Il circuito di alimentazione in Drosophila melanogaster larve propone un modello semplice ma potente che consente modifiche del tasso di alimentazione per essere correlati con alterazioni della circuiti neurali stomatogastric. Questo circuito è composto di neuroni serotoninergici centrali che inviano proiezioni ai ganci bocca e foregut.
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Articolo metodologico
Analisi funzionale del circuito di alimentazione larvale in Drosophila
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il circuito di alimentazione serotoninergico in Drosophila melanogaster larve può essere usato per studiare substrati neuronali di importanza critica durante lo sviluppo del circuito. Utilizzando l'uscita funzionale del circuito di alimentazione, modifiche della struttura neuronale del sistema stomatogastric può essere visualizzata. Comportamento alimentare può essere registrato osservando il tasso di retrazione dei ganci bocca, che ricevono innervazione dal cervello. Comportamento locomotorio viene utilizzato come controllo fisiologico per l'alimentazione, poiché larve utilizzare loro bocca ganci attraversare le un substrato di agar. Cambiamenti nel comportamento alimentare possono essere correlati con l'architettura assonale dei neuriti innervano l'intestino. Usando immunoistochimica è possibile visualizzare e quantificare questi cambiamenti. L'uso improprio delle larve durante paradigmi di comportamento in grado di alterare i dati in quanto sono molto sensibili alle manipolazioni. La corretta rappresentazione dell'architettura neurite innervanol'intestino è critico per la quantificazione precisa del numero e delle dimensioni delle varici nonché l'entità di nodi ramo. Analisi della maggior parte dei circuiti consentono solo per la visualizzazione di architettura neurite o effetti comportamentali, tuttavia, questo modello permette di correlare l'uscita funzionale del circuito con menomazioni dell'architettura neuronale.
Introduzione
Drosophila è estremamente potente sistema modello per lo studio dello sviluppo del circuito neurale a causa di tempi rapidi generazione, a basso costo sperimentale, e la capacità di manipolare e controllare i fattori genetici e ambientali. Neurogenesi, constatazione percorso neuronale e la sinaptogenesi sono conservati tra l'uomo e Drosophila, quindi i meccanismi di creazione, il mantenimento e la modifica dei circuiti neurali sono conservati pure.
Neurotrasmettitori, come la serotonina (5-idrossitriptamina, o 5-HT) possono servire come fattori di crescita prima di adottare il loro ruolo di molecole di segnalazione nel maturo circuito neurale 1-3 Studi precedenti hanno dimostrato che perturbato livelli di 5-HT durante l'embriogenesi alterare la connettività dei neuroni maturi 4. Altri hanno dimostrato che l'applicazione ectopica di 5-HT a neuroni in coltura Helisoma reprimere neuriti e sinaptogenesi 5-7. In Drosophila, sviluppo livelli di 5-HT sono inversamente proporzionali al numero di varici e dimensione, nonché il grado di aborization, lungo la lunghezza dei neuriti sporgenti al foregut dal CNS 8.
Neurotrasmissione serotoninergica ha dimostrato di modulare i comportamenti alimentari di specie diverse, tra cui Drosophila 8-9. Il circuito di alimentazione in Drosophila è relativamente semplice circuito che può essere utilizzato come modello per correlare l'uscita funzionale (alimentazione) con alterazioni nello sviluppo delle proiezioni assonale dal cervello foregut. Schoofs et al. hanno dimostrato che larvale Drosophila è regolata da generatori di pattern centrali che influenzano la muscolatura 10. Mentre l'anatomia muscolare specifico non è completamente compreso, è stato dimostrato che il nervo antenne, nervo mascellare, e prothoracic nervo accessorio sono responsabili dei bersagli muscolari coinvolte nellacomportamento alimentare. La maggior parte dei dati che coinvolgono la muscolatura e del nervo anatomia di alimentazione invertebrato è limitata a Calliphora larve.
Il tasso di alimentazione del secondo larve instar può essere valutato retrazione delle scleriti cephalopharyngeal (ganci bocca), ed è riproducibile e high-throughput. Le piastre cephalopharyngeal sono innervati da fibre di centrali neuroni 5-HT attraverso il nervo frontale. Il proventricolo, o foregut, è innervato da fibre serotoninergici (Recurrens del nervo) che fasciculate nel midgut e sono responsabili per la contrazione del foregut (Figura 1), 11-12. Cambiamenti nella ramificazione assonale, e il numero e le dimensioni delle varici lungo la lunghezza dei neuriti, possono essere quantizzati utilizzando tecniche immunoistochimiche. Manipolazione neuronale 5-HT durante lo sviluppo, direttamente o indirettamente, può modificare la potenza funzionale di questo circuito di alimentazione, che può essere valutato e correlata con i cambiamenti nel morphology dell'architettura neurite.
