Summary
Blandning är en effektiv metod för att generera biomaterial med ett brett utbud av fastigheter och kombinerade funktioner. Genom att förutsäga de molekylära interaktioner mellan olika naturliga silkesproteiner kan nya silk-silke protein legering plattformar med avstämbara mekanisk elasticitet, elektriska svaret, optisk transparens, kemiskt bearbetbarhet, nedbrytbarhet, eller termisk stabilitet utformas.
Abstract
Fibrer proteiner visa olika sekvenser och strukturer som har använts för olika tillämpningar inom biomedicinska områden som biosensorer, nanomedicin, vävnadsregenerering, och drug delivery. Utforma material baserade på molekylär skala interaktioner mellan dessa proteiner kommer att bidra till att skapa nya multifunktionella protein legering biomaterial med sökbara egenskaper. Sådana legeringsmaterialsystem ger också fördelar i jämförelse med traditionella syntetiska polymerer på grund av det material av biologisk nedbrytbarhet, biokompatibilitet, och hållbarheten i kroppen. Denna artikel använde protein blandningar av vilda tussah (Antheraea pernyi) och inhemsk mullbärssilke (Bombyx mori) som ett exempel för att ge användbara protokoll rörande dessa frågor, bland annat hur man kan förutsäga protein-proteininteraktioner med beräkningsmetoder, hur man producerar proteinlegering lösningar, hur man verifiera legeringssystem genom termisk analys, och hur man tillverka material variabla legeringinklusive optiska material med diffraktionsgitter, elektriska material med kretsar beläggningar och farmaceutiska material för läkemedelsdosering och leverans. Dessa metoder kan ge viktig information för att utforma nästa generations multifunktionella biomaterial baserade på olika protein legeringar.
Introduction
Naturen har skapat strategier för att generera avstämbara och multifunktionella biologiska matriser med hjälp av ett begränsat antal strukturella proteiner. Till exempel är elastiner och kollagener används alltid tillsammans in vivo för att ge de justerbara styrkor och funktioner som krävs för specifika vävnader 1,2. Nyckeln till denna strategi är att blanda. Blandning innebär blandnings proteiner med specifika förhållanden och är en teknisk strategi för att generera enkla materialsystem med avstämbara och varierande egenskaper 3-5. Jämfört med syntetiska ingenjörsstrategier 6,7, kan blanda också förbättra material enhetlighet och förmågan att bearbeta materialet på grund av enkel användning 8-16. Därför designa multifunktionella, biokompatibla proteinlegeringsmaterial är ett framväxande område med medicinsk forskning. Tekniken kommer också att ge systematisk kunskap om effekterna av naturliga protein matriser på cell och vävnads fungerar både i vitro och in vivo 10,17. Genom att optimera molekylära gränssnitt mellan olika proteiner, kan proteinbaserade legeringsmaterial omfattar en rad fysiska funktioner, såsom termisk stabilitet vid olika temperaturer, elasticitet för att stödja olika vävnader, elektriska känslighet i rörliga organ, och optiska egenskaper för hornhinnan vävnadsregenerering 3, 18-27. Resultatet av dessa studier kommer att ge en ny proteinmaterial plattform inom området biomedicinsk vetenskap med direkt relevans för avstämbara vävnads reparationer och sjukdomsbehandlingar och vidare leda till biologiskt nedbrytbara implantatanordningar där deras nya terapeutiska och diagnostiska funktioner kan tänkas 3.
Många naturliga strukturella proteiner har kritiska fysiska och bioaktiva egenskaper som kan utnyttjas som kandidater för biomaterial matriser. Silks från olika snäckarter, keratiner från hår och ull, elastiner och gener från olika vävnader, ocholika växtproteiner är några av de vanligaste strukturella proteiner som används för att utforma rörliga proteinbaserade material (Figur 1) 18-27. I allmänhet kan dessa proteiner bildar olika molekyl sekundära strukturer (t.ex. beta ark för silke eller lindade spolar för keratiner) på grund av deras unika repetitiva primära aminosyrasekvenser 3,28-35. Dessa funktioner främja bildandet av själv monterade makroskopiska strukturer med unika funktioner på biologiska gränssnitt föranledde deras användbarhet som en värdefull resurs för biopolymera material. Här har två typer av strukturella proteiner som används (protein A från vilda tussah och protein B från domesticemullbärssilke som exempel) för att visa de allmänna protokollen för att producera olika proteinlegerings biomaterial. De protokoll visat innefattar del 1: proteininteraktioner förutsägelser och simuleringar, del 2: produktion av proteinlegeringslösningar och del 3: tillverkning av proteinlegeringsystem och för optiska, elektriska och farmaceutiska tillämpningar.
Figur 1. Råvaror av olika strukturella proteiner som vanligen används i vårt laboratorium för att utforma proteinbaserade material, inklusive silke från olika snäckarter, keratiner från hår och ull, elastiner från olika vävnader och olika växtproteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Prediktion av proteininteraktioner
- Bioinformatiska Analys av proteinmolekyler
- Besök National Center for Biotechnology Information webbplats (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/), och sök protein namnen som kommer att användas för legerings studien. Anmärkning: För detta exempel framställdes två proteiner användes: protein A, som är den vilda tussah fibroin och protein B, som är den inhemska mulberry silke fibroin. För protein A, kan aminosyrasekvenserna finns i "fibroin [Antheraea pernyi] Genbank: AAC32606.1" (Antheraea pernyi är kineserna (Ek) Tussah Moth). För protein B, kan aminosyrasekvenserna att läsa i "fibroin tunga kedjan prekursor [Bombyx mori] NCBI Reference Sequence: NP_001106733.1" och "fibroin lätt kedja prekursor [Bombyx mori] NCBI Reference Sequence: NP_001037488.1" tillsammans (Bombyx mori är den domesticerade silkes av mullbärsträd).
- Välj och save de aminosyrasekvenser av protein A och protein B från databasen.
- Besök ExPASy webbplats (SIB Bioinformatics Resource Portal) (www.expasy.org) eller använda annan kommersiell programvara för att beräkna de grundläggande Bioinformatiska data av proteiner baserat på deras sekvenser innefattande, men inte begränsat till, total laddning per molekyl, hydrofobicitetsindex av molekylen, titreringskurvan av molekylerna vid olika pH-värden, etc. Denna information kommer att användas som grundläggande element för beräknings simulering av proteininteraktioner, och kommer att bidra till att förstå om dessa två proteiner har starka växelverkan. [OBS: Detta steg är inte för exakt förutsäga varje detalj i proteininteraktioner som de som används i små peptider eller funktionella proteiner vetenskap. Syftet med detta avsnitt är bara för att undvika att producera en proteinblandning med uppenbara macrophase separationer som inte kan kallas en "legering" material. Därför skulle uppskattningen vara ungefärlig men thkan verifieras e proteinlegeringssystem med en experimentell metod som beskrivs i steg 3,1 med användning av exakt termisk analys].
