Summary
Cette vidéo montre une stratégie simple et fiable pour la préparation de cultures pures de cellules endothéliales de cerveau antérieur embryonnaire dans les 10-12 jours et sera utile pour la recherche axée sur de nombreux aspects de l'angiogenèse cérébrale.
Abstract
Cellules endothéliales du cerveau embryonnaires peuvent servir comme un outil important dans l'étude de l'angiogenèse et le développement neuro-vasculaire et les interactions. Les deux réseaux vasculaires du cerveau antérieur embryonnaire, la pie-mère et périventriculaire, sont distinctes dans l'espace et avoir des origines différentes et des modèles de croissance. Les cellules endotheliales à partir des réseaux vasculaires et la pie-mère périventriculaires ont des profils uniques d'expression génique et les fonctions. Nous présentons ici un protocole étape par étape pour l'isolement, la culture, et la vérification des populations pures de cellules endothéliales à partir du réseau vasculaire périventriculaire (PVECs) du cerveau antérieur embryonnaire (télencéphale). Dans cette approche, le télencéphale dépourvue de membrane pial obtenu à partir de 15 jours embryonnaires de souris est hachée, une digestion avec de la collagénase / dispase, et on disperse mécaniquement dans une suspension cellulaire unique. PVECs sont purifiés à partir de la suspension cellulaire en utilisant une sélection positive avec l'anticorps conjugué à anti-CD-31/PECAM-1 microbilles en utilisant une forte magnétiqueProcédé de séparation. Des cellules purifiées sont cultivées sur collagène 1 boîtes de culture revêtues dans endothéliale milieu de culture de cellules jusqu'à confluence, et en outre en subculture. PVECs obtenu avec ce protocole exposition pavé et en forme de fuseau phénotypes, comme visualisé par microscopie optique à contraste de phase et microscopie de fluorescence. Pureté des cultures Pvec a été créée avec des marqueurs de cellules endothéliales. Dans nos mains, cette méthode fiable et cohérente donne des populations pures de PVECs. Ce protocole bénéficiera des études visant à obtenir un aperçu mécanistes dans le cerveau antérieur angiogenèse, la compréhension des interactions de Pvec et croisées des entretiens avec les types de cellules neuronales et détient un énorme potentiel pour l'angiogenèse thérapeutique.
Introduction
L'angiogenèse, la neurogenèse et la migration neuronale sont des événements critiques dans le système nerveux central (SNC) le développement, la réparation et la régénération. Plusieurs études ont montré que les élégantes cellules endothéliales stimulent la prolifération neuronale et vice-versa grâce à la libération de facteurs solubles et par contact direct. Nous avons trouvé curieux que dans la majorité de ces études 1-3, tandis que progéniteurs neuronaux / cellules souches neurales sont isolées du cerveau embryonnaire, ils sont co-cultivées avec des cellules endothéliales de cerveau de l'adulte, d'autres sources de tissu adulte, ou avec des lignées de cellules endothéliales. Cela peut être dû à des difficultés techniques associées à l'isolement et la mise en culture des populations pures de cellules endothéliales de cerveau embryonnaire en partie. Cependant, l'angiogenèse, la neurogenèse, la migration neuronale et sont des événements simultanés qui se produisent dans des ordres de grandeur plus robuste dans le cerveau embryonnaire que dans le cerveau d'un adulte normal. Le réseau vasculaire périventriculaire du embryonic cerveau antérieur (télencéphale) provient d'un navire situé dans le ganglion basal ébauche et se développe sous la forme d'un gradient ordonnée de ventral à dorsal télencéphale par jour embryonnaire 11 (E11) 4,5. Ce plexus de vaisseaux du réseau vasculaire périventriculaire se distinguent des vaisseaux pie-mère basée sur les origines, la localisation anatomique, les modèles de croissance, et la régulation du développement 4,5. La direction de propagation du gradient de l'angiogenèse périventriculaire correspond à la pente transversale neurogenetic télencéphalique. Au sein du télencéphale, le gradient de l'angiogenèse périventriculaire et le gradient de migration des neurones GABA chevauchent tangentiellement dans l'espace ainsi 6. En ce qui concerne la synchronisation, le gradient de l'angiogenèse est l'avance de la pente et de GABA neurone neurogenetic gradient d'environ un jour. Ainsi, les cellules endothéliales périventriculaires sont spatialement et temporellement bien placés pour fournir des indices essentiels pour soutenir la neurogenèse et télencéphaliqueneuronale 4,6 de migration. Par conséquent, l'utilisation des cellules endothéliales périventriculaires embryonnaires dans des expériences de co-culture avec des progéniteurs et / ou des neurones neurones fournirait un modèle plus favorable pour l'étude des interactions neurovasculaires et le développement de nouvelles voies pour le traitement de maladies neurodégénératives ou une lésion cérébrale ischémique / traumatique.
