Introduction
Modelli animali forniscono informazioni patologia malattia che non può essere acquisita mediante analisi in vitro. Per fornire i risultati più efficaci, è importante utilizzare un modello animale che è strettamente correlata alla malattia e specie di interesse. Ad esempio, la Reeves 'muntjac (Muntiacus reevesi), un piccolo cervo asiatico 1,2, e topi transgenici che esprimono la proteina prionica cervide (CerTgPrP) 3 sono modelli animali utili per le specie di cervidi. Entrambe le specie sono polyestrous, che permette tutto l'anno di allevamento, e quindi una fonte costante per i tessuti e fluidi legate alla gravidanza per studiare meccanismi specifici di cervidi biologia. Studi di latte hanno una vasta gamma di applicazioni che sono più semplice (ed economico) compiute in modelli animali che nell'uomo. I ricercatori hanno potuto studiare il latte e il colostro come una potenziale fonte di 1) trasmissione di malattie infettive, 2) immunoglobuline trasferiti dalla madre alla prole in svipment dell'immunità passiva 4 e 3) lattoferrina, una proteina presente nel latte materno umano coinvolto nella immunità passiva che i ricercatori stanno tentando di produrre commercialmente 5.
La raccolta di una notevole quantità di latte proveniente da animali di piccola taglia può rivelarsi un compito difficile. Rogers ha proposto un metodo per raccogliere il latte da ratti 6, che è stato successivamente utilizzato in topi. DePeters e Hovey proposti due metodi per la raccolta del latte, uno con un aspirapolvere manualmente generata prodotta da una lampadina pipetta gomma collegata ad una pipetta Pasteur, e una seconda che richiede la costruzione di un gruppo di mungitura, che viene poi collegato ad una sorgente di vuoto (ad esempio come un rubinetto) per raccogliere il latte topo 7. Qui vi proponiamo un metodo semplice ed economico per la raccolta del latte da entrambi i topi e Reeves 'muntjac cervo, che richiede solo prontamente disponibili attrezzature di laboratorio e le competenze tecniche di base. Il nostro metodo produce quantità sufficienti di latte per varieapplicazioni.
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Protocol
1. Mouse mungitura protocollo
I metodi descritti in questo protocollo sono state approvate dal IACUC.
1. Separazione della diga di Offspring
- Selezionare la diga da mungere. Scegliere una diga con una cucciolata di 4 o più cuccioli che è 8-12 giorni dopo il parto per fornire il latte la massima raccolta, anche se la raccolta è possibile in qualsiasi momento punto di post parto fino a 21 giorni.
- Separare la diga dalla sua cucciolata di almeno 2 ore prima della mungitura.
Nota: Se una voglia di mungere più di una diga in un dato periodo di tempo, è accettabile per ospitare le dighe separate nella stessa gabbia con cibo adeguato e acqua.
2. Somministrazione di ossitocina, Anestesia e lubrificante Eye
- Somministrare 2 UI / kg di ossitocina per via intraperitoneale (IP). L'ossitocina è un ormone che agisce sulle ghiandole mammarie delle femmine in allattamento per stimolare il rilascio di latte. L'ossitocina può essere acquisito from un veterinario.
- Somministrare miscela anestetica contenente 80-100 mg / kg ketamina in combinazione con 5-10 mg / kg IP xilazina. Ad esempio, una miscela di 10 ml di brodo anestetico potrebbe essere preparata in anticipo per topi del peso di circa 30 g ed includerebbe 0,1 ml xilazina, 8,9 ml di H 2 O e 1,0 ml di ketamina. 0,25 ml di anestetico totale sarà sedare un topo di queste dimensioni per circa 20-30 min, che dovrebbe fornire un tempo adeguato per la raccolta del latte.
Note: Per determinare che l'animale è stato anestetizzato con successo, dolcemente immettere sul suo stomaco su una superficie solida; non dovrebbe essere in movimento i piedi o il tentativo di salire a piedi se lei è completamente anestetizzato. Nel caso di un topo non essere completamente anestetizzati con il dosaggio originale, il ricercatore può somministrare un altro ¼ o ½ della dose iniziale della miscela anestetica seconda delle dimensioni del mouse e / o il livello di sedazione che il mouse ha già raggiunto . Tuttavia, questo potreincrease la possibilità di una reazione avversa all'anestesia, e può anche comportare il mouse che viene più profondamente anestetizzati e / o anestetizzato per un periodo di tempo più lungo.