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Protocollo
1. Manutenzione delle Gabbie Popolazione
- Mantenere gabbie popolazione a 25 ° C con un ciclo luce-buio 12 hr. Fintanto che i gruppi di controllo e sperimentali sono esposti alle stesse condizioni di illuminazione, allora questa tecnica può essere eseguita in un ambiente di laboratorio standard.
- Consentire femmine depongono le uova durante la notte su piastre di agar succo di mela.
- Raccogliere le larve neonate mantenendo piatti con le uova appena depositate a 25 ° C per 24 ore. Mettere un piccolo ciuffo di lievito nel centro della piastra per attirare le larve tratteggiata.
- Raccogliere 1 ° instar larve che hanno migrato nel lievito in pasta nel centro della piastra di succo di mela. Utilizzare una spatola metallica per trasferirla a un piatto di succo di mela fresco. Ulteriori lievito in pasta può essere aggiunto a garantire il cibo adeguato finché vengono eseguiti i test. Piastre di succo d'uva possono essere utilizzati anche al posto delle lastre di succo di mela.
- Ottenere in ritardo 2 °-inizio 3 ° instar larvae consentendo il 1 ° stadi di età per 40-48 ore. All'interno di questo campo le tariffe di alimentazione sono costanti 13. Età può essere confermata con l'esame dei ganci bocca in quanto vi sono cambiamenti distinti in questa struttura ad ogni muta larvale.
- Tardo 2 °-inizio 3 ° instar larve vengono raccolti per analisi di comportamento delicatamente e ampiamente lavaggio piatti succo di mela con acqua e raccogliere le larve su un filtro a rete. Le larve sono poi trasferiti ad una piastra di agar.
- Tutte le analisi vengono eseguite in parallelo utilizzando controllo e animali da esperimento.
2. Paradigm Behavioral - Locomotion
- Posizionare un singolo 3 ° larva su un substrato di agar 2% in un piatto di coltura tissutale di 100 mm e consentono la larva acclimatare per 30 sec. Le larve usare i loro scleriti cephalopharyngeal (ganci bocca) per spingere i loro corpi attraverso la superficie del substrato agar. Questo viene fatto su un piatto a parte, perché it è più difficile da visualizzare le contrazioni del corpo nella soluzione lievito come l'animale è quasi lo stesso colore del lievito.
- Osservare e registrare ogni posteriormente al movimento anteriore sopra il substrato per un periodo di 1 min. n = 20 per ogni genotipo. Non più di 10 animali dovrebbero essere testati per piastra.
3. Comportamento Paradigm - Alimentazione
- Uso blunt Inox # 5 pinzette, trasferire accuratamente il 3 ° larva dalla piastra locomotore agar al centro di una piastra di agar-riempite sovrapposti con 5 ml di soluzione di lievito 2% del panettiere attivato. Assicurarsi che la soluzione sia omogenea come il lievito si depositerà nel tempo. Quando nella soluzione di lievito, larve in gran parte mantenute e mangimi, facilitando l'osservazione del comportamento. Il tasso di bocca contrazioni gancio direttamente correlata con la quantità di cibo ingerito 14.
- Lasciare larva di ambientarsi per 30 sec.
- Osservare e registrare il numero dibocca contrazioni gancio per un periodo di 1 min. n = 20 per ogni genotipo.
4. Dissezioni Gut larvali
- Fare una soluzione di fissaggio di formaldeide al 4% EM-grade in 1x tampone fosfato salino (PBS) e mettere in un bicchiere posto a 3-bene.
- Sezionare con attenzione vagando tardi 3 ° instar budella larvali in un piatto di vetro 3-bene usando la soluzione 1x PBS, assicurandosi che ogni volta che proventricolo è lasciata intatta. Con una pinza, tenere l'estremità posteriore, e con l'altra, tenere i ganci bocca. Tenendo l'immobile estremità posteriore, tirare delicatamente i ganci bocca per accedere alle budella. Rimuovere eventuali relativi tessuti (ghiandole salivari, al cervello, corpo grasso, ecc), quindi trasferire ogni intestino al piatto 3-pozzetto contenente la correzione di formaldeide. Vagando 3 ° instar larva vengono utilizzati perché in questa fase di sviluppo, la larva cessa di alimentazione in preparazione per pupariation, e proventricolo viene cancellata di lievito.
- Incubare coraggio a 4 ° C per una notte in una scatola di coltura di tessuti opachi.