Nous insistons sur l'importance d'éliminer la membrane pial, non seulement pour limiter la contamination des cellules épithéliales, mais aussi pour séparer les cellules endothéliales pie-mère qui sont moléculairement et fonctionnellement distincte de cellules endothéliales du réseau vasculaire périventriculaire 4,6 (de PVECs appelés à distinguer de la pie-mère EC) . Ici, nous décrivons la méthode que nous utilisons régulièrement dans notre laboratoire pour obtenir un rendement riche et pur de PVECs. Ces cellules endothéliales sont préparés à partir forebrains embryonnaires isolées à partir d'un simple clic de souris chronométrée enceinte. Ils peuvent être complétés, en sous-culture, et on les congèle avec succès vers le bas pour une utilisation future.
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Protocol
Une. Préparation des réactifs et solutions
- Revêtement de 35 mm boîte de culture: Le collagène de type 1 est fournie comme solution une solution aqueuse à 20 mM d'acide acétique (~ 100 mg de protéine / fiole). Diluer un volume approprié de solution de collagène à une concentration de travail de 0,01% en utilisant une culture tissulaire stérile eau de qualité. plats Manteau avec 1 ml de solution de collagène pour 3-4 heures à température ambiante (RT) ou 37 ° C, ou une nuit à 2-8 ° C. Enlever l'excédent de la boîte enduit et laisser sécher pendant la nuit. Rincer le plat avec de l'eau de qualité de culture de tissus ou de PBS avant d'ajouter les médias. Boîtes revêtues peuvent être stockés à 4 ° C pendant un mois.
- Préparer milieu Eagle modifié par Dulbecco complet (DMEM). Compléter le DMEM (500 ml) avec 10% de FBS et de solution antibiotique-antimycotique (concentration de 1x; une ml/100 ml). DMEM complet peut être stocké à 4 ° C pendant deux mois.
- Préparer une partie aliquote (50 ml) de DMEM avec de la DNase I (0,001 mg / ml), (dénommé DMEM-DNase I).
- Préparer une autre partie aliquote (10 ml) de DMEM avec de la collagénase et de la dispase (1 mg / ml) (dénommé DMEM-collagenase/dispase).
- Préparer des cellules endothéliales milieu de culture (ECCM, 500 ml), supplémenté avec de l'EGF (5 ng), ECGS (100 mg) et 5 ul de solution d'antibiotique-antimycotique. ECCM peut être stocké à 4 ° C pendant deux mois.
- Préchauffer tous les médias avant de l'utiliser.
- Préparer le tampon de purification: PBS, pH 7,2 avec 0,5% de BSA et 2 mM d'EDTA. Gardez tampon froid (2-8 ° C).
2. Suppression des embryons et dissection de Télencéphale
Toutes les expériences utilisant des animaux de laboratoire sont approuvés par les soins des animaux et de l'utilisation des comités de l'hôpital McLean et sont conformes aux directives du NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.
