الفرعية منفصلة لكل الشتلات لتخزين الملفات الفردية الوقت سلسلة الصورة.
- أرشفة المجلدات الناتجة في ملف مضغوط ZIP.
وقد تم وضع التعليمات البرمجية التي تنجز هذه الخطوات باستخدام لغة البرمجة بايثون 20. خوارزمية يسمح للحد من حوالي 60٪ في حجم البيانات وناجحا في جميع الشتلات في تحديد الفردية في 90٪ من ايماج الماسح الضوئيملفات البريد تحليلها حتى الآن. هي رموز متاحة بحرية للتحميل تحت رخصة جنو العمومية الإصدار 3 (انظر الجدول مواد).
الشكل 1. يبدأ الإجراء المسح مع زراعة البذور (ما يصل الى تسعة بذور نبات الأرابيدوبسيس في لوحة) وينتهي مع تخزين البيانات ومعالجة الصور. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 2. emplate T لبناء بيتري الدعم الطبق. التنوير القائل وقطعت xiglas مثل أن عرض تناسب مسطحة (في هذه الحالة 227 ملم) وكان طول 128 ملم. قطعت دائرتين مع 88 مم من قطعة المتبقية بحيث وزعت بالتساوي على طول عرض وطول الدعم. تم اضافته الدعم للشرائح مسطحة مع 3M الأوامر. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الرقم 3. تكوين الماسح الضوئي بعد أن تم gravistimulated الشتلات وغطاء المستندات وضعه، وهذا هو التكوين من الماسح الضوئي في خطوة 1.21 من الإعداد الماسح الضوئي وجمع صورة."_blank"> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 4. تسديدة من شاشة الإعدادات المحددة للخطوة 1.8 من الإعداد الماسح الضوئي وجمع صورة. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الرقم 5. لقطة الشاشة من البرامج فويسكان خلال الخطوات 1.9 و 1.10 من الإعداد الماسح الضوئي وجمع صورة. يبرز مربع أحمر حجم المحاصيل في حين يسلط الضوء على المربع الأزرق إعدادات محددة لل ص خ وتستخدم من أجل القبض على الشتلات والمعلومات تسمية تعويض ذ. ويرد منطقة مسطحة ليتم فحصها كخط منقط في منطقة المعاينة. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الرقم 6. اختيار المجلد الوجهة للخطوة 1.12 من الإعداد الماسح الضوئي وجمع صورة. الضغط على زر @ المقبل إلى مربع الحوار المجلد الافتراضي (السهم الأحمر) تسمح للمستخدم لتحديد المجلد الوجهة المناسبة. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
إعادة 7 "FO: محتوى العرض =" 5IN "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50878/50878fig7highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/50878/50878fig7.jpg "العرض =" 600px ل"/>
الرقم 7 (م). الصور أعلاه هي أمثلة على تلك التي تم جمعها باستخدام الطريقة الموصوفة في هذه الورقة. وحات A و B و C، D هي الصور الأولى والأخيرة، على التوالي، من فترة المسح واحد. A، B تظهر كامل المنطقة الممسوحة ضوئيا، في حين C، D هي المنطقة المزروعة من المنطقة الممسوحة ضوئيا، مما يدل على لوحة واحدة. ويمكن ملاحظة العديد من التناقضات. لوحة ويظهر التباين في الإنبات والنمو في مسار. لوحة B (نفس الشتلات كما صورة A؛ في وقت لاحق 9 ساعة) يدل على أن لوحات يمكن أن تتراكم التكثيف. تعتبر لوحات جيم ودال أن تكون النتائج جيدة نظرا لقوة نمو سو الشتلات وجودة الصورة طوال الفترة السابقة. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الرقم 8. خوارزمية ضغط الصور طورت تحويل صورة الماسح الضوئي إلى اللون الرمادي على نطاق و(أعلى). وتنقسم الصورة الى نصفين الأيمن والأيسر ويتم إزالة حدود الصورة (لا يظهر). ويتم تحديد مواقف الشتلات الفردية على كل شوط من خلال إيجاد صف واحد مع أكبر كثافة مجموع بكسل. وتستخدم تلك المواقف لتحديد المساحة المحصولية الجديدة، تطبق على جميع الشتلات على لوحة (القاع). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
Discussion
الملاحظة المظهرية دقيقة أمر حاسم لفهم مظاهر وظيفة الجينات داخل الكائن الحي. طريقة واحدة للحصول على المعلومات المظهري من خلال الاستيلاء على بيانات الصور عالية الدقة. منصة القائمة على الماسح الضوئي المتقدمة مكنت من جمع العديد من الصور (200 صورة / فترة المسح الضوئي) في عالية الدقة (4،800 نقطة في البوصة) على مدى عدة ساعات. بالإضافة إلى ذلك، هذا المنبر وتتكيف بسهولة مع مجموعة متنوعة من بيئات مختبر والفصول الدراسية نظرا لمرونة البرنامج برنامج VueScan لتشغيل الآلاف من الماسحات الضوئية مختلفة باستخدام واجهة مشتركة 18.