- Computational Simulering av Protein Legering systemet
Nedan beskrivs ett förfarande för att simulera proteinlegeringssystem. Ett simuleringsprogram är skrivet i programmeringsspråket C som kan användas på en eller multi datorsystem. Ett gitter-fjäder-massa (LSM) modell användes för att simulera de alu-proteiner från 36 till 39. LSM-modellen ger en enkel beskrivning av nettokraften på en massa när den är fäst till en fjäder och man kan lösa kraftekvationen att förstå rörelsen för varje massa. En enkel programalgoritmen för att modellera detta protein legeringssystem med användning av LSM modellen ges enligt följande:- Föreställ ett enda protein som en grovkornig partikel som har en massa på m.
- Använd en Hookean eller neo-Hookean våren för att representera en bindning 38,39. Genom att länka samman ett ändligt antal partiklar med fjädrar, en burk mAKE en sub-legering domän som representerar en stabil byggsten av legerings-proteiner. För att representera olika typer av obligationer i intra-koppling, använder olika fjäderkonstanter / stelhet.
- Model proteinlegeringssystemet som ett material som består av slött-tvärbundna under legeringar. Igen här olika styvheter användes för att representera olika bindningar mellan kopplingarna av under legeringar.
- Model obligationen brytning och reformation process genom en Bell Model 40,41, genom vilka svaga bindningar får reformeras, men starka band kan inte reformera när de är trasiga. När systemet är tillräckligt stressad (både på inom suballoy och inter suballoy obligationer), kan obligationer brytas och reformeras.
- För att studera deformation effekter på legerings-proteiner när de är stressade, gäller yttre krafter till systemet. Fördela dessa krafter lika för varje partikel då lösa kraftekvationen (I Newtons lagar).
- Att modellera interaktionermellan lösningen (såsom vattenmolekyler) och proteinerna, tillämpa en extra släpkraft eller friktionskraften på varje partikel.
- Lös kraftekvationen för varje partikel med åtgärder inom varje kraft (fjäderkraften från obligationen, den yttre kraften och friktionskraften).
- Beräkna och extrahera positionerna av proteinpartiklar som en funktion av tiden.
- Beräkna de fysiska kvantiteter som kännetecknar de alu-proteiner från positionerna för partiklarna.
- Ändra obligations styvhet i programmet för att förstå samspelet mellan olika proteiner. (Den genomsnittliga obligations styvhet beräknas från Youngs modul av proteinmaterial. Youngs modul av olika fibrösa proteinmaterial kan erhållas antingen genom Universal dragprov 18, eller direkt från tidigare litteratur 2-4,18).
2. produktion av protein Legeringslösningar
Wild tussah (protein A) och den inhemska mullbärssilke (protein B) väljs här som ett exempel på proteinlegeringssystem. Detta protokoll presenteras först hur man får den vilda tussah (protein A)-lösning.
- Skär råa vilda tussah kokonger eller fibrer vid en vikt av 3 g.
- Mät 3 g natrium-dikarbonat eller natriumkarbonat (Notera: Om med användning av natriumkarbonat, kommer molekylvikten av proteinkedjor minska under kokningsprocessen 42).
- Fyll en 2 L glasbägare med destillerat vatten (H2O). Sedan placera glaset bägaren på en värmebord, täck den med aluminiumfolie och värm till kokning.
- Ta bort aluminiumfolie locket och lägg den uppmätta natrium dikarbonat långsamt i det kokande vattnet, så att den helt och hållet upplösas. (OBS: Rollen av natrium karbonat är "tvål" för att rensa bort lösliga sericin proteiner och andra föroreningar fästa på ytan av vilda silkesfibrer Om du använder övr.er natur proteinfibrer, välj motsvarande kemiska medel enligt litteraturen).
- Lägg råproteinfibrer (vilda silkesfibrer) i det kokande vattnet och låt koka i 2-3 timmar (OBS:. Kokningen tiden har avgörande inverkan på molekylvikten för proteinkedjor 26,43 Man bör välja en lämplig tid enligt till litteraturen eller genom att utföra kontrollexperiment 26,43. Kokpunkten också kan justeras för att påverka molekylvikten av proteinkedjor 26,43,44).
- Efter kokning, försiktigt bort proteinfibrer med en spatel från lösningen och pressa dem för att avlägsna överflödigt vatten. (VARNING: Fibrerna är mycket varmt!)
- Därefter doppa fibrerna i en 2 liter bägare med kallt destillerat vatten, och tvätta fibrerna två gånger för 30 min vardera för att fullständigt avlägsna de orena resterna från fiberytan. Torka fibrerna i ett dragskåp under minst 12 tim.
- Smält 45,784 g kalcium nittakt (Ca (NO3) 2) i en glasbägare för att bilda en vätska vid 65 ° C för upplösning av de vilda silke proteinfibrer. (OBS: Om du använder andra naturliga proteinfibrer, välj en motsvarande lösningsmedel för att lösa upp proteinerna Här kan du också använda 9,3 M LiSCN eller LiBr lösning, eller en 85% fosfatlösning för att lösa olika silkesfibrer..)
- Kombinera de fibrer och lösningsmedlet vid ett förhållande av 1 g fiber in i 10 ml vätska. Tillåt fibrerna för att lösa upp vid 95 ° C under 5-12 timmar. (Notera: Upplösningstiden beror på molekylvikten hos proteiner 26,43-45)
- Med hjälp av sprutor, injicera vilda siden lösningen i 12 ml dialyskassetter (max 1.000 MW som cutoff storlek) eller förseglade dialysslangar (max 1.000 MW som cutoff storlek) och dialysera mot 2 L destillerat vatten. (Notera: injektion är mer effektiv om att hålla lösningen vid 35 ° C, annars kan viskositeten för proteinlösningen kommer att dramatiskt öka vid rumstemperatur). Ändra destillerat vatten ofta för att avlägsna Ca (NO 3) 2 lösningsmedel i lösningen (efter 30 min, 2 h, 6 h, och sedan varje 12 h under 3 dagar. Totalt kommer det att finnas ca 8 vattenbyten).
- Efter 3 dagar, samla proteinlösningar från dialys kassetter eller slangar och placera i 13.000 rpm rör.
- Centrifugera lösningar för 1 timme vid 3500 rpm vid 4 ° C 3x för att avlägsna avlagringar. Efter varje centrifugkörning, snabbt dra supernatanten till nya rör. Förvara de slutliga lösningarna i en 4 ° C kylskåp.