- Utilisez la souris CD1 enceintes chronométrés (jour embryonnaire 15). Le jour de la découverte du bouchon vaginal est considéré comme jour embryonnaire 0 (E0). CD1 barrages produisent généralement de grandes portées, de sorte 10-12 embryons sont attendus à partir d'un barrage enceinte.
- Pour hystérotomie, anesthésier les souris enceintes avec une injection intrapéritonéale de kétamine (100 mg / kg) / xylazine (5 mg / kg). Pour les souris d'environ 20-30 g, livrer 0,3 ml d'une solution anesthésique 10 ml / kg de kétamine / xylazine et veiller à ce que la douleur et la détresse est minime lors des injections intra-péritonéales de l'anesthésie. Faire preuve de retenue à la main pour les injections.
- Vérifiez anesthésie profonde par pincement de l'orteil. Retirer des embryons de souris profondément anesthésiés. Décapiter chaque embryon immédiatement après son retrait de la mère. Placez les têtes embryonnaires dans des plats de Pétri dans glacée PBS.
- Suivez l'hystérectomie par euthanasie immédiate avec surdose d'un anesthésique (130 mg / kg de pentobarbital, ip), une méthode d'euthanasie, qui est conforme aux lignes directrices de l'AVMA sur l'euthanasie des animaux: 2013 Edition.
- Sous un microscope stéréo, retirez le cerveau de la tête avec des ciseaux à micropointes fines et une pince fine. Remarque: Une dissection de haute qualitéion est indispensable pour réussir à éliminer la membrane pial du cerveau embryonnaire. Ceci est réalisé en pratique. Une pince fine et ciseaux à micropointes sont également des outils essentiels pour obtenir un bon dissection.
- Utilisez la pince pour obtenir une prise ferme sur le cerveau et les ciseaux à micropointes à décoller la membrane pial. Retirez le mésencéphale et métencéphale et isoler le télencéphale. Transfert télencéphale pial-libre de tous les embryons à une boîte de culture de 35 mm avec 2 ml de PBS dans la glace.
3. Cellule d'isolement
- Hacher le télencéphale en fragments de 1 à 2 mm avec une lame de scalpel et recueillir le tissu dans un tube Falcon de 15 ml contenant 2 ml de DMEM complet.
- Dissocier le tissu doucement mais à fond avec une pipette de 1 ml jusqu'à touffes disparaissent et une suspension laiteuse est atteint.
- Centrifugeuse dissocié les cellules à 800-1000 g pendant 5 min à température ambiante.
- Retirez délicatement le surnageant et remettre le culot dans du DMEM-DNase I. doucement dissocier la CElls nouveau en utilisant pipette de 1 ml et centrifuger à 800-1000 g pendant 5 min à température ambiante.
- Reprendre le culot dans du DMEM chaud complet. cellules de filtrer à travers un maillage de 70 um Nylon stérile. Recueillir des cellules filtrées et garder dans la glace.
- Recueillir les cellules-parties retenues sur le maillage et digérer plus loin avec DMEM-collagenase/dispase (2 ml) pendant 1-2 min à température ambiante. Laver les cellules 3 fois dans du milieu DMEM-DNase I par centrifugation à 800-1000 g pendant 5 min à température ambiante. Commun de ces cellules avec les cellules filtrées recueillies à l'étape 3.5. Laver les cellules une fois avec le total DMEM complet. Passez à déterminer le nombre de cellules et des mesures d'étiquetage magnétiques. Remarque: Il est important pour obtenir une suspension à cellule unique avant le marquage magnétique.
4. Étiquetage magnétique
- Ce protocole indique le marquage magnétique de 10 7 cellules. Pour le nombre de cellules inférieur à 10 7, utilisent le même volume de réactif et pour le nombre de cellules de plus de 10 7, à l'échelle de tous les volumes de réactifs et le total des volumesen conséquence (par exemple pour 2 x 10 7 cellules totales, utiliser deux fois le volume de tous les réactifs indiqués). Conservez tous les réactifs et les cellules dans la glace.