طريقة المقدمة هنا يملأ فراغا في الإنتاجية العالية التقاط الصور التي تمتد من مرافق phenotyping على نطاق واسع والنظم الآلية للتنفيذ في مختبر واحد. منصات عالية الإنتاجية المتاحة حاليا تميل إلى استخدام أجهزة التصوير المتخصصة، بما في ذلك الكاميرات التي شنت على الدعم الروبوتية، لالتقاط صور عالية الدقة من عrimarily أعلاه الأنسجة النباتية البرية (مثل مركز النبات التكاملية التكنولوجيا وScanalyzer HTS بواسطة LemnaTec) 20،21. كما تم أيضا تطوير نظم التصوير المتخصصة باستخدام الأشعة السينية وتقنيات التصوير بالرنين المغناطيسي لالصورة أدناه الأنسجة الأرض لقرار ملحوظا، حيث أنها تنمو في بيئة التربة (مثل مركز النبات التكاملية التكنولوجيا) 11،22،23. هذا التطور من التكنولوجيا أكثر تخصصا بشكل عام على حساب الإنتاجية، مما يجعل الدراسات المظهري ديناميكية أكثر صعوبة. الأهم من ذلك أن الاحتياجات من حيث التكلفة والبنية التحتية لهذه المنصات الراقية جعلها في معظمها غير مجدية لتنفيذها في مختبرات أصغر.
كما وضعت منصات التي تستخدم أكثر القياسية التقاط الصور التكنولوجيا ومناسبة تماما لقياس الاستجابات الحيوية مثل استجابة الجذر إلى التحفيز الجاذبية. على سبيل المثال، استخدمت الكاميرات CCD لالتقاط ردود الشتلات الفردية للضوء والجاذبية في ارتفاعالمكانية والزمانية القرار 1،8،12. وقد تم تطوير أنظمة أخرى تسمح بقياس التوجه طرف الجذرية للجذور متعددة من صورة واحدة (على سبيل المثال RootTipMulti من قبل iPlant التعاونية) 17،24. في الحالة الأولى، ومنخفضة نسبيا نظرا الإنتاجية التي الشتلات واحد فقط هو تصويرها من قبل كل كاميرا في وقت واحد، في حين أنه في الحالة الأخيرة إنتاجية أعلى، ولكن عموما على حساب القرار.
الإجراء المذكورة في هذه الورقة يقدم منبرا لالتقاط صور عالية الدقة في إنتاجية عالية مع المعدات والبرمجيات التي تتوافر بسهولة وبأسعار معقولة نسبيا. باستخدام هذا الإعداد، 1،080 الاستجابات الفردية الجذرية يمكن جمع كل أسبوع في مختبر واحد مجهزة البنك من ستة الماسحات الضوئية. في 15 شهرا من جمع ما معدله 864 الاستجابات الفردية في الأسبوع، تم مسحها ما مجموعه 41،625 شتلة لدراسة علم الجينوم. حوالي 15٪ من المجموعات الفردية فشلت بسبب خطأ في الإعداد، الشبكاتفشل كايزرسلوترن أو عطب في المعدات. فشل 22٪ استجابات أخرى بسبب نقص إنبات أو نمو الجذور غير كافية لاستثارة رد فعل النمو. مجموعة البيانات النهائية يتكون من 27475 الردود الشتلات الفردية لحافز الجاذبية من 163 السلالات المؤتلف زائد 99 خطوط إسوي القريب. وقد تم جمع البيانات في مختبر واحد، مما يجعل هذا النهج جدا عالية الإنتاجية. حتى بالنظر إلى أن المعدات المستخدمة لاكتساب غير مكلفة نسبيا، وتعمل ذلك بشكل موثوق لأكثر من عامين حتى مع الاستخدام الكثيف.
