蛍光<em&gt;その場での</emウイルスと植物及び昆虫組織における共生細菌の局在化のための&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

サマリー

ここではin situハイブリダイゼーションの単純な蛍光（FISH）昆虫や植物組織中のウイルスや細菌の局在のための方法を説明します。このプロトコルは、全体のマウントおよび顕微鏡用切片におけるmRNAの可視化のために拡張することができます。

要約

in situハイブリダイゼーション （FISH） の蛍光は、一般に、真核細胞における遺伝子転写産物を可視化し、さらに、ウイルスや細菌による感染などの細胞内の他のコンポーネントを視覚化するために修飾することができるために使用される技術の様々に与えられた名称である。空間的局在および感染プロセス中のウイルスや細菌の可視化は、様々な刺激に応答してそのようなマイクロアレイおよびRNAseqとして発現プロファイリング実験を補完する重要なステップです。これらの試薬を用いた時空間の感染症を理解することは、細胞成分との相互作用を理解することを目的とした生物学的な実験を補完するものです。このようなレポーター遺伝子システムまたは免疫組織化学的方法などのウイルスおよび細菌を視覚化するためのいくつかの技術は時間がかかり、そしていくつかはモデル生物で動作し、複雑な方法論を含むよう限定される。細胞内のRNAまたはDNA種を対象としたFISHは比較的容易で、速い私です遺伝子の時空間局在を研究するための診断目的のためにTHOD。この方法は、堅牢でプロトコルは高価ではありません短いダイズ、商業的に購入したプローブを用いた場合に実施するのが比較的簡単にすることができます。試料調製、固定、ハイブリダイゼーション、および顕微鏡的視覚化は、複雑な工程を含まない場合に特に強固である。ここでは、昆虫や植物組織中の細菌やウイルスの局在化のためのプロトコルを記述します。この方法は、その5 'または3'末端に蛍光色素に結合させ20塩基対の短いDNAプローブを用いた簡単な準備、固定、および昆虫ホールマウントし、解剖し臓器や手作りの植物切片のハイブリダイゼーションに基づいています。このプロトコルは、正常昆虫および植物組織の数に適用されており、細胞内のmRNAもしくは他のRNAまたはDNA種の発現を分析するために使用することができる。

概要

それらの感染植物宿主と共に植物ウイルスおよび他の病原体の間の相互作用を研究するとき、それらはそれらの宿主に悪影響を引き起こすかどうかにかかわらず、 その場での病原体及びそれらのそれぞれの核酸を可視化することが重要である。植物細胞内病原体との間の動きを研究する場合に最も重要である。病原体の遺伝子産物のin situ局在化において病原性プロセスを研究するための他のアプローチを補完する重要なステップである。多くの植物病原体、特にウイルスは、それらのベクトルとの複合体との親密な相互作用を持つ、昆虫によって送信される。そのベクターでは、これらのウイルスの局在は、伝送のための経路、およびベクトル内部の可能な相互作用部位を研究するために重要である。いくつかの昆虫ベクトル化植物ウイルスの送信は、これらの昆虫内に存在する共生細菌によって助けられる。よりよいこれらの植物ウイルスBの送信を研究するために、yは、それらのベクターは、それは、特に、一般的な共生細菌およびウイルス伝播に関与するものを視覚化することも重要である。ウイルスや共生細菌の共局在は、このように彼らの昆虫宿主内でこれらの生物間の可能性のある関係を調査のために望ましい。脇にウイルスを送信してから、共生細菌が昆虫のベクターの生物学のいくつかの側面に影響を与え、昆虫内でのこれらの細菌のこのような空間局在は、高い関心と重要である。

トマト黄化葉巻ウイルス （TYLCV....

プロトコル

1。 FISH解析のための一般的なコナジラミ、プラント、およびウイルス調製

1. リアBとQバイオタイプ綿の苗（ ワタヒルスツム L.品種不動明王）にコナジラミおよび25±2℃、相対湿度60％の標準的な条件下で防虫ケージと成長室の内部で維持し、14時間の明/ 10時間暗の光。
2. 前に説明した^15〜19のように細胞内共生特異的プライマーを用いて内部共生の感染をテストするためにPCRを行う。
3. 商用保育園や植物トマトの種子からトマトの苗（ ナスエスクレンタムビーフステーキ）を購入。
4. 植物はTYLCV ¹⁵のコナジラミ媒介接種に最も適した年齢は（セクションの下に4.1を参照）、4真葉期に達するまで、上記と同様の飼育条件で維持する。

2。遠藤昆虫処理、固定、プローブ設計、ハイブリダイゼーション、および可視化共生FISH

1. 綿植物からの吸引により10大人のコナジラミを収集、または綿の葉から10 ^第 3または^第 4齢幼虫を選ぶ。
2. すぐにエッペンドルフチュー​​ブ内部のカルノア固定液（クロロホルム - エタノール - 氷酢酸、6時03分01秒、体積/体積）に浸す。一晩に2時間（好ましくは一晩）を修正しました。
3. 完全に固定....

結果

この原稿で研究システムは、 図1に示されており、TYLCVに感染した植物は、成人およびコナジラミBのニンフが含まれているコナジラミ、昆虫におけるTYLCV転のための経路を示すコナジラミの内部解剖図2は 、一次共生生物Portieraと二次共生生物Arsenophonusのための大人のコナジラミに二重魚を示しています。図3は、PortieraとHamiltonella二重魚を示しており、 図4は Portieraとリケッチア、Bの両方の図のための二重の魚を示していますコナジラミ ^第 4齢ニンフ図5コナジラミ解剖し、中腸内TYLCV及びDAPI染色のために魚を示し、 図6を解剖コナジラミ原発唾液腺におけるT.......

ディスカッション

その具体的なコナジラミホストでの植物宿主と昆虫ベクターにおける植物ウイルスの局在のためにここで説明するプロトコル、および共生細菌は、植物であっても動物組織内の他のウイルスの局在に適応させることができる。さらに、プロトコルは、植物および動物系において共生および病原性細菌および他の微生物を局在化するために使用することができる。記載された方法は、短い、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドDNAプローブと細胞中の標的DNAまたはRNA分子間のハイブリダイゼーションの単純な概念に依存する。結果は、最小バックグラウンドを持つ特異的ハイブリダイゼーション、および蛍光または共焦点顕微鏡を用いて検出する信号である。複数の遺伝子を標的異なる蛍光色素を持ついくつかのプローブは、同時に使用することができる。これは、単一の細胞または組織内の複数の標的を可視化が可能となる。これらのプロトコルに記載の手順は簡単であり、試料処理時間最小限に抑えられます。このような高いバックグラウンド信号など、他のプロトコル、長い処理時間と検体の分析のための多数の、高価な材料の使用に関連する問題は、ここに記載のプロトコルに制約されない。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
蛍光ラベル プローブ	Metabion	20 bp HPLC 精製	シーケンス 顧客によって設計
トルイジンブルー	Sigma-Aldrich	89640
ドデシル硫酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	L3771	分子生物学グレード
ホルムアミド	Sigma-Aldrich	F9037	分子生物学グレード
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941	分子生物学グレード
氷酢酸	Sigma-Aldrich	320099	分子生物学グレード
液体ブロッカー	Ted Pella Inc.	22309

されました