- Déterminer le nombre de cellules avec un hémocytomètre.
- Centrifugeuse suspension de cellules à 300 g pendant 10 min à température ambiante. Aspirer le surnageant complètement.
- Ajouter μl/10 90 7 cellules de tampon de purification pour le culot de cellules, suivie par 10 ul de microbilles CD31. Les microbilles fournies par le fabricant sont conjugués à l'anticorps monoclonal anti-CD31 de souris.
- Bien mélanger et incuber pendant 15 min au réfrigérateur. Remarque: Des températures plus élevées et / ou un plus long temps d'incubation pendant marquage magnétique peut entraîner la liaison non spécifique.
- Laver les cellules par addition de 2.1 ml/10 7 cellules de tampon de purification et centrifuger à 300 g pendant 10 min. Enlever les cellules du surnageant et remettre en suspension dans 500 ul de tampon de purification. Procéder à une séparation magnétique ou étape de purification.
5. Purification
- Placez MS colonne dans le champ magnétique de MACS Separator.
- Rincer la colonne avec 500 ul de tampon de purification.
- Appliquer une suspension de cellules dans la colonne. Chargez nombre approprié de cellules de MS colonne le nombre de cellules plus élevée peut obstruer la colonne. Attention: Chaque colonne MS peut accueillir un maximum de 2 x 10 7 cellules, pour un nombre de cellules plus élevée, utiliser plusieurs colonnes.
- Recueillir et jetez accréditives contenant des cellules non marquées.
- Laver la colonne avec 500 ul de tampon de purification trois fois. Au cours des étapes de lavage, assurez-vous que le réservoir de la colonne est vide avant addition de quantités de tampons de purification ultérieures.
- Supprimer colonne du séparateur MACS et le placer sur un tube Falcon de 15 ml.
- Un plongeur est fourni avec la colonne MS. Pipette 1 ml de tampon de purification sur la colonne MS et rincer immédiatement les cellules marquées magnétiquement en poussant fermement le piston dans la colonne.
- Plaque cells sur une boîte de culture de 35 mm pré-revêtu avec du collagène de type 1 et cultiver des cellules dans CCME dans un incubateur réglé à 37 ° C avec 95% d'O 2 et 5% de CO 2.
- Changer le milieu tous les quatre jours. Utilisez PVECs pour des expériences ou sous-culture après 10-12 jours lorsque le plat est confluent.
6. Subculture de PV ECS
- Retirez le CCME et rincer la monocouche de PVECS avec 1-2 ml de PBS stérile.
- Ajouter lentement 1,5 ml de solution à 0,25% de trypsine-EDTA pour couvrir la monocouche cellulaire.
- Remettre le plat dans l'incubateur. Dans 5-7 min, les cellules se détacher de la surface de la boîte.
- Après que les cellules ont détaché, ajouter immédiatement un volume égal d'inhibiteur de la trypsine et on triture plusieurs fois.
- Transférer les cellules dans un tube de 15 ml de Falcon stérile. Centrifuger le tube à 500 g pendant 5 min.
- Enlever le surnageant et remettre le culot dans 1 ml de préchauffé CCME.
- Ensemencer les cellules d'expansion de la culture, imvieillissement ou d'autres dosages.
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Representative Results
La caractérisation phénotypique des PVECs du jour 1-12 est représenté par microscopie optique à contraste de phase (Figure 2). Les cellules fixées à l'antenne le jour 1 montrent une morphologie caractéristique de la division cellulaire (figure 2A). Entre 5-8 jours, PVECs transition de galets de pierre à la broche en forme de morphologie typique des cellules endothéliales et plus proche de son état in vivo (figures 2B et 2C). Par jour 12 de la culture PVEC réalise pleinement confluence (figure 2D). PVECs peuvent être repiquées facilement d'étendre la colonie (figures 2E-G). Pureté des cultures de cellules endothéliales a été créée avec des marqueurs de cellules endothéliales - isolectine B4, CD-31/PECAM-1, facteur de von Willebrand (FvW) et VE-cadhérine et était déterminé à être à cent pour cent, après la sous-culture (figures 2H-K).