بينما كان هذا البروتوكول مفيدة جدا للأهداف البحثية من هذه المجموعة، بعض القيود لا تزال موجودة. بسبب الإنتاجية من نحو 50 غيغابايت من البيانات غير المضغوطة صورة في اليوم الواحد، كان من الواضح أن هناك حاجة إلى كمية كبيرة من مساحة المنزل إلى صور ما لم يمكن وضع خطط ضغط فعالة. تم حل مشكلة التخزين مؤقتا من خلال شراء محركات الأقراص الصلبة الخارجية لكل كمبيوتر. بالإضافة إلى ذلك، اثنين من 1تم شراء أجهزة التخزين المرتبطة الشبكة 0 السل. في وقت لاحق، تم تطوير خوارزميات الضغط، كما هو موضح أعلاه، والتي يمكن أن تساعد في تقليل حجم البيانات بنسبة تصل إلى 60٪ (الشكل 8). من المهم أن نلاحظ أن السرعة التي يمكن حفظ البيانات إلى الشبكة المرتبطة جهاز تخزين يعتمد على سرعة الاتصال بالشبكة. كما تم تقييد أنظمة الضغط بسبب الرغبة في منع فقدان بيانات الصورة.
ويجري أيضا تعتبر قيود أخرى محددة لنظام التصوير القائم على الماسح الضوئي. على سبيل المثال، معرضون في النهج القائم على الماسح الضوئي الشتلات إلى ارتفاع شدة الضوء في نطاقات الأشعة تحت الحمراء البيضاء ويحتمل أن تكون خلال كل فحص. هذا من المرجح يؤثر على نمو البادرات، على الرغم من الشتلات لا يزال من الممكن للخضوع لاحظ استجابات قوية لحافز الجاذبية (الشكل 7). تحسن في المستقبل قد تشمل البرمجة الماسحات الضوئية بحيث المصابيح الحمراء فقط هي النشطة. منطقة نشطة في التنر هو خلق خوارزميات التحليل مطابقة تماما لهذا القرار ومرت من هذه البيانات الصورة. وكانت مجموعة كبيرة من البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام هذا الأسلوب القائم على الماسح الضوئي مثالية لتطوير أدوات قوية لعالية الإنتاجية phenotyping من الصور الشتلات. خوارزمية ضغط يعملون على هذه الصور هو مبين في الشكل 7 يدعم الادعاء بأنهم قابلة للتطبيقات تحليل الصور. علاوة على ذلك، الصور الناتجة يمكن تحليلها بواسطة خوارزمية المنشورة سابقا، RootTrace 17،24، إن جمعت في دقة أقل (أقل من 1،200 نقطة في البوصة)، وتتم تجزئة الشتلات الفردية من الصورة باستخدام خوارزمية ضغط المذكورة أعلاه قبل التحليل. ويمكن استخراج البيانات نمو الجذور من الصور خفضت إلى 1،200 نقطة في البوصة في حين يمكن استخراج البيانات زاوية غيض من الصور خفضت إلى 900 نقطة في البوصة (المراقبة غير منشورة).
الإجراء المذكورة في هذه الورقة يلائم مكانته الخاصة في عالم رور التصوير في أنه من إنتاجية عالية ودقة عالية في حين لا تزال معقولة نسبيا. فائدة إضافية لهذا النهج هو أنه يمكن بسهولة أن تكون مخصصة لتلبية احتياجات التصوير من مجموعة أبحاث خاصة.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من خلال منحة من مؤسسة العلوم الوطنية (الجائزة عدد IOS-1031416) وأجريت بالتعاون مع ناثان ميلر، لوغان جونسون وإدغار سبالدينج من جامعة ويسكونسن وبريان Bockelman، كارل Lundstedt وديفيد سوانسون من مركز جامعة نبراسكا في هولندا الحاسبات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epson Perfection V700 Photo Scanners | Epson | B11B178011 | - |
| Plexiglas Scanner Template | - | - | Custom made. See Figure 2. |
| Smart Strap Bungee Cords | SmartStraps | Wal-Mart 1079478 | |
| Brinks Digital Outdoor Timers | Brinks | Wal-Mart 42-1014-2 | |
| VueScan Software | Hamrick Software | http://www.hamrick.com | |
| Segmentation Software | Chris Wentworth, Doane College | https://sites.google.com/a/doane.edu/compphy-doane/projects/root-gravitropism/image-segmentation | |
| 3M Micropore Tape | Fisher Scientific | 19-061-655 | - |
| Holding racks | - | - | Custom made by gluing two cookie racks together. |
References
- Miller, N. D., Brooks, T. L. D., Assadi, A. H., Spalding, E. P. Detection of a gravitropism phenotype in glutamate receptor-like 3.3 mutants of Arabidopsis thaliana using machine vision and computation. Genetics. 186, 585-593 (2010).
