Summary
PCR in combinatie met hoge-resolutie smelt analyse (HRMA) wordt aangetoond als een snelle en efficiënte methode om zebravis genotype.
Abstract
Zebravis is een krachtig gewerveld modelsysteem voor het bestuderen van de ontwikkeling, ziekte modelleren en uitvoeren drug screening. Onlangs zijn ingevoerd verschillende genetische hulpmiddelen, waaronder meerdere strategieën voor het induceren mutaties en transgene lijnen. Echter, grootschalige screening beperkt door genotypering traditionele methoden, die tijdrovend en arbeidsintensief zijn. Hier beschrijven we een techniek om zebravis genotypen door PCR in combinatie met hoge-resolutie smeltende analyse (HRMA) te analyseren. Deze aanpak is snel, gevoelig en goedkoop, met een lager risico van besmetting artefacten. Genotypering door PCR met HRMA kan worden voor embryo's en volwassen vis, met inbegrip van hoog-protocollen.
Introduction
Zebravis (Danio rerio) is een gewerveld dier modelsysteem op grote schaal gebruikt voor onderzoek naar ontwikkeling en ziekte modellering. Onlangs hebben talrijke transgene en mutatie technologieën ontwikkeld voor zebravis. Snelle transgenese technieken, meestal gebaseerd op een Tol2 transposon systeem 1, zijn gecombineerd met verbeterde klonen opties voor meerdere DNA-fragment assembly 2. Zinkvinger nucleasen (ZFNs) en transcriptie activator-achtige effector nucleasen (Talens) zijn gebruikt om loci richten zowel somatische en kiemlijn cellen in zebravis 3,4. Deze technieken kunnen efficiënt genereren van genetisch gemodificeerde dieren, met een hoge frequentie mutatie creatie en kiem-lijn transmissie 3,4.
Ondanks deze vooruitgang, traditionele genotypering technieken in zebravis beperken de volledige kracht van de mutagenese en transgenese gereedschappen. PCR gevolgd door gelelektroforese, soms gecombineerd met BEPERKINGEn enzymdigestie, wordt veel gebruikt om genoom modificatie detecteren, maar is tijdrovend en minder gevoelig voor kleine inserties of deleties identificeren. TaqMan probe assays hebben hoge initiële kosten en vereisen een zorgvuldige optimalisatie. Sequencing van PCR-producten kan enkele dagen duren en is niet praktisch voor grootschalige screening. Restrictie fragment lengte polymorfisme (RFLP) analyse kan alleen onderscheid SNP's die een beperkt aantal restrictie-enzym herkenningsplaatsen.
Hoge-resolutie smeltpunt analyse (HRMA), een gesloten buis na PCR analysemethode, is een recent ontwikkelde methode die snelle, gevoelige, goedkoop en vatbaar voor het screenen van grote aantallen monsters. HRMA kan worden gebruikt om SNPs, mutaties en transgenen 5-7 detecteren. HRMA is gebaseerd op thermische denaturatie van dubbelstrengs DNA, en elke PCR-amplicon een unieke dissociatie (smelt) karakteristiek 5. Monsters kunnen worden gediscrimineerd te wijten to hun verschillende nucleotide samenstelling GC inhoud of diepte, typisch in combinatie met een fluorescente kleurstof die alleen bindt dubbelstrengs DNA 8. Aldus kan HRMA verschillende genotypen onderscheiden op basis van de verschillende smelt-curve karakteristieken. Omdat HRMA gebruikt goedkope reagentia en is een stap na PCR-proces kan worden gebruikt voor high-throughput strategieën. HRMA wordt destructief, dus na de analyse van de PCR amplicons worden gebruikt voor andere toepassingen. HRMA is toegepast in vele organismen en systemen, waaronder cellijnen, muizen en mensen 9-11. Het gebruik ervan is onlangs in de zebravis is beschreven dat mutaties veroorzaakt door zinc finger nucleases (ZFNs) Talens en 6,12,13 detecteren.
In dit artikel beschrijven we hoe de PCR-gebaseerde HRMA voeren in embryonale en volwassen zebravissen (figuur 1). Dit protocol is geschikt voor het detecteren van SNPs, transgenen en mutaties, zoals single veranderingen baseparen, inserties of deleties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. DNA Voorbereiding
- Bereid DNA lysis buffer: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3% Tween 20, 0,3% NP40. Voeg frisse Proteinase K tot een eindconcentratie van 1 mg / ml op de dag van gebruik 12.