Nota: Se mungitura più di una diga, è necessario sfalsare ossitocina e iniezioni anestetiche causa della breve emivita di ossitocina e tempi di sedazione per chetamina e xilazina. - Applicare una piccola quantità di lubrificante dell'occhio verso l'angolo di ogni occhio e la diffusione di evitare gli occhi del topo si secchi mentre sotto anestesia.
3. Milk Collection
La raccolta del latte è più facilmente eseguita con due ricercatori: un ricercatore di tenere il mouse anestetizzato esprimendo manualmente il latte (denominato R1), e un ricercatore di raccogliere il latte (R2). Questo metodo può anche essere eseguita con una sola persona, se il mouse è fissato su una superficie piana per evitare un danno.
- R2 dovrebbe essere dotato di sterili rilievi di preparazione alcol, un pip P-200etman, un puntale pulito per ogni topo, e un contenitore per il latte, quale un tubo Eppendorf da 1,5 ml o un esageratamente 1,2 ml (vedi tabella dei materiali).
- Come l'ossitocina comincia a fare effetto, latte delusione diventerà visibile nella zona mammaria del topo (vedi Figura 1A). R1: Svolgere una sterile tampone imbevuto di alcool e pulire delicatamente la zona mammaria del topo per pulire la zona prima della mungitura. Esprimere manualmente latte dal capezzolo con il pollice e l'indice per massaggiare delicatamente e spremere il tessuto mammario in un movimento verso l'alto finché una goccia visibile di latte comincia a formarsi alla base del capezzolo.
- Premere il Pipetman stantuffo P-200 alla sua prima fermata per liberare l'aria dalla punta della pipetta e prepararsi per la raccolta del latte.
- Posizionare la punta della pipetta nella parte superiore della goccia di latte, e tirare delicatamente il latte nella punta della pipetta rilasciando lentamente la pressione sullo stantuffo. Fare attenzione a non mettere la punta troppo vicino al capezzolo o della pelle (vedereFigura 1B). Non è necessario rilasciare completamente il pistone come questa tirerà il latte fino alla parte superiore della punta della pipetta e renderà difficile per espellere il latte spesso viscoso nella tenuta del contenitore.
- Espellere il latte nel contenitore con il pollice per premere lo stantuffo passato il primo arresto (vedere Figura 1C). Per facilitare l'espulsione di piccoli volumi, premere la punta della pipetta contro il lato del tubo in modo che il liquido non viene perso.
- Continuare ad esprimere manualmente latte di ogni capezzolo, muovendosi in senso orario o antiorario in modo da non saltare alcuna tettarelle. E 'sia accettabile e utile per tornare e continuamente estrarre il latte dal medesimo capezzolo dovrebbe produrre più latte di un altro.
4. Reversal anestetico nella diga
- Nella maggior parte dei casi, è comune per la diga di cominciare a cominciare a svegliare durante la mungitura. Se questo non è il caso, posizionare la diga in una cage indirettamente sotto una fonte di calore, come una coperta riscaldata di circolazione, fino a quando lei comincia a svegliarsi.
Nota: Poiché la diga comincia a svegliarsi, tenere stretta osservazione della sua attività fino a quando lei è in grado di camminare su di lei gabbia da sola. - Una volta che la diga si muove sulla gabbia senza lotta, posizionare la schiena nella sua gabbia originale con la sua cucciolata. Senza effetti negativi sono stati notati per quanto riguarda la capacità dei cuccioli 'per alimentare dopo la raccolta del latte.
2. Muntjac mungitura protocollo
I metodi descritti in questo protocollo sono state approvate dal IACUC.
1. Separazione della Doe di Offspring
- Selezionare la cerva da mungere. Reeves 'muntjac cervo generalmente danno vita ad uno fulvo 2. Mungere la cerva il giorno dopo parto per consentire l'opportunità fulvo di accedere ai nutrienti essenziali nel colostro 8.