- Clack, N. G. Automated Tracking of Whiskers in Videos of Head Fixed Rodents. PLoS Comp. Biol. 8, (2012).
- Lussier, Y. A., Liu, Y. Computational approaches to phenotyping: high-throughput phenomics. Proc. Am. Thoracic Soc. 4, 18-25 (2007).
- Houle, D. Colloquium Paper: Numbering the hairs on our heads: The shared challenge and promise of phenomics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1793-1799 (2009).
- Elwell, A. L., Gronwall, D. S., Miller, N. D., Spalding, E. P., L, T. D. B. Separating parental environment from seed size effects on next generation growth and development in Arabidopsis. Plant Cell Env. 34, 291-301 (2011).
- Silk, W. K. Quantitative Descriptions of Development. Ann. Rev. Plant Physiol. 35, 479-518 (1984).
- Cronin, C. J., Feng, Z., Schafer, W. R. Automated imaging of C. elegans behavior. Methods Mol. Biol. 351, 241-251 (2006).
- Miller, N. D., Parks, B. M., Spalding, E. P. Computer-vision analysis of seedling responses to light and gravity. Plant J. 52, 374-381 (2007).
- Iyer-Pascuzzi, A. S. Imaging and Analysis Platform for Automatic Phenotyping and Trait Ranking of Plant Root Systems. Plant Physiol. 152, 1148-1157 (2010).
- Houle, D., Mezey, J., Galpern, P., Carter, A. Automated measurement of Drosophila wings. BMC Evol. Biol. 3, 25 (2003).
- Jahnke, S. Combined MRI-PET dissects dynamic changes in plant structures and functions. Plant J. 59, 634-644 (2009).
- Durham Brooks, T. L., Miller, N. D., Spalding, E. P. Plasticity of Arabidopsis Root Gravitropism throughout a Multidimensional Condition Space Quantified by Automated Image Analysis. Plant Physiol. 152, 206-216 (2010).
- Perrin, R. M. Gravity signal transduction in primary roots. Ann. Botany. 96, 737-743 (2005).
- Strohm, A. K., Baldwin, K. L., Masson, P. H. Molecular mechanisms of root gravity sensing and signal transduction. Dev. Biol. 1, 276-285 (2012).
- Harrison, B. R., Masson, P. H. ARL2, ARG1 and PIN3 define a gravity signal transduction pathway in root statocytes. Plant J. 53, 380-392 (2007).
- Beeckman, T. Root Development. , Wiley-Blackwell. 157-174 Forthcoming.
- French, A., Ubeda-Tomás, S., Holman, T. J., Bennett, M. J., Pridmore, T. High-throughput quantification of root growth using a novel image-analysis tool. Plant Physiol. 150, 1784-1795 (2009).
- Granier, C. PHENOPSIS, an automated platform for reproducible phenotyping of plant responses to soil water deficit in Arabidopsis thaliana permitted the identification of an accession with low sensitivity to soil water deficit. New Phytol. , 169-623 (2006).
- Walter, A. Dynamics of seedling growth acclimation towards altered light conditions can be quantified via GROWSCREEN: a setup and procedure designed for rapid optical phenotyping of different plant species. New Phytol. 174, 447-455 (2007).
- Gregory, P. J. Non-invasive imaging of roots with high resolution X-ray micro-tomography. Plant Soil. , 255-351 (2003).
- Pierret, A., Kirby, M., Moran, C. Simultaneous X-ray imaging of plant root growth and water uptake in thin-slab systems. Plant Soil. 255, 361-373 (2003).
- Naeem, A., French, A. P., Wells, D. M., Pridmore, T. P. High-throughput feature counting and measurement of roots. Bioinformatics. 27, 1337-1338 (2011).