Images à fort grossissement de PVECs préparés à partir d'embryons CD1 ainsi que TieEmbryons 2-GFP 4 (dont cellules endothéliales expriment la GFP) sont représentées (figure 3). En plus de la commune et pavé en forme de fuseau morphologies (figures 3A-C), morphologies polygonales avec des processus minces ont également été observées dans isolectine B4 marqué et Tie-2-GFP + ve PVECs (figures 3D et 3E). Dans certains de nos revêtues de collagène des boîtes de culture (en l'absence de Matrigel), PVECs formées motifs en treillis ressemblant à la caractéristique unique du réseau périventriculaire vivo dans vasculaire (figure 3F). Cela reflète le potentiel angiogénique élevé de PVECs. Un dosage de l'angiogenèse a été réalisée dans laquelle PVECs (2 x 10 4 cellules) ont été ajoutés à des boîtes de culture revêtues d'une matrice de Matrigel. PVECs ont montré la formation du tube robuste dans 18 heures (figure 3G). Ces résultats fournissent des preuves solides que ce système peut être utilisé comme un modèle in vitro de cellules endothéliales in. PVECs isoléesà partir d'embryons CD1 peut être marqué rapidement avec des nanocristaux Qdot (figure 3H) qui offrent fluorescence intense stable dans le cytoplasme des cellules vivantes et peuvent être utilisés pour des études à long terme de PVECs vivants, y compris les migrations, la mobilité, la morphologie, les dosages cellulaires fonctionnent comme ainsi que des expériences in vivo. PVECs peuvent être transfectées avec des traceurs cellulaires comme Lumière cellule plasma membrane-DP, BacMam 2.0 (figure 3I) selon les instructions du fabricant pour une visualisation claire de la morphologie des cellules vivantes dans des expériences d'imagerie cellulaire.
On a cultivé PVECs non seulement dans ECCM, mais aussi dans un milieu de cerveau de rat endothélial de croissance de cellules (RBECGM) et un milieu de DMEM F12. Tant contraste de phase (figures 4A, 4C, 4E et) et isolectine B4 étiquetés images (figures 4B, 4D et 4F) de PVECs cultivées dans CCME (figures 4A et 4B), RBECGM (figures 4C et
Figure 1. Schéma d'isolement PVEC. Le protocole utilisé pour l'isolement et la purification de PVECs du télencéphale embryonnaire est résumée dans un schéma. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 2. La caractérisation phénotypique des PVECs. (AG) des images à contraste de phase de culture PVEC à différents points de temps après placage. (A) la culture de PVEC le jour 1. Les cellules ont attaché et montrer morphologies division. (B) la culture de PVEC au jour 5 et (C) le jour 8 transition de pavé à la broche forme morphologie. (D) PVEC culture confluence le jour 12 atteint. (E) PVECs après subculture le jour 1, (F) jour 5 (G (HJ) Immunomarquage de PVECs utilisant des marqueurs de cellules endothéliales: isolectine B4 (H), le facteur von Willebrand (I), CD31/PECAM (J) et VE-cadhérine (K). Barres d'échelle: A, 100 um (s'applique BJ), K, 50 um. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 3. Morphologies de PVECs. (AE) des images à fort grossissement de isolectine B4 marqué et Tie-2-GFP + ve PVECs montrant pavée et fusiforme morphologie (AC) ainsi que la morphologie polygonale avec de longues extensions minces (D, E). (<strong> F) PVECs montrent un potentiel angiogénique riche en boîte de culture, même en l'absence de Matrigel. (G) montrent PVECs robuste formation de tubes dans un test d'angiogenèse sur Matrigel. (H) PVECs marqués par des nanocristaux Qdot. (I) PVECs transfectées avec Lumière cellule plasma membrane-DP, BacMam 2.0. Barres d'échelle: A, 50 um, B, 15 pm (CE s'applique), F, 100 um (s'applique G, H), I, 50 um. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 4. PVECs cultivées dans différents milieux de culture spectacle variante morphologie. (