Nota: Il fulvo di solito si nasconde e non si ripresenta durante il procedure; separazione della coppia madre-prole non è necessario.
2. Somministrazione di ossitocina, Anestesia e lubrificante Eye
- Somministrare 10 UI / kg di ossitocina per via intramuscolare (IM). L'ossitocina è un ormone che agisce sulle ghiandole mammarie delle femmine in allattamento per stimolare la let-down di latte. L'ossitocina può essere acquistato da un veterinario.
- Amministrare l'anestetico BAM IM 11 contenente Butorfanolo 0,45 mg / kg, azaperone 0,25 mg / kg, medetomadine 0,07 mg / kg. Una dose della miscela di anestetico BAM sarà sedare una muntjac per circa 20-30 min, che prevede ampio spazio per la raccolta del latte completo. Un'altra opzione per anestesia è midazolam 1-2 mg / kg, che sedare una muntjac per circa 10-15 min. Mentre questo fornisce un tempo adeguato per la raccolta del latte, questo anestetico viene metabolizzato più rapidamente di BAM e l'animale può tentare di sfuggire alla fine del periodo di tempo più breve.
Nota: Minimal risposta al dolore, Riflessi minori upon toccare le orecchie, seguita dalla capacità di R1 per tenere il MJ senza lotta indica che l'animale è stato anestetizzato con successo.
Nota: Nel caso di un muntjac non essendo completamente anestetizzati con il dosaggio originale, il ricercatore può somministrare un altro ¼ o ½ della dose iniziale della miscela anestetica seconda delle dimensioni dell'animale e / o il livello di sedazione che è già stato raggiunto. Tuttavia, questo potrebbe aumentare la probabilità di una reazione avversa all'anestesia, e può anche comportare la muntjac essere più profondamente anestetizzati e / o anestetizzato per un periodo di tempo più lungo. - Applicare una piccola quantità di lubrificante fino all'angolo di ciascun occhio e la diffusione di evitare gli occhi del muntjac si secchi mentre sotto anestesia.
3. Milk Collection
La raccolta del latte è più facilmente eseguita con due ricercatori; un ricercatore di tenere il muntjac anestetizzato inil giro mentre esprimendo manualmente il latte (di seguito R1), e un secondo ricercatore per mantenere la testa del muntjac in una posizione comoda e sicura e per raccogliere il latte (R2).
- A seconda del anestetico usato, la mungitura deve essere effettuata sia 1) nei loro recinti per fornire un luogo sicuro per loro dovrebbero svegliarsi durante la procedura (2) o midazolam-indotta) in un antibagno-biancheria da letto libero per mantenere la pulizia (BAM- indotta).
- R1 e R2 devono essere dotati di una garza imbevuta di etanolo e diverse provette da 15 ml in polipropilene coniche per contenere il latte.
- Come l'ossitocina comincia a fare effetto, latte delusione diventerà visibile nella zona mammaria del muntjac. R1: Sterilizzare mani guantate e le dita, così come l'intera mammella e ogni singolo capezzolo dell'animale con la garza imbevuta di etanolo. R2: Tenere la testa del muntjac in una posizione sicura e confortevole per consentire facilità di respirazione e aiutare a prevenire rumine rigurgito. Tenere le cl tubo di raccolta ose al capezzolo essere munte senza toccarla per evitare potenziali contaminazioni.
- Esprimere il latte da un capezzolo con il pollice e l'indice per premere delicatamente il tessuto mammario in un movimento verso l'alto fino a quando il capezzolo è gonfio di latte, e rotolare delicatamente il latte dal capezzolo e nel tubo che R2 è in possesso (vedi Figura 2 ).
- Nota: Il latte viene fuori in un flusso, quindi è importante per R2 per avere il tubo di raccolta posizionato in modo che poco o nessun latte sarà sprecato.