- Häll 5 ml proteinlösning på en polydimetylsiloxan (PDMS) substrat eller annan plan hydrofoba underlaget och låt den torka helt (detta tar oftast mer än 12 timmar). Väg den återstående fasta proteinfilmen och beräkna den slutliga koncentrationen lösning viktprocent (vikt / vol%) = Uppmätt Vikt (i mg) ÷ 5 (i ml) ÷ 10.
- Samla en annan vald naturligt protein fibrer (i detta case, domestice mulberry silke används som protein B) och upprepa ovanstående förfarande med ett lämpligt "tvål" och upplösning av lösningsmedlet, tills den slutliga lösningen protein vatten med uppmätta koncentrationen erhålles. [OBS: Om proteinmaterial är i pulverform, använda lämpliga porösa rör eller membran för att hålla proven under "soaping" process. Om proteinet redan har renats, gå direkt till steg 2.8 för att lösa upp pulvret. Om proteinet har redan renats och är vattenlösligt, göra sin vattenlösning med en önskad koncentration först och sedan gå till steg 2.15 nedan för att göra blandning proteinlösningar.]
- Späd långsamt protein A-lösning (här vild silke lösning) i destillerat vatten vid 4 ° C för att bilda en 1,0 vikt% protein A vattenhaltig lösning. Gör samma process för protein B (här domestice silke).
- Sakta blanda 1 vikt% protein En lösning med protein B-lösning vid 4 ° C med användning av en pipett för att undvika srotein aggregering under blandning. (Not 1: Använd inte en virvel instrument för att blanda proteiner eftersom vissa proteiner (t.ex. silke) bildar hydrogeler under vibrations 46,47 2:. Använd om möjligt ytterligare enheter för att styra blandningshastigheten och blandnings storlek gör Se till att blanda dem så långsamt som möjligt för att undvika aggregering. Inte snabbt pipett lösningen under blandning).
- De slutliga blandningslösningar bör ha en specificerad massförhållande eller ett molärt förhållande av protein A: Protein B. Typiskt blanda dem med massförhållande av 90:10, 75:25, 50:50, 25:75, 10:90 för att erhålla ett brett spektrum av legeringslösningar. Använd rena protein A och protein B-lösningar som kontroller. Till en blandningslösning med ett molärt förhållande av protein A: Protein B = R: (100-R). Beräkna blandningsvolymförhållandet (baserad på en samma 1 vikt% lösning) av: Volym A: Volym B = R · (MW A): (100-R) · (MW B).
- Omedelbart kastade de slutliga lösningarna till PDMS substrat att bilda filmer eller annat designed material. (Obs: Förvara inte högkoncentrerade proteinlegeringslösningar länge Fler aggregat kan bildas senare på grund av protein-proteininteraktioner i vatten.). Vid behov, späd blandningslösningar med jonfritt destillerat vatten och förvara dem på en 4 ° C kylskåp för att undvika ytterligare proteinaggregering i lösningar.
3 Tillverkning av variabel Protein Alloy Material
- Bekräfta Alloy Prediction genom termisk analys 3,9,31-35
- Förbered PDMS substrat och rengör dem genom blötläggning i destillerat vatten.
- Kasta de proteinblandningslösningar med olika blandningsförhållanden på PDMS substrat.
- Torka lösningar under minst 12 timmar i en kemisk huva med luftflöde tills filmer bildas (Obs: Använd samma volym för olika lösningar så att tjockleken av filmer kan vara fast).
- Avlägsna proteinlegeringsfilmer från PDMS substrat och placera dem på ren disk.
- Väg många Differential (DSC) aluminium kastruller och lock för DSC studien. Matcha pan och lock par för att ha lika totalvikt (vikt på pannan plus vikten på locket är lika med en konstant vikt). Exempelvis användes här en totalvikt på locket och panorera 22,50 mg, och åtta uppsättningar av lock och pan kombinationer med denna totalvikt framställdes.
- Inkapsla 6 mg varje typ av torkat protein smälter in aluminium DSC kastruller och täta dem med deras matchade lock i processen 3.1.5. Täta en tom kastrull och lock paret som ska användas med provet som referens så att endast värmekapacitet prover själva kommer att registreras under termisk analys (OBS: DSC kommer att jämföra värmekapaciteten för referenspanna + lock kontra det prov + kastrull + lock. grund av lika vikt, kommer bakgrunden värmekapacitet från kastruller och lock redovisas lämnar endast värmekapacitet prov i pannan).
- Placera förseglade referenser och prov kokkärl i en DSC-instrument, medspolades torr kvävgas flöde av 50 ml / min, och utrustad med en kyld kylsystem. Innan mätningarna prov bör DSC-instrumentet först kalibreras med safir och indium för värmeflöde och temperatur, respektive.
- Pre-kör DSC vid en uppvärmningshastighet av 2 K / min till 150 ° C och håll sedan vid denna temperatur under 15 min för att avlägsna eventuella kvarvarande vattenmolekylerna i proverna (typiskt omkring 3-10% av totalvikten). Snabbt svalna (10 K / min) till 25 ° C.
- Kör DSC igen vid en uppvärmningshastighet av 2 K / min till 300 ° C, eller tills toppen av proteinblandningar nedbrytning visas 34. Spela värmekapacitet proteinprovet vid olika temperaturer under denna process. Kyl ner DSC och ändra det gamla provet till ett nytt prov med ett annat blandningsförhållande.
- Beräkna och plotta värmekapacitet kontra temperaturkurvor för varje protein blandning prov med DSC programvaran 31-35.
- Bedöm miscibility av proteinblandningar med följande metod (Se Figur 4 Termisk och Figur 5) och om de två proteinerna är helt blandbara, kan de kallas "protein legeringar". Annars termen "protein komposit" skulle vara ett passande namn enligt polymera beskrivande teorier 48,49):
- De individuella proteinerna A och B ska ha individuell enda glas övergångar temperatur, Tg (A) och Tg (B) (Se de gröna och blå kurvorna i Figur 5) 3,48;
- Denna enda glastemperatur normalt mellanting mellan de av de två individuella proteinkomponenter, T g (A) och Tg (B) (se figur 5) 3,48;
- Kan inte blandas fasseparation blandningar erhålls om både Tg (A) och Tg (B) visades på sina ursprungliga lägen (Figur 5), och med varje Tg steghöjd i förhållande till sammansättningen, de två proteinerna är helt oblandbara 3,48.
- Halv blandbar kompositblandning typ av kommer att ha ett mycket brett glasövergångs, eller kan fortfarande ha två glasövergångar, men varje har migrerat närmare varandra i förhållande till de rena proteinkomponenter, Tg (A) och Tg (B) ( se Figur 5). I detta fall kan det finnas mikro heterogena strukturer fas som bildas mellan de två proteinkomponenter, och sammansättningen kan variera från plats till plats.
- Om (3.1.11.1) är fallet visas i DSC, och det kan bekräftas att proteinet AB är ett legeringssystem, sedan gå vidare för att tillverka aluminiummaterial protein.