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Discussion
Pvec de sont physiologiquement plus pertinent que les cellules endothéliales cérébrales adultes et EC provenant d'autres sources de tissus pour des études portant sur les interactions neurovasculaires et avoir un potentiel thérapeutique aussi. Pour la préparation PVEC, il est essentiel début à la dissection de travailler rapidement pour obtenir une bonne viabilité puisque les cellules mortes peuvent se lier de manière non spécifique à microbilles CD31. En outre, si la suspension à cellule unique n'est pas atteint avant l'étape de marquage magnétique, cela se traduira par dépannage depuis amas de cellules se bouchent la colonne. Un avantage de cette méthode est qu'il n'y a pas besoin d'une incubation avec de la trypsine pour détacher les cellules des billes magnétiques, une étape fastidieuse et souvent difficile utilisée dans d'autres procédés de séparation magnétique à base de billes pour des préparations EC 4,7. En outre, cette technique d'isolation ne nécessite pas de grandes quantités de tissu de cerveau embryonnaire. PVEC de peut être toujours préparé avec l'utilisation d'un simple clic de souris enceinte chronométré en approximately 12 jours, en sous-culture, et utilisé dans une grande variété d'in vitro et in vivo.
La pureté de PVECs après isolement est supérieure à 90%, mais la pureté de PVECs après la sous-culture est de 100%. En plus des cellules endotheliales, PECAM-1 est trouvé sur la surface de monocytes / macrophages. La microglie, la population de macrophages du système nerveux central est cependant très faible dans le cerveau de souris embryonnaire par rapport aux postnatale ou le cerveau adulte 8. Monocytes / microglie besoin milieu supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal et les facteurs de croissance spécifiques pour se développer, ils mourront éventuellement dans CCME et ne durera pas après la sous-culture de PVECs. Lorsque 100% PVECs pures sont nécessaires immédiatement après l'isolement (par exemple, pour tester l'expression des gènes), on utilise le tri cellulaire activé par fluorescence méthode (FACS). PVECs sont ensuite isolés à partir d'embryons Tie2GFP (où seules les cellules endothéliales expriment la GFP) et rigoureusement triés par double analyse FACS. La pureté de l'endothélium triéecellules de l sont assurées par la collecte de cellules qui sont en double positif pour la GFP et CD31/PECAM-1 6.
Les cultures sont étroitement observés dans la première semaine de l'isolement de la contamination de types cellulaires comme les péricytes. Etant donné que les cellules de péricytes sont de forme irrégulière et ne seront jamais former une monocouche confluente à la différence des cellules endotheliales qui se composent de forme de fuseau ou polygonales, cellules mises en contact sous forme de colonies qui se développent, elles sont faciles à reconnaître si elle est présente. Si la contamination des péricytes est détectée, une concentration plus faible de la trypsine (0,05%) suivie par une procédure de traitement à la trypsine rapide (2-3 min) est utilisée pour la sous-culture de PVECs. Péricytes nécessitent un temps de traitement à la trypsine prolongée (7-10 min) et resteront attachés. En outre, l'efficacité de placage de péricytes trypsine (le cas échéant) est très pauvre. Ces mesures éliminent la contamination pericyte et veiller à ce que PVECs repiqués sont pures.