- Mammella della muntjac è diviso in quadranti. R1: Continuare a estrarre il latte da ogni quadrante fino a che il latte non scorre più facilmente. Se il latte non può essere espresso da una tettarella, espresso da tutte le altre tettarelle prima di tornare al primo. E 'sia accettabile e utile per tornare e continuamente estrarre il latte dal medesimo capezzolo dovrebbe produrre più latte di un altro.
4. Reversal anestetico nel Doe
t "> E 'comune per midazolam indotta doe per cominciare a svegliarsi durante il processo di mungitura. Nella maggior parte dei casi, la cerva tenterà di fuggire prima che tutto il latte è stato espresso. ritenuta minore è usata in uno sforzo per aumentare il latte rendimento, ma la sicurezza e il comfort sia dei ricercatori e la cerva sono ugualmente importanti.- Somministrare atipamezolo a 2,5 mg / mg medetomadine per via sottocutanea per una rapida inversione della BAM anestetizzato doe.
Nota: Con entrambi i tipi di anestesia, è necessario mantenere una stretta osservazione del doe fino a quando lei è in grado di camminare da sola senza inciampare o cadere, ed è in grado di mangiare e bere senza timore di aspirazione o di soffocamento. Senza effetti negativi sono stati notati in relazione alla capacità del fulvo ad allattare dopo la raccolta del latte.
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Representative Results
Mouse
Dai nostri esperimenti, abbiamo determinato che è possibile raccogliere circa 100-400 ml di latte da un topo di laboratorio, dipendenti da diverse variabili. Queste variabili includono 1) la quantità di tempo dedicato per la raccolta, 2) la dose di ossitocina somministrata, 3) quanti cuccioli la diga è attualmente infermieristica e 4) la quantità di tempo dopo il parto. I nostri studi hanno dimostrato che il rendimento massimo si ottiene quando le dighe sono separati dalla loro progenie per almeno 2 ore, e almeno 45 minuti a un'ora viene accantonata per topo per la mungitura. I volumi di latte massime sono state raccolte 8-12 giorni dopo il parto con 2 UI / kg di ossitocina. I nostri risultati sono per lo più in accordo con altri studi dove la dimensione cucciolata era positivamente correlata con il latte resa 9 (vedi figura 3).
Muntjac
Sebbene la quantità di latte haracquisito dal muntjac era variabile da un giorno all'altro, siamo stati in grado di raccogliere da 5 a 30 ml di latte / dam / session, a seconda della anestesia utilizzata e / o tempo di post parto. Cervi muntjac sono polyestrous; latte può essere raccolto in vari momenti durante tutto l'anno 2 (cfr. tabella 1). Doe Midazolam indotta rimase sotto anestesia per un minimo di 10 min, consentendo collezioni di volumi più piccoli (in genere 5-30 ml), che doe BAM indotta sostenuto un periodo più lungo di effetto anestetico (20-30 min), che permette l'espressione latte completo (15-130 ml). Collezioni di latte sono stati sospesi quando il latte non era più prodotta in quantità sufficienti per la cerva, e il cerbiatto corrispondente è stato di essere nutriti con una dieta di foraggio per lo più fieno.
Figura 1. (A) La diga217; s capezzoli diventano gonfie di latte alla iniezione di ossitocina (B) Raccolta del latte proveniente da una diga anestetizzato con un P-200 Pipetman (C) espulsione del latte in un 1,2 ml esageratamente...
Figura 2. Muntjac latte viene raccolto in un tubo da 15 ml.
Figura 3. Produzione di latte approssimativamente raccolti da topi in base alle dimensioni del disordine, e l'età dei cuccioli.
Tabella 1. Milk collezione inizio e fine per allattamento dighe muntjac Reeves '.
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Discussion
Mouse
Ci sono diversi fattori da prendere in considerazione durante la raccolta del latte da un mouse, di cui 1) la quantità di tempo dedicato per la raccolta, 2) la dose di ossitocina somministrata, 3) quanti cuccioli la diga è attualmente infermieristica e 4) l'importo di tempo che è trascorso da quando parto al momento della raccolta. Utilizzando gli studi precedenti come linee guida, abbiamo deciso di ottimizzare le condizioni per la produzione di latte.