- Prima di rimuovere la soluzione di fissazione di formaldeide dai pozzi, rimuovere il caeca gastrica e agganciare il midgut ~ 150 micron 2 dal proventricolo in modo che le proiezioni possono essere chiaramente visualizzate senza impedimenti.
- Rimuovere formaldeide correzione dai pozzetti e sostituirla con 1x PBT (1x PBS, 0,1% privo di proteasi albumina di siero bovino, 0,1% Triton X-100) soluzione tampone. Lavare accuratamente le budella 6x per 10 min in 1x PBT. Mettere campioni di tessuto su un rotatore meccanico, mentre facendo lavaggi.
- Incubare a 4 ° C per 1 ora a 10 -6 M 5-HT che permettono di migliorare serotonina. Lavare accuratamente le budella 6x per 10 min in 1x PBT. Studi precedenti hanno dimostrato che questa concentrazione di esogeno 5-HT non influisce architettura neuronale o densità varici in analisi immunoistochimica e semplicemente migliora il rapporto segnale-rumore 15-16.
- Incubare a 4 &# 176; C durante la notte in anti-serotonina anticorpo primario (monoclonale cresciuto a mouse o policlonali in coniglio). Lavare accuratamente le budella 6x per 10 min in 1x PBT. Mettere campioni di tessuto su un rotatore meccanico, mentre facendo lavaggi.
- Incubare a 4 ° C per 90 min in anticorpo secondario (Alexa Fluor 568 IgG di capra anti-topo o anti-coniglio; 1:400 diluizione). Lavare accuratamente le budella 6x per 10 min in 1x PBT. Mettere campioni di tessuto su un rotatore meccanico, mentre facendo lavaggi.
- Incubare a 4 mM di carbonato di sodio per 10 minuti su un agitatore rotante, quindi montare in 4% n-propile gallate/20 mM di carbonato di sodio, e vista in fluorescenza. Carbonato di sodio è usato per convertire i campioni al tampone e pH utilizzato nei mezzi di montaggio.
- Cattura immagini di campioni di tessuto immunostained a 400X per l'analisi.
5. Analisi dei circuiti neurali
- Fibre neurite sono stati quantificati (numero e dimensioni delle varicie grado di ramificazione) utilizzando Neuroleucida e Neuroexplorer. Tuttavia, questo può anche essere effettuata manualmente o utilizzando semplici neuriti Tracer (una applicazione che può essere scaricato online gratuito).
- Tracciare le singole proiezioni fibra dal cervello al proventricolo e quantificare il numero varici, le filiali e il numero di grandi varicosità per unità di lunghezza. Le fibre assonali sporgenti dal cervello vengono raggruppati nel nervo Recurrens e non sono accessibili per l'analisi fino a raggiungere proventricolo dove si separano e fasciculate.
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Risultati
Il circuito di alimentazione serotoninergico nella larva Drosophila può servire come un modello estremamente efficace per osservare l'influenza di fattori particolari sullo sviluppo del sistema nervoso. Con quantificazione tasso di alimentazione, è possibile collegare l'architettura assonale del circuito di alimentazione con la sua uscita funzionale (Figura 1). Il dosaggio locomotore viene utilizzato come controllo fisiologico per le retrazioni dei ganci bocca, poiché larve utilizzare l...
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Discussione
Sviluppo aberrante del circuito stomatogastric serotoninergico, che si verifica durante la tarda embriogenesi, influenzerà la sua funzione maturo. Modifiche della struttura neurite innervano l'intestino può essere correlato con l'uscita funzionale del circuito, che sta alimentando tasso (misurato dalla bocca contrazioni gancio in una soluzione di lievito) (Figura 1). L'utilizzo del sistema bipartito UAS-GAL4 in Drosophila permette di indirizzare specificamente up-o down-regolato esp...
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Research Fund del Presidente da Saint Louis University assegnato a WSN
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Eclipse E-800 Microscopio | Nikon Instruments | ||
| Neuroleucida | MBF Biosciences | NL-15 | Utilizzato per analizzare l'architettura delle fibre intestinali, non è necessario disporre del |
| software di imaging Northern Eclipse | Empix Inc | ||
| G-2E/C TRITC EX 528-553 | Nikon Instruments | 96312 | Filtro per anticorpi |
| secondari specificiN.A. 0,75; L.D. 0,72 mm; Prisma DIC: 40xI, 40x I-C; | Nikon Instruments | caricato a molla MRH00400 | Obiettivo utilizzato per l'imaging |
| Simple Neurite Tracer | NIH Immagine J | http://fiji.sc/Simple_Neurite_Tracer |
Riferimenti
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