Le milieu ECCM est un milieu de sérum à faible teneur en hydrocortisone,héparine et 2% de sérum de veau fœtal et est complétée avec facteur de croissance épidermique (EGF) et croissance cellulaire endothéliale Supplément (GEC). PVECs cultivées dans CCME ont montré broche morphologie en forme cohérente. Le cerveau de rat ECGM contient 10% de sérum bovin foetal, des facteurs de croissance, et le VEGF. PVECs cultivées dans ce milieu ont des morphologies très allongées et prennent plus de temps pour atteindre la confluence. Le milieu DMEM-F12 est complété avec 10% de sérum de veau fœtal, et GlutaMAX supplément de croissance des cellules endotheliales et il induit la prolifération de plus que les autres médias. Bien PVECs cultivées dans ce milieu ont connu une croissance très rapide et la confluence atteint en 4 jours, leurs morphologies sont plat ou polygonale. Nous avons grandi dans PVECs CCME jusqu'à trois passages sans perte de phénotype et la fonction. Par conséquent, CCME est le moyen que nous préférons pour la culture PVEC.
PVECs co-cultivés avec des précurseurs neuronaux par ce protocole sont susceptibles de stimuler la neurogenèse et la migration neuronale à far-plus étendues que les cellules endothéliales du cerveau adulte ou provenant d'autres sources et peuvent être utiles pour aider la récupération de la fonction neurologique en attaque, une lésion cérébrale traumatique ou la neurodégénérescence. Précurseurs neuronales transplantées dans le cerveau adulte ont souvent été rapportés à caler et de ne pas migrer dans les régions qui nécessitent de nouveaux neurones. Ce problème est pris en compte à l'absence de substrats qui facilitent la migration neuronale comme guides gliales radiales 9. Vasculaire est de plus en plus apprécié en tant que substrats pour la migration neuronale 6,10,11. PVECs peuvent offrir une solution pour ces précurseurs neuronaux impasse sur les sites de transplantation. Coimplantation de PVECs et les neurones dans des régions du cerveau endommagées peut faciliter la migration des neurones guidée par les cellules endothéliales et les aider à atteindre la récupération fonctionnelle. L'association étroite de cellules endothéliales avec les neurones migrent rend également particulièrement bien adapté pour fournir des facteurs de croissance et morphogènes directement et sélectivement dansla migration des neurones.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une Alliance nationale pour la recherche sur la schizophrénie et la dépression (NARSAD) Prix du jeune chercheur et les Instituts nationaux de la Santé accorder R01NS073635 AV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNase I | Sigma | D-4527 | |
| Collagen, Type 1 solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| DPBS | Quality Biologicals | 114057-131 | |
| EDTA | Fisher Scientific | M4055 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| MS column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| CD31 microbeads | Miltenyi Biotech | 130-097-418 | |
| MACS separator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Bioscience | 352350 | |
| Antibiotic and antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| 35 mm Culture dish | BD Bioscience | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352097 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352098 | |
| ECCM kit | BD Bioscience | 355054 | Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF, and Soybean Trypsin Inhibitor |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Bioscience | 354006 | |
| RBECGM | Cell Applications | R819-500 | |
| DMEM F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 305050-061 | |
| Tissue culture grade water | Life Technologies | 15230162 | |
| 0.25% Trypsin | Life Technologies | 15050 | |
| Soybean trypsin inhibitor | BD Bioscience | 5425 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Life Technologies | Q25021 | |
| CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0 | Life Technologies | C10608 | |
| Biotinylated Isolectin B4 antibody | Sigma | L2140 | |
| Anti-Von Willebrand factor | Sigma | F3520 | |
| Anti-CD31/PECAM-1 | BD Pharmingen | 550274 | |
| VECTASHIELD Hardset Mounting Media with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Ketamine | Butler Schein Animal Health Supply | 44028 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 1009 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Inverted microscope | Olympus CK-40 | CK-40 | |
| Fluorescent microscope | Olympus FSX-100 | FSX-100 | |
| Fine forceps | Roboz Surgical Instrument | 7 inox | |
| Fine microtip scissors | Roboz Surgical Instrument | RS5611 |
References
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