- Tillverkning av optiska material med Protein Alloys
- Producera (vid tillverkningen lab) eller köpa en konstruerad topografisk yta för gjutning. I detta speciella exempel var ett glas med fyra diffraktionsmönster användas (figur 4Optical).
- Placera glaset med diffraktionsmönster i en skål, och se till att den mönstrade ytan står inför uppåt.
- Sprid PDMS lösningen jämnt på glasytan, och fullt ut täcka ytmönster (PDMS lösningen görs genom att sänka och katalysatorlösning i en 9: 1 blandningsförhållande enligt användarens instruktioner 23,44).
- Placera gjutning skålen i en ugn vid 65 ° i minst 2 timmar, medan på en plan yta. Den PDMS lösningen ska torka in i ett fast substrat under denna process.
- Avlägsna PDMS substrat från glaset. De diffraktionsmönster bör nu överföras till PDMS yta.
- Stansa ut PDMS formar med diffraktionsmönster med hjälp av en lämplig hålslag.
- Drop protein legering lösningar på PDMS ytor med diffraktionsmönster, och torka dem i minst 12 timmar för att få filmer med diffraktionsmönster.
- För att erhålla olösliga proteinlegeringsmaterial, placera hela uppsättningen av dry filmer, däribland PDMS formarna i en 60 ° C vakuumugn (25 kPa) med en vattenskål i botten av kammaren. Pumpa ut luft i ugnen och låt den ånga vattenhärdningsprov i minst 2 timmar. (Denna process kallas temperaturreglerade vattenånga glödgning 45. Jämföra med den mycket använda metanolmetoden, kan det generera liknande innehåll beta ark i silkesmaterial 45). Släpp vakuumet och dra av den vattenolösliga filmen från PDMS substrat med hjälp av pincett. I det här exemplet är vilda silkes-domestice siden legeringar används.
- Testa kvaliteten på diffraktionsmönster på filmer genom att jämföra dem med de ursprungliga mönster på glaset (t.ex. samla SEM-bilder för mikroskala information, samla laser diffraktionsmönster för allmänna mönstret kvalitet).
- Tillverkning av elektriska kretsar på Protein Alloys Materials
- För att tillverka en elektrisk krets mönster på glassubstrat, första cleana glasskiva med användning av några avfettningslösningsmedel, såsom Alconox med ultraljud under 5 min, följt av 5 min i aceton, följt av 5 minuter i metanol. Metanolen används sist eftersom den avdunstar långsammare än aceton så kan blåsas bort underlaget i stället för torkning och lämnar rester.
- Blås glasskiva torrt med torr kvävgas som genereras av koka-off från en 180 L flytande kväve Dewar.
- Introducera substratmaterialen in i avsättningskammaren. (Dessa riktlinjer är ett förstoftningssystem men andra avsättningstekniker kan användas.) Om kammaren är utformad med en lastsluss, är vakuumet i avsättningskammaren inte signifikant påverkas. Evakuera lastsluss till ett tryck av 30 mTorr.
- Öppna avstängningsventil mellan lastsluss och huvudavsättningskammaren och införa substratet in i kammaren.
- Slå på Ar-gas och tryckregulator och kontrollera trycket till den önskade deposition tryck. Högre tryck ger lägre energi finfördelat metallatomer och mer enhetliga filmer medan lägre tryck ger bättre vidhäftning snabbare avsatta filmerna. Utbudet av trycken är i allmänhet mellan 3 mTorr och 60 mTorr, med 20 mTorr fungerar bra.
- Metaller sedan projiceras på en slutare som skyddar underlaget från beläggning med hjälp av en RF-effekt på 100 W. En avstämningskrets krävs för att styra RF-effekten till målet metallen. Likström skulle kunna användas i stället för RF för metalliska mål. I syfte att avlägsna oxidskikt och föroreningar från målet, för-förstofta i flera minuter.
- Öppna slutaren och förstofta metallen på substratet. Avsättningshastigheten för den beskrivna konfigurationen är omkring 10 nm per min. Denna kurs kommer att bero på arbetsavstånd, tryck, magnet styrka i magnetronkatoden, måltjocklek och metallen fräste. Justera avsättningstiden för att uppnå den önskade tjockleken.
- Avlägsna belagda glasskiva frånkammaren.
- Med hjälp av en spinner, snurra en fotoresist beläggning på ytan av filmen. Många resist kan användas. För detta fall positiv fotoresist användes.
- Efter resist spinns på filmen, mjuk baka vid 90 ° C under 5 min för att torka den resist.
- Placera en kontaktmask med en bild av enheten stadigt mot motstå. En UV-ljuskälla används för att exponera fotoresisten. Exponeringen är 10 sek, men varierar beroende på styrkan av ljuskällan och resisten används.
- Placera filmen i fotoresist utvecklare tills den projicerade bilden visas. De utvecklare tvättar bort resist som var utsatt för UV-ljus som orsakar brytningen av polymer obligationer. Omedelbart efter att bilden visas, doppa filmen i DI-vatten för att stoppa utvecklaren från att arbeta på den oexponerade fotoresisten.
- Blås filmerna torra med torr kvävgas.
- Placera filmerna i en ugn vid 120 ° C under 15 min till "hårda bake" fotomotstå.
- Efter filmerna svalna, placera dem i en etsningslösning tills metallen inte skyddas av fotoresisten lyfter. Doppa i vatten för att stoppa etsningen.
- Skölj med aceton för att avlägsna det härdade fotoresisten.
- Skölj med metanol och blås torrt med torrt kväve.
- När de belagda glasen är klara, släpp olika proteinlegeringslösningar på glasytorna och torka dem i minst 12 timmar för att få protein legeringsfilmer på glasögonen. (Det föreslås att först koncentrera de legeringslösningar till 5 vikt% för att erhålla tjocka proteinlegeringsfilmer.)
- På grund av de hydrofoba-hydrofila interaktioner, kommer de tunna metallfilmer överföras från glasytorna till bifogade protein legeringsfilmen ytorna 51. Dra av proteinlegerings filmer med de tunna metallmönster från glassubstraten använder pincett.
- För att erhålla olösliga proteinlegeringsmaterial, placerar de torra filmerna i en 60 ° C vakuumugn (25 kPa) med awater skålen på botten av kammaren. Pumpa ut luft i ugnen och låt den ånga vattenhärdningsprov i minst 2 timmar. Släpp vakuumet och dra av den vattenolösliga filmen från underlaget med hjälp av pincett.
- Testa de elektriska egenskaperna hos metallmönster på proteinlegerings filmer som elektriskt motstånd och jämföra dem med de ursprungliga mönster på glaset.
