Single-plant, Steriel Microcosmi voor nodulatie en groei van de peulvrucht installatie<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Met de stikstofbindende Symbiont<em&gt; Sinorhizobium meliloti</em

Samenvatting

Groei van Medicago truncatula planten in symbiose met de stikstofbindende bacteriën Sinorhizobium meliloti in individuele, steriele microkosmossen gemaakt van standaard laboratorium platen maakt veelvuldig onderzoek van het wortelstelsel en knobbeltjes, zonder afbreuk te doen aan de steriliteit. Planten kunnen in deze groeikamers worden gehandhaafd tot 9 weken.

Samenvatting

Stikstofbindende bacteriën vormen symbiotische, stikstofbindende knobbeltjes op de wortels van compatibele host vlinderbloemige planten. Een van de meest goed ontwikkelde modelsystemen voor de studie van deze interacties is de plant Medicago truncatula cv. Jemalong A17 en de stikstofbindende bacterie Sinorhizobium meliloti 1021. Herhaalde beeldvorming van plantenwortels en scoren van symbiotische fenotypes vereist methoden die niet-destructief om ofwel planten of bacteriën. De symbiotische fenotypes van sommige planten en bacteriële mutanten duidelijk worden na relatief korte perioden van groei, en geen langdurige observatie van de gastheer / symbiont interactie vereisen. Echter, subtiele verschillen in symbiotische efficiëntie en knobbeltje veroudering fenotypes die niet zichtbaar zijn in de vroege stadia van de nodulatie proces vereisen relatief lange periodes groei voordat ze kunnen worden gescoord. Verscheidene werkwijzen zijn ontwikkeld voor groei en observatie van de gastheer / symbiont paar lange termijn.Echter, veel van deze methoden vereisen herhaalde water, die de mogelijkheid van verontreiniging met andere microben vergroot. Andere methoden vereisen een relatief grote ruimte voor de groei van grote aantallen planten. De beschreven methode hier, symbiotische groei van M. truncatula / S. meliloti in steriele, single-fabriek microkosmos, heeft verschillende voordelen. Planten in deze batches voldoende vocht en voedingsstoffen zodat water niet nodig tot 9 weken, voorkomen kruisbesmetting tijdens drenken. Hierdoor kunnen fenotypes te worden gekwantificeerd die kunnen worden gemist op korte termijn groei systemen, zoals subtiele vertragingen in knobbeltje ontwikkeling en vroege knobbeltje veroudering. Ook zijn de wortels en knobbeltjes in de microcosmos gemakkelijk gezien door de plaat deksel, zodat actuele beworteling van de planten waarneming is niet vereist.

Inleiding

De interactie tussen de peulvruchten waardplant Medicago truncatula A17 en de stikstofbindende bacterie Sinorhizobium meliloti 1021 is een van de meest handelbare modelsystemen voor de studie van de wortel nodule ontwikkeling en stikstofbindende symbiose. De genomen van beide symbiotische partners zijn gesequenced ^1,2 en zowel plant als bacterie vatbaar zijn voor genetische manipulatie ^3,4. Analyse van de fenotypen van zowel plantaardige en bacteriële mutanten vereist het vermogen om de stadia van ontwikkeling nodule observeren en de symbiotische productiviteit kwantificeren tijd. Hier beschrijven we een methode voor de waarnem....

Protocol

Stappen 1, 2, 4 en 6 in een steriele laminaire stroming kap wordt aanbevolen.

1. Bereiding van M. truncatula A17 Zaailingen

Opmerking: M. truncatula A17 zaden die in deze studies worden geproduceerd onder kas condities gekoeld bij ongeveer 22 ° C, of een plantengroei kamer gehandhaafd op 22-26 ° C ~ 150-400 mmol / m ^-2 s ^-1 licht.

1. Giet zaadgerminatie platen: Gebruik 100 mm vierkante platen (15 mm diep) en giet geautoclaveerd 1,1-1,2% w / v gezuiverd agar ¹⁰ tot een diepte van 3-5 mm. Elke plaat wordt gebruikt ~ 0,25-0,5 g zaad (equivalent aan 63-125....

Resultaten

De bereiding en inoculatie van deze plaat microcosmos is relatief eenvoudig in vergelijking met andere methoden in de inleiding beschreven. Het gebruik van deze microkosmos laat ook langdurig plantengroei (maximaal 9 weken) zonder water of voedingssupplementen, onderhoud van wortel steriliteit, zowel gemakkelijk onderzoek van wortels en de bescherming van de wortels van het licht, groei van de vrije plant scheuten, gemakkelijke toegang tot de shoot voor lengtemeting, en verwijdering van planten uit de batches met minima.......

Discussie

Er zijn verschillende stappen van het protocol dat van cruciaal belang voor het succes zijn: 1) De noodzaak van het gebruik van gezuiverd, plantencel-cultuur getest agar kan niet genoeg benadrukt worden. Dit is niet kritisch voor alfalfa zaailingen, maar het is essentieel voor de groei van M. truncatula A17. 2) Het is belangrijk dat zaailingen ontkiemen inzake verticale agarplaten zoals beschreven in stap 1. De veel gebruikte techniek van kiemende zaailingen op een omgekeerde horizontaal oppervlak in een 15 mm .......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agar gezuiverd, getest op plantencelcuur	Sigma	A7921