Precedenti ricerche hanno direttamente correlata la produzione di latte con la dimensione cucciolata 8. Purtroppo, dimensione lettiera è una variabile che non può essere controllato. Tuttavia, il tempo di mungitura dopo il parto può essere controllato. Secondo La secrezione massima latte Laboratorio mouse è a 8-10 giorni dopo il parto 9. La nostra esperienza è in congruenza con questa affermazione.
E 'stato dimostrato che l'ossitocina svolge un ruolo insostituibile nel latte di post produzioneparto 10. Dosi di ossitocina che vanno da 0,1 UI / kg 9-4 UI / kg 6 sono stati segnalati per la raccolta del latte da roditori 6,7,9. Abbiamo iniziato il nostro studio somministrando la dose minima suggerita, 0,1 UI / kg 9. Utilizzando questo dosaggio, la quantità di latte prodotto dal mouse era troppo piccolo per misurare o raccogliere. All'aumentare della dose ossitocina per 2 UI / kg 6,7, produzione di latte era notevolmente superiore ad approssimativamente 120 ml. Perché abbiamo voluto utilizzare il dosaggio più basso di ossitocina per raggiungere raccolta del latte ottimale, non abbiamo somministrare dosi superiori a 2 UI / kg.
La produzione di latte dipende anche dalla quantità di tempo dedicato per la raccolta. Abbiamo stabilito che è necessario per la raccolta ottimale hr-2 per i cuccioli devono essere separati dalla diga e 1 ora per la preparazione del materiale e la raccolta un minimo di 3 ore. Raccolta del latte da diverse dighe in una sessione diminuirà il tempo complessivo necessario perraccogliere un volume specifico di latte, cioè 2 hr per separare cuccioli, 30 min a materiali di installazione e 20-30 min per raccogliere il latte di ciascuna diga. Ogni diga deve essere monitorato fino a quando sono svegli, prima di essere immessi di nuovo con i loro cuccioli. Abbiamo notato che più tempo di mettere da parte per la mungitura porta alla produzione di latte più elevati, perché il mouse può essere munta fino a quando non riprende conoscenza.
Le istanze si presentano con i modelli animali che interesserà la produzione di latte. Un problema comune è la presenza di sangue o essudato nel latte delle dighe più vecchi che sono stati allevati ripetutamente e hanno grandi cucciolate, o nelle dighe che allattano la loro prima cucciolata. In questo caso, vi consigliamo di interrompere la raccolta del latte da quel particolare capezzolo. Si consiglia di cambiare puntali in questo momento, e scartare qualsiasi essudato o di sangue.
I ricercatori che svolgono questo metodo dovrebbe anche essere consapevoli che, come spesso accade quando si utilizzano modelli animali, i risultati variano (Figura3). Se un meno quantità ottimale di latte viene raccolto in una sessione, è preferibile ripetere la procedura in un secondo momento (ad esempio 24-48) piuttosto che alterare le condizioni sperimentali per forza di sgancio latte.
Muntjac
Il volume di latte proveniente da dighe muntjac Reeves 'dipendeva l'anestetico utilizzato. Il nostro anestetico iniziale di scelta era midazolam. Midazolam fornito sedazione sufficiente per consentire di ritenuta per brevi periodi di tempo, cioè, se R1 aveva una disposizione calma e potrebbe mantenere la calma muntjac, R2 potrebbe assumere mungitura per aumentare la resa prima del muntjac sveglierà, la sicurezza e il comfort di entrambi animale e handler sono della massima importanza e abbiamo abbandonato lo sforzo di mungitura se ci siamo sentiti sia stato compromesso. Abbiamo scoperto che muntjac doe rapidamente diventare tollerante a midazolam e che dosi più elevate sarebbero necessari dopo l'esposizione ripetuta, rendendo raccolta del latte due volte a settimana sempre più difficile.
La carenza di midazolam, accoppiato con una tolleranza edificio, ci ha portato a ricercare un anestetico alternativo. Una miscela di Butorphanol, Azaperone e Medetomadine (BAM) è effettivamente utilizzato per l'immobilizzazione di coda bianca cervo 11. Nelle nostre mani, il cocktail BAM disponibile anestesia sufficienti per consentire la raccolta di volumi accettabili di latte in modo sicuro, con meno tolleranza al farmaco dopo uso ripetuto, e con migliore controllo nel neutralizzare gli effetti dell'anestetico.