- Tillverkning av farmaceutiska material från Protein Alloys
- För att tillverka ett protein legeringsfilmer med läkemedelssubstanser, först förbereda en PDMS substrat som beskrivs i steg 3.2. Rengör bildade PDMS substrat med destillerat vatten.
- Lös upp eller dispergera de farmaceutiska föreningarna i en vattenlösning. Använd ultraljud eller vortex för att homogent blanda de farmaceutiska föreningarna med vattnet. Om föreningarna inte är vattenlösliga, dispergera pulvren med en homogen fördelning i jonfritt destillerat vatten.
- Beräkna den önskade massförhållandetav föreningar till protein legeringar efter: volym av föreningslösning x viktprocent av förening lösning: volym av proteinlegering lösning x viktprocent av förening lösning (här 1 vikt% legeringslösning användes). Välj ett förhållande för att erhålla en film med önskad förening densitet i proteinet legeringsfilmen.
- Sakta blanda föreningen lösningen med proteinet legeringslösningen följer samma instruktioner i sektion 2 process 2.16. (OBS: För att undvika gelning, inte ultrasonicate eller virvel lösningen under blandningen).
- Häll en beräknad volym av blandningen på PDMS substrat och torka minst 12 timmar i en kemisk huva till ett få proteinlegerings film innehållande en konstruerad förhållande av läkemedelssubstanser.
- Fysiskt tvärbunden filmen följer samma instruktion i avsnitt 3.2 processen 3.2.8. Ett exempel på legeringsfilmer med olösliga modell läkemedel av en låg täthet (LD) eller hög (HD) densitet kunde ses i figur 4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typiska protein-proteininteraktioner (t ex mellan protein A och protein B) kan innehålla laddning-laddning (elektrostatiska) attraktioner, vätebindningsbildning, hydrofoba-hydrofila interaktioner, liksom dipol, lösningsmedel, motjon och entropiska effekter mellan den specifika domänerna av de två proteinerna (Figur 2) 3. Därför grunden, kan vi förutsäga effekterna av dessa interaktioner med beräknings simuleringar.
Figur 2. Interaktioner mellan protein A och protein B. Normalt skulle dessa interaktioner baseras på laddning-laddning (elektro) attraktioner, vätebindningsbildning, eller hydrofoba-hydrofila interaktioner mellan specifika domäner av dessa två proteiner.
Proteinet-legeringSystemet kan modelleras som ett material som består av tvärbunden proteinunder legering domäner, där var och en av dessa under legeringar antas vara stabil. Samspelet mellan proteinerna (A och B) kan betraktas som obligationer med olika styvheter (för denna studie, anser vi bara två typer av svaga eller starka band i figur 3). De svaga bindningar kunde representera vätebindningar och andra obligationer som beskrivs i figur 2. Proteinet erat som helhet bildas genom dubbla tvärbindningar mellan många under legeringar som avgränsas tillsammans genom både starka och svaga bindningar. De sub-legeringarna är bildad med användning av starka bindningar och inom under legeringar vi tillåta bildandet av svagare bindningar. Proteinet erat som helhet bildas genom dubbla tvärbindningar mellan många under legeringar som band samman genom olika starka och svaga bindningar. När systemet är tillräckligt stressad, är både svaga och starka band spruckit. Under rätt förutsättningar de svaga bindningar tillåtsreformera kopplingarna igen. Dock kommer de starkare bindningar brytas oåterkalleligt. Förekomsten av de svaga bindningar gör legeringen-protein för att behålla sin strukturella integritet under yttre påfrestning 36-41. Denna numerisk simulering används en matematisk modell som utvecklats genom ett underifrånperspektiv som bygger på finita elementmetoder genom gallerfjädermodell 36-41.
Figur 3 Computational simulering för att visa den mekaniska fördelen med ett proteinlegeringssystem under stretching. Under stretching simuleringen, kan en typ av protein (blå färg) bildar en elastisk nätverk som fjädrar som ger superelasticitet för materialet, medan en annan typ av protein (grön färg) kan ge starka fysiska tvärbindare för stabilisering av materialnätet. Dynamisk structural övergångar (t.ex. formationer och deformationer vätebindnings) kunde induceras i olika domäner för att lagra och frigöra energi eller ger ytterligare mekaniskt stöd under sträcknings.
Figur 3 visar en typisk beräkningssimulering av de mekaniska egenskaperna hos ett protein legeringssystem (med vild tussah såsom protein A och domesticemullbärssilke som protein B) under sträckning. Under stretching simuleringen, kan en typ av protein (blå färg) bildar en elastisk nätverk med fjädrar som ger superelasticitet för materialet, medan en annan typ av protein (grön färg) kan fungera som partiklar med starka fysiska tvärbindare för materialet nätet. Dynamiska strukturella övergångar (t.ex. vätebindningsbildning och deformation) kan induceras i olika domäner för att lagra och frigöra energi eller ger ytterligare mekaniskt stöd under sträckan. De simuleringsstudier gersa allmänna teoretiska bilden för att förstå samspelet mellan olika strukturella proteinmolekyler, så att användbara par av proteiner kan plockas att generera proteinlegering material med starka växelverkan och specifika egenskaper, såsom extra mekanisk elasticitet.
Generellt, när protein A och B är valda (här är de vilda silke och domestice siden), kan ett proteinlegering lösning i flera steg (Figur 4). För det första bör de proteinkällor som naturliga fibrer eller pulver rengöras eller renas. Till exempel kan en avslemning process användas för att avlägsna den lösliga silke sericin proteiner belagda på de flesta siden fibroin fibrer 20. För det andra, behöver ett lämpligt lösningsmedel för att tas fram för att lösa upp de olösliga proteinkällor i lösningar. Till exempel är en hög koncentration LiBr lösning ett bra lösningsmedel för att skära beta-ark sekundära strukturer i olika silks och upplösa fibrerna in lösningar.För det tredje kan en dialysmetod användas för att avlägsna lösa upp lösningsmedlet och återvinna proteinmolekylerna i en vattenhaltig lösning. Ytterligare centrifugering är ofta nödvändigt att avlägsna orenheter och oupplösta aggregaten i lösningen. Slutligen kan olika proteinvattenlösningar blandas försiktigt med olika förhållanden. Därför, om de två proteinlösningarna inte har macrophase separation, kommer de att blandas samman med starka interaktioner och bilda ny proteinlegeringssystem för olika biomedicinska tillämpningar. För att göra materialet proteinlegerings olösligt i kroppen, kan olika fysiska eller kemiska tvärbindande behandlingar anpassas. Exempelvis har man funnit att hög temperatur och högt tryck vattenånga glödgning kunde oerhört tvär olika siden eller elastin material 6,52. Medan olika keratin material kan tvärbindas genom deras naturliga disulfidbindningar i proteinsidokedjor 53.
