Мы описываем здесь простой флуоресценции в гибридизация (FISH) метод локализации вирусов и бактерий в насекомых и растительных тканей. Этот протокол может быть продлен для визуализации мРНК в целом горе и срезах.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Флуоресценции в гибридизация (FISH) является имя, данное различными методами, обычно используемых для визуализации генных транскриптов в эукариотических клетках и могут быть дополнительно модифицированы, чтобы визуализировать другие компоненты в клетке, такие как инфекции с вирусами и бактериями. Пространственная локализация и визуализация вирусов и бактерий во время инфекционного процесса является важным шагом, который дополняет профилирование экспрессии эксперименты, такие как микрочипы и RNAseq в ответ на различные стимулы. Понимание пространственно-временных инфекции с этими агентами дополняет биологические эксперименты, направленные на понимание их взаимодействия с клеточными компонентами. Несколько методов для визуализации вирусы и бактерии, такие как системы гена-репортера или иммуногистохимических способов отнимают много времени, а некоторые ограничены работать с модельных организмов и включают сложные методики. РЫБЫ, что цели РНК или ДНК видов в клетке является относительно легко и быстро меняТПК для изучения пространственно-временной локализации генов и для диагностических целей. Этот метод может быть надежными и относительно легко реализовать, когда протоколы используют короткий гибридизации, коммерчески-приобретенные зондов, которые не являются дорогими. Это особенно надежной, когда пробоподготовка, фиксация, гибридизация и микроскопическая визуализация не связано с рядом сложных шагов. Здесь мы опишем протокол для локализации бактерий и вирусов в насекомых и растительных тканей. Метод основан на простого приготовления, фиксации и гибридизации насекомых тотальных препаратов и рассеченных органов или ручной частей установки, с 20 пар оснований короткие ДНК-зонды, конъюгированные с флуоресцентных красителей на их 5'-или 3'-концами. Этот протокол был успешно применен к ряду насекомых и растительных тканей, и могут быть использованы для анализа экспрессии мРНК или других РНК или ДНК видов в клетке.
Введение
При изучении взаимодействия между растительных вирусов и других патогенов с их зараженных растений хозяев, важно, чтобы визуализировать патогены и их соответствующих нуклеиновых кислот в месте, независимо ли они вызывать отрицательные эффекты на их хозяев. Это особенно важно при изучении движения патогена внутри и между клеток растений. В месте локализации генных продуктов возбудителя является важным шагом, который дополняет другие подходы к изучению процесса патогенности. Многие патогены растений, особенно вирусы, передаются насекомыми, имеющие сложные и интимные взаимодействия с их переносчиков. Локализация этих вирусов в их векторов имеет важное ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Генеральный белокрылка, завод, и вирусов Подготовка к FISH анализа
- Задняя B и Q биотипа белокрылки на хлопковых рассады (Gossypium Hirsutum Л. резюме. Ачала) и поддержания внутри насекомых-доказательство клетках и комнат роста при стандартных условиях 25 ± 2 ° C, относительной влажности 60%, и 14-ч света / 10-ч темноты фотопериода.
- Выполните ПЦР для проверки инфекции с эндосимбионтов использованием эндосимбионта-специфических праймеров, как описано выше 15-19.
- Покупка рассады томатов (Solanum Esculentum резюме. Бифштекс) с коммерческой детской или семена томатов растений.
- Поддержание в ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Система учился в этой рукописи показано на рисунке 1 и включает зараженный растение с TYLCV, взрослый и нимфу белокрылки B. tabaci, а внутренняя анатомия белокрылки, показывая путь к TYLCV транслокации в насекомое. Рисунок 2 показывает двойной рыбы во взрослой белокрылки для первичной симбионта Portiera и вторичной симбионта Arsenophonus. Рисунок 3 показывает двойной рыбы для Portiera и Hamiltonella, и Рисунок 4
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол, описанный здесь для локализации вируса растений в ее растения-хозяина и вектора насекомых, и эндосимбиотических бактерий в их конкретном узле белокрылки, могут быть адаптированы для локализации других вирусов в растениях и даже в животных тканях. Кроме того, протокол может быть использован для локализации эндосимбиотических и патогенные бактерии и другие микроорганизмы в растительных и животных систем. Описанные методы основаны на простой концепции гибридизации между короткой, флуоресцентно-меченного олигонукл.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
не Исследования в лаборатории Ганим поддержали исследовательского гранта не. 908-42.12/2006 от немецко-израильского фонда (МФП), грант №. IS-4062-07 от Соединенных Штатов-Израиль Двусторонней сельскохозяйственных исследований и развития фонда (бард), и исследовательский грант не. 884/07 от Израиля Science Foundation (ISF), чтобы МГ
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Флуоресцентная маркировка Зонды | Metabion | 20 bp ВЭЖХ очищенные | Последовательность разработана заказчиком |
| Толуидин синий | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Додецилсульфат натрия | Sigma-Aldrich | L3771 | Молекулярная биология |
| Класс Формамид | Sigma-Aldrich | F9037 | Молекулярная биология Класс |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | Молекулярная биология Класс |
| Ледяная уксусная кислота | Сигма-Олдрич | 320099 | Молекулярная биология |
| Гидроблокатор | Тед Пелла Инк. | No 22309 |
Ссылки
- Czosnek, H., Laterrot, H. A worldwide survey of Tomato yellow leaf curl viruses. Arch. Virol. 142, 1391-1406 (1997).
- Ling, K. S., Simmons, A. M., Hassell, R. L., Keinath, A. P., Polston, J. E. First report of Tomato Yellow Leaf Curl Virus in South Carolina. Plant Dis. 90, 37....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