Alcune dighe muntjac sofferto di mammelle sensibili e / o erano primipare. Questi muntjac sviluppato lividi sui capezzoli durante il processo di mungitura, e il flusso di latte rallentato o fermato completamente, ci spinge a sospendere la sessione in corso. In questo caso, si dovrebbe utilizzare una tecnica di mungitura più dolce nel tentativo di evitare disagi o ecchimosi nei capezzoli.
e_content "> La produzione di latte è sembrato crescere e calare in diverse occasioni. raccolti lattiero-caseari a basso possono essere causati da 1) i cerbiatti che hanno allattato poco prima di collezioni o 2) una diminuzione della produzione di latte a causa del naturale processo di fulvo svezzamento.Mentre può essere un processo cercando di ottenere un volume considerevole di latte di piccoli modelli animali, il nostro lavoro dimostra che è davvero una possibilità per mouse e modelli muntjac; né richiede una vasta abilità né tasche profonde, semplicemente perseveranza.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials—Mouse | |||
| Ketamine (KetaVed 100 mg/ml) (dose: 80-100 mg/kg) | MWI/Vedco | 011075 | |
| Xylazine (TranquiVed 100 mg/ml) (dose: 5-10 mg/kg) | MWI/Vedco | NADA 139236 | |
| Eye lubricant | MWI/Apexa | 701013 | |
| Oxytocin (2 IU/kg) | Vet One | 501013 | |
| Materials—Muntjac | |||
| Midazolam (1-2 mg/kg) | Amerisource Bergen Drug Corp | 924326 | Optional: researcher can either use Midazolam on its own or BAM combination as an anesthetic |
| Butorphanol tartrate (Torbugesic) (0.45 mg/kg) | Fort Dodge Animal Health | NADA 135-780 | |
| Azaperone tartrate (0.25 mg/kg) | ZooPharm | ||
| Medetomadine HCl (0.07 mg/kg) | ZooPharm | ||
| Antipamezol hydrochloride (Antisedan) (dose: 0.25 mg/kg) | Orion Corporation | NADA 141-033 | |
| Oxytocin (10 IU/kg) | Vet One | 501013 | |
| Equipment—Mouse | |||
| P-200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μl pipette tips | Light Labs | B-2004-SH | |
| 1 ml syringes | MWI | 005427 | |
| 27 G needles | MWI | 002031 | |
| Equipment—Muntjac | |||
| 15 ml conical tubes | VWR | 21008-918 | |
| 22 G needles | MWI | 873 | |
| 3 ml luer lock syringes | MWI | 001377 | |
References
- Dueling, S. Muntiacus reevesi. Animal Diversity Web. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Muntiacus_reevesi (2004).
- Pei, K., Taber, R., O'Gara, B., Wang, Y. Breeding cycle of the Formosan Reeves muntjac (Muntiacus reevesi micrurus) in northern Taiwan, Republic of China. Mammalia. 59 (2), 223-228 (1995).
- Browning, S. R. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J. Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
- Van de perre, P. Transfer of antibody via mother's milk. Vaccine. 21 (24), 3374-3376 (2003).
- Maden, C. Genetically modified mice produce human milk protein. BioNews. , (2009).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab. Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- Depeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
- Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: effects of litter size and lactation. 84 (1), 127-133 (1986).
- Hedrich, H. J., Bullock, G. R. The laboratory mouse. , 735-736 (2004).
- Nishimori, K., Young, L. J., Guo, Q., Wang, Z., Insel, T. R., Matzuk, M. M. Oxytocin is required for nursing but is not essential for parturition or reproductive behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (21), 11699-11704 (1996).
- Miller, B. F., Osborn, D. A., Lance, W. R., Howze, M. M., Warren, R. J., Miller, K. V. Butorphanol-azaperone-medetomidine for immobilization of captive white-tailed deer. 45 (2), 457-467 (2009).