När protein legeringslösningar tillverkas och kontrolleras, kan de formas till ett brett utbud av biomaterial med sökbara egenskaper, inklusive större matriser för termiska, mekaniska, optiska, elektriska, kemiska eller biomedicinska tillämpningar (Figur 4). I den här artikeln, att tre nya ansökningar om dessa material visar den unika fördelen av proteinlegerings biomaterial har valts (Figur 4). Genom moderna mikrotillverkningstekniker, kan olika ytmönster genereras på mikro eller nano skalor på proteinlegeringsmaterial (Figur 4 optisk ansökan). Om exempelvis ett optiskt diffraktionsmönster produceras på filmytan, kan denna film används som media för att överföra laserstrålar i olika optiska mönster 22,23. Om proteinet legeringsmaterial framkommit i en enzymlösning, kan profilen nedbrytning av filmerna att förstås genom att jämföra realtids diffraktionsmönster från filmenmed det ursprungliga mönstret (i stället för fram och tillbaka tvätta och undersöka de nedbrutna filmerna i luften). En annan ny teknik är att belägga olika mikroskala kretsar och trådlösa resonatorer på proteinlegeringsmaterial (Figur 4 elektriska ansökan). Genom denna teknik kan mikro strömmar av skadade vävnader eller organ in vivo övervakas, med trådlösa signaler direkt överföras till läkare 24,51. Och materialet mekanisk seghet och biodurability i kroppen kan enkelt kontrolleras genom blandningsproportioner och specifika proteinkomponenter i materialen. Slutligen kan olika lösliga eller olösliga cancerläkemedel skall införas i materialen proteinlegering (Figur 4 kemiska ansökan). Cancerläkemedel är ofta mycket giftiga, och skadar inte bara cancerceller utan också normala mänskliga immunsystemet. Därför styr region och dosen av cancer läkemedelsavgivning per dag i kroppen är en av tHan viktigaste ämnen i läkemedelsvetenskap. Genom att införliva cancerläkemedel till protein legeringsmaterial kan vi implantera materialet endast i cancervävnader eller organ och kontrollera frisättningshastigheten av cancern läkemedlet per dag från protein legeringsnätet genom reglering av proteinkomponenter och blandningsförhållanden. Eftersom proteinet matrisen är helt bionedbrytbar kommer materialen proteinlegering avlägsnas automatiskt genom kropps enzymer efter drogen frigörperioden. De rester av legeringsmaterial protein är rent aminosyror, som kan absorberas av kroppen naturligt att ytterligare åstadkomma andra väsentliga proteiner in vivo. Patienter som får härdas genom kontrollerad frisättning av cancerläkemedel från implanterade proteinlegeringsmaterial kommer slutligen återvinns utan tillsatser i kroppen, och båda naturliga protein legering matriser och cancerläkemedel kommer att absorberas effektivt i kroppen under denna härdningsprocessen.
Figur 4. Allmänna steg för att producera ett protein som legeringsmaterial, inkluderande rengöring eller rening av proteinet materiella källor, lösa upp de olösliga proteinmaterial i lösningar, dianalysizing att avlägsna upplösa lösningsmedlet från en protein vattenhaltig lösning, centrifugering och blandning tillsammans med olika förhållanden, och fysiska eller kemiska tvärbindande behandlingar. Proteinlegering lösningen kan därefter formas till ett brett utbud av biomaterial med sökbara egenskaper, inklusive större matriser för termiska, mekaniska, optiska, elektriska, kemiska eller biomedicinska tillämpningar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Här visade vi de kritiska rutiner för hur att tillverka elektriska material på protei legeringar med detaljer i figur 5. Tunna metallfilmer såsom elektriska kretsar kan skapas med hjälp av flera olika deponeringsmetoder, inklusive avdunstning, pulsad laser deponering eller sputtering. Sputtering valdes för den aktuella studien, eftersom det ger en betydande flexibilitet för den energi de förstoftade arter genom justering av sputtering gastryck och kraft appliceras på katoden samt nedfall enhetlighet genom justering av gastrycket och katodstorlek. Förstoftningsdeponering kan användas för att projicera en metallfilm på ett glassubstrat (figur 5A). I detta fall var Ag krets filmer deponeras i en hög vakuumkammare med ett grundtryck av ca 1 x 10 -7 Torr. Den Ar förstoftning gas infördes till kammaren vid ett tryck av 20 mTorr och Ag deponerades med användning av en RF-generator vid 100 W under 20 min från en 2-tums plana magnetronkatod som är 8 cm från substratytan. Anordningar är defgranskat hjälp av vanliga fotolitografiska tekniker i filmerna på glas följt av våt kemisk etsning (se detaljerat förfarande i figur 5A). Enheter kan också definieras genom avsättning genom en fysisk mask direkt på protein filmerna. Rumstemperatur elektrisk resistivitet av de elektriska kretsar på protein filmerna mättes med användning av båda två-terminala och fyra-terminala tekniker. Fördelen med den fyra-terminala tillvägagångssätt är att eliminera kontaktmotstånd från mätningen men vi finner att kontaktmotståndet är inte signifikant så en två-terminal mätning är tillräcklig. De två terminala mätningar använder en god kvalitet multimeter inställd på ohm skala andet kontakt med filmen vid båda ändarna av metalltråden (som schematiskt visas i figur 5B). I denna mätning tjänar den multimeter som både en strömkälla och en voltmeter och det uppmätta motståndet är spänningen dividerat med strömmen. Resistiviteten beräknas medρ = RA / l, där R är resistansen, A är tvärsnittsytan av tråden och L är avståndet mellan proberna. För det skapas här, var R uppmättes till 23,5 Ω använder lutningen hos spänning-ström-kurvan i Figur 5B (R = ΔVoltage / ΔCurrent), är l 4,45 x 10 -2 m, och A befanns vara 6,685 x 10 -10 m 2. Med dessa värden, har en resistivitet på 3,6 x 10 -7 Ω · m hittade för filmerna, ca 20x större än för bulk silvermetall (1,6 x 10 -8 Ω · m). En högre resistivitet mäts i filmer jämfört med bulk är typiskt på grund av den redan begränsade strömbanan och oförmågan av laddningsbärare att undvika defekter. Upphettning av metall med en värmepistol ökat sin motstånds indikerar en höjning av elektron spridning av fononer karakteristiska av metalliskt ledning.
Figur 5 (A) Förfarande för att göra elektriska kretsar på proteinlegeringsfilmer (här silver kretsar på vilda tussah och mullbär silkes blandning filmer som ett exempel): (a) Obestruket objektglas; (B) Silver plasma under sputtering från ett mål 2 fots diameter; (C) Silver belagd glasskiva; (D) Silver belagda prov hålls till spinnaren med hjälp av vakuumchuck innan du lägger fotoresisten; (E) Silver slide belagd med fotoresist sattes i ugn för mjuk-baka vid 120 ° C; (F) Exponera för UV-strålning för att bryta polymer obligationer i fotoresisten; (G) Utveckla fotoresisten; (H) Hard-baka den motstå att förbereda sig för etsning i syra; (I) Etsa i syran, sedan stoppa Etch genom sköljning i ett vattenbad; (J) Torka slide; (K) Medverkande proteinlegering lösningen på bilden; (L) Överföring silvermönster till den torkade proteinfilmen. (B) -7 Ω · m, ca 20x större än för bulk silvermetall. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 Termisk analys modell används för att kontrollera blandbarheten av blandade proteinsystemet. Om protein A och B har individuella enstaka glastemperaturer, Tg (A) och T g (B), respektive (gröna och blå kurvor), en fullt blandbar proteinlegeringssystem kommer att visa endast en glas skiljer sig från Tg s A och B (röd kurva). Annars proteinets är blandbara blandningar med både T g (A) och Tg (B) (svart kurva), eller halvblandbara kompositer med två skiftade glas övergångar (apelsin kurva).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En av de mest kritiska förfaranden producera "legering" protein-systemet är att kontrollera blandbarheten hos de blandade proteiner. Annars är det bara en oblandbar proteinblandning eller protein sammansatt system utan stabila och avstämbara egenskaper. En experimentell termisk analys metod kan användas för detta ändamål och för att bekräfta sina legeringsegenskaper. Protein-proteininteraktioner kan ses enligt Flory-Huggins s gittermodell 48 samspel mellan "lösningsmedel" (den dominerande proteinkomponenten) och "löst ämne" (den mindre proteinkomponent). Utifrån denna modell, den fria energin förändringen under blandning mellan "lösningsmedel" och "löst ämne" styr blandbarhet av blandningen 48. Generellt finns det tre olika grader av blandbarhet: (a) fullständigt blandbar (blankett enfas material makroskopiskt), (b) metastabil (bildar halvblandbara faser i materialet) och (c) icke blandbar (förblir ursprungliga två faser med individuell protein A och B-områden) 3,48. På motsvarande sätt kan de glasövergångs beteenden av en två proteinsystem kan visa dessa skillnader och idealiskt uttryckas med användning av ett fasdiagram modell (Figur 6). Om till exempel protein A och B har sina individuella enstaka glastemperaturer, Tg (A) och Tg (B), respektive (Figur 6 gröna och blå kurvor), bör en fullt blandbar protein legeringssystem visar endast en glas under upphettningen. Denna enda glasövergångs normalt är mellanliggande mellan Tg er av A och B (Figur 6). Annars kan proteinerna bildar en oblandbar blandning som innebär både Tg (A) och Tg (B) visas vid sina ursprungliga lägen (Figur 6). Proteinerna kan också bilda ett halv blandbar systemet anges med två skiftade glas transitioner (Figur 6). Ett praktiskt exempel på fullt blandbar protein "legering" systemet (blankett en glas) finns i DSC skannar Silk tropoelastin blandningsprover i Figur 4 (termisk ansökan) 9. Med minskningen av silke innehåll, glastemperaturerna (T g) av blandningarna ökade gradvis från 178 ° C (rent silke) till 190 ° C (ren tropoelastin) 9, men konsekvent hålla en homogen enda glas för alla typer av smälter. Enligt Flory-Huggins modell, betyder det att alla silk-tropoelastin blandningar av olika blandningsförhållanden är stabila och är helt blandbara protein legeringar utan några macrophase separationer.
Sammanfattningsvis kan nya generationer av proteinlegeringsmaterial produceras och tillverkas i olika medicintekniska produkter (t.ex. filmer, suturer, skruvar, plattor, mikronålar, geler), med kontrollerade och tonfiskble optiska, elektriska, kemiska, termiska och mekaniska egenskaper. Genom att styra blandningskomponenter och förhållanden, olika biofysiska egenskaper hos protein legerat material, såsom elasticitet, styrka, ytjämnhet, ytladdning, biodurability och kemisk aktivitet, kan manipuleras, vilket i slutändan kan påverka vävnadsfunktioner samt den lokala cellulära beteenden som är förknippade med dessa material. Dessutom, på grund av den typ av proteiner "programmerbar livstid in vivo blir en livskraftig plattform för dessa legeringsmaterial. Sådana fördelar skulle kunna tillhandahålla nya alternativ för medicintekniska produkter för implantation i framtiden där post reparation kirurgisk hämtning kan undvikas. Dessa protein legering biomaterial skulle också erbjuda en ny väg för att producera medicintekniska produkter med avstämbara biologiska funktioner och egenskaper, och med matchande vävnad efterlevnad och relaterade behov. Den här artikeln innehåller en generell protokoll översyn för hur man tillverka dessa enheter ochskulle gynna både forskare och kliniska läkare i flera biomedicinska områden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna tackar Rowan University för att stödja denna forskning. XH också tack vare Dr David L. Kaplan vid Tufts University och NIH P41 Tissue Engineering Resource Center (TERC) för tidigare tekniska utbildningar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Q100 Differential Scanning Calorimeters (DSC) | TA Instruments, New Castle, DE, USA |
N/A | You can use any type of DSC with a software to calculate the heat capacity. |
| SS30T Vacuum Sputtering System | T-M Vacuum Products, Inc., Cinnaminson, NJ, USA | N/A | With custom built parts; you can use any type of sputtering system to coat. |
| VWR 1415M Vacuum Oven | VWR International, Bridgeport, NJ, USA | N/A | You can use any type of vacuum oven to physically crosslink the samples. |
References
- Rosenbloom, J., et al. Extracellular matrix 4: The elastic fiber. FASEB J. 7, 1208-1218 (1993).
- Traub, W., et al. On the molecular structure of collagen. Nature. 221, 914-917 (1969).
- Hu, X., et al. Protein-Based Composite Materials. Materials Today. 15, 208-215 (2012).
- Hardy, J. G., Scheibel, T. R. Composite materials based on silk proteins. Progress in Polymer Science. 35, 1093-1115 (2010).
- Kidoaki, S., et al. Mesoscopic spatial designs of nano- and microfiber meshes for tissue-engineering matrix and scaffold based on newly devised multilayering and mixing electrospinning techniques. Biomaterials. 26, 37-46 (2005).
- Teng, W. B., et al. Recombinant silk-elastin like protein polymer displays elasticity comparable to elastin. Biomacromolecules. 10, 3028-3036 (2009).
- Foo, C. W. P., Kaplan, D. L. Genetic engineering of fibrous proteins, spider dragline, silk and collagen. Adv Drug Delivery Rev. 54, 1131-1143 (2002).
- Hu, X., et al. Charge-Tunable Autoclaved Silk-Tropoelastin Protein Alloys That Control Neuron Cell Responses. Adv. Funct. Mater. 23, 3875-3884 (2013).
- Hu, X., et al. Biomaterials derived from silk-tropoelastin protein systems. Biomaterials. 31, 8121-8131 (2010).
- Hu, X., et al. The influence of elasticity and surface roughness on myogenic and osteogenic-differentiation of cells on silk-elastin biomaterials. Biomaterials. 32, 8979-8989 (2011).
- Hu, X., et al. Biomaterials from ultrasonication-induced silk fibroin-hyaluronic acid hydrogels. Biomacromolecules. 11, 3178-3188 (2010).
- Gil, E. S., et al. Swelling behavior and morphological evolution of mixed gelatin/silk fibroin hydrogels. Biomacromolecules. 6, 3079-3087 (2005).
- Lu, Q., et al. Green process to prepare silk fibroin/gelatin biomaterial scaffolds. Macromol. Biosci. 10, 289-298 (2010).
- Lu, S., et al. Insoluble and flexible silk films containing glycerol. Biomacromolecules. 11, 143-150 (2010).
- Mandal, B. B., et al. Silk fibroin/polyacrylamide semi-interpenetrating network hydrogels for controlled drug release. Biomaterials. 30, 2826-2836 (2009).
- Yeo, I. S., et al. Collagen-based biomimetic nanofibrous scaffolds, preparation and characterization of collagen/silk fibroin bicomponent nanofibrous structures. Biomacromolecules. 9, 1106-1116 (2008).
- Holst, J., et al. Substrate elasticity provides mechanical signals for the expansion of hemopoietic stem and progenitor cells. Nat. Biotechnol. 28, 1123-1128 (2010).
- Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. New Opportunities for an Ancient Material. Science. 329, 528-531 (2010).
- Qin, G., et al. Mechanism of resilin elasticity. Nature Communications. 3, 1003 (2012).
- Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nat. Protocols. 6, 1612-1631 (2011).
- Wise, S. G., et al. Engineered tropoelastin and elastin-based biomaterials. Adv Protein Chem Struct Biol. 78, 1-24 (2009).
- Amsden, J. J., et al. Rapid nanoimprinting of silk fibroin films for biophotonic applications. Adv. Mater. 22, 1746-1749 (2010).
- Lawrence, B. D., et al. Silk film biomaterials for cornea tissue engineering. Biomaterials. 30, 1299-1308 (2009).
- Kim, D. H., et al. Dissolvable films of silk fibroin for ultrathin conformal bio-integrated electronics. Nat. Mater. 9, 511-517 (2010).
- Zhang, J., et al. Stabilization of vaccines and antibiotics in silk and eliminating the cold chain. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 11981-11986 (2012).
- Pritchard, E. M., et al. Effect of silk protein processing on drug delivery from silk films. Macromolecular Bioscience. 13, 311-320 (2013).
- Lammel, A. S., et al. Controlling silk fibroin particle features for drug delivery. Biomaterials. 31, 4583-4591 (2010).
- Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. J Phys Chem B. 101, 11007-11028 (1997).
- Shao, Z., Vollrath, F. Materials: Surprising strength of silkworm silk. Nature. 418, 741-741 (2002).
- Jin, H. J., Kaplan, D. L. Mechanism of silk processing in insects and spiders. Nature. 424, 1057-1061 (2003).
- Hu, X., et al. Determining Beta-Sheet Crystallinity in Fibrous Proteins by Thermal Analysis and Infrared Spectroscopy. Macromolecules. 39, 6161-6170 (2006).
- Hu, X., et al. Dynamic Protein-Water Relationships during β-Sheet Formation. Macromolecules. 41, 3939-3948 (2008).
- Hu, X., et al. Microphase separation controlled beta-sheet crystallization kinetics in fibrous proteins. Macromolecules. 42, 2079-2087 (2009).
- Cebe, P., et al. Beating the Heat - Fast Scanning Melts Beta Sheet Crystals. Scientific Reports. 3, 1130 (2013).
- Pyda, M., et al. Heat Capacity of Silk Fibroin Based on the Vibrational Motion of Poly(amino acid)s in the Presence and Absence of Water. Macromolecules. 41, 4786-4793 (2008).
- Buxton, G. A., et al. A lattice spring model of heterogeneous materials with plasticity. Model. Simul. Mater. Sci. Eng. 9, 485-497 (2001).
- Buxton, G. A., Balazs, A. C. Modeling the dynamic fracture of polymer blends processed under shear. Phys. Rev. B. 69, 054101 (2004).
- Kolmakov, G. V., et al. Harnessing labile bonds between nanogel particles to create self-healing materials. ACS Nano. 3, 885-892 (2009).
- Duki, S. F., et al. Modeling the nanoscratching of self-healing materials. J. Chem. Phys. 134, 084901 (2011).
- Bell, G. I. Models for the specific adhesion of cells to cells. Science. 200, 618-627 (1978).
- Bell, G. I., et al. Cell adhesion. Competition between nonspecific repulsion and specific bonding. Biophys. J. 45, 1051-1064 (1984).
- Wang, Q., et al. Effect of various dissolution systems on the molecular weight of regenerated silk fibroin. Biomacromolecules. 14, 285-289 (2013).
- Wray, L. S., et al. Effect of processing on silk-based biomaterials: reproducibility and biocompatibility. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 99, 89-101 (2011).
- Lawrence, B. D., et al. Silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design. J. Vis. Exp. (62), e3646 (2012).
- Hu, X., et al. Regulation of Silk Material Structure by Temperature-Controlled Water Vapor Annealing. Biomacromolecules. 12, 1686-1696 (2011).
- Yucel, T., et al. Vortex-induced injectable silk fibroin hydrogels. Biophys J. 97, 2044-2050 (2009).
- Yucel, T., et al. Non-equilibrium silk fibroin adhesives. J Struct Biol. 170, 406-412 (2010).
- Flory, P. J. Principles of polymer chemistry. , Cornell University Press. Ithaca, N.Y.. (1953).
- Chen, H., et al. Thermal properties and phase transitions in blends of Nylon-6 with silk fibroin. J Therm Anal Calorim. 93, 201-206 (2008).
- Scabarozi, T. H., et al. Epitaxial growth and electrical-transport properties of Ti7Si2C5 thin films synthesized by reactive sputter deposition. Scripta Materialia. 65, 811-814 (2011).
- Tao, H., et al. Silk materials-a road to sustainable high technology. Adv Mater. 24, 2824-2837 (2012).
- Annabi, N., et al. Cross-linked open-pore elastic hydrogels based on tropoelastin, elastin and high pressure CO2. Biomaterials. 31, 1655-1665 (2010).
- Moll, R., et al. The human keratins: biology and pathology. Histochem Cell Biol. 129, 705-733 (2008).