- Tissue collectie:
- Voor volwassen vis fin clip:
- Verdoven vis: Leg de vis in 0.004% MS-222 (tricaïne) oplossing. Wacht tot kieuw beweging vertraagt.
- Leg vis op een stapel van 5-10 Kimwipes en snijd een klein stukje van de staartvin, ongeveer 2-3 mm, met een steriel scheermesje.
- Plaats snel de vis in een gemerkte reservoir met vers water is voor invordering; zorgvuldig label zowel de tank en de bijbehorende buis die de vin clip zal bevatten. Ververs het water en om de andere dag de vissen voeren.
- Pak de vin clip met een steriele pipet en breng het in een buis gevuld met 100 ul DNA lysebuffer.
- Gooi de pipet tip, en het scheermesje weggooien in een naaldcontainer.
- Voor embryo staart clip:
- Plaats embryo's in 0.004% MS-222 (tricaïne) oplossing. Wacht 2 min.
- Knip een stuk van de staart met een tang onder een dissectie microscoop.
- Doe de staart in een gemerkte buis gevuld met 30 pi DNA lysebuffer.
- Zet snel het embryo in een buis met 100 pi 4% paraformaldehyde.
- Label buizen met embryo's en hun bijbehorende staart buizen.
- Bewaar de flesjes met embryo bij 4 ° C overnacht voor bevestiging.
- Reinig de tang met behulp van Milli-Q water en Kimwipes tussen elk embryo om besmetting te minimaliseren.
- Voor hele embryo's:
- Plaats embryo's in 0.004% MS-222 (tricaïne) oplossing. Wacht 2 min.
- Zet 1-5 embryo's in een buis gevuld met 100 ul DNA lysisbuffer. Dechorionation is niet noodzakelijk.
- Voor volwassen vis fin clip:
- DNA spijsvertering
Incubeer buizen met weefsel (vin of staart clips of embryo's) bij 55 ° Cgedurende 4 uur tot overnacht 12. - Inactiveren de Proteinase K
Warmte buizen 95 ° C gedurende 15 minuten 12. DNA worden gebruikt voor PCR direct of bewaard bij -20 ° C maximaal 3 maanden.
2. PCR
- Ontwerp Primers handmatig of primer design software (bijv. Lightscanner Primer Design Software-Biofire). PCR producten HRMA gewoonlijk 50-200 bp, PCR producten voor SNP detectie moet kleiner, kenmerkend 50-80 bp zijn.
- PCR
- Voer PCR-reactie in een 96 putjes of 384 putjes.
- Gebruik 10 pi totaal volume: 4 pi LightScanner master mix (0,1 U hot-start Taq-polymerase AB, buffer, 0,2 mM dNTPs, 2 mM magnesiumchloride en 1x TL dubbelstrengs-DNA-bindende kleurstof), 5 pmol van elke primer, en 1 pi genomische DNA template geëxtraheerd uit volwassen staartvin of 3 ul genomisch DNA uit embryonale staart 13.
- Cover monsters met 30 ui minerale olie. Bedek de plaat met een optisch-transparante lijm afdichting.
- Optimaliseer PCR fietsomstandigheden typische condities 95 ° C gedurende 5 min en 30 cycli van 10 sec bij 95 ° C, 25 seconden bij 60 ° C, 30 seconden bij 72 ° C, eindigend met 95 ° C gedurende 30 seconden en afgekoeld tot 15 ° C.
- Store PCR-platen bij 4 ° C of blijven, rechtstreeks dan HRMA.
- Bevestigen onze PCR-product door analyse van de grootte met behulp van agarosegelelektroforese tijdens de eerste optimalisering van PCR en als aangegeven door sequentiebepaling van het PCR-product.
3. HRMA
- Warmte platen
- Plaats plaat in een smelt analysesysteem.
- Open de software (LightScanner Software Call-IT 2.0).
- Warmte platen 60-95 ° C.
- Maak een nieuwe data-opslag-bestand.
- Analyseer HRMA data (figuur 2).
Meerdere stappen analyse mogelijk. We tonen de meest gebruikte set van gegevens manipulations.- Deelverzameling instelling
Klik op het tabblad subset. Selecteer de putjes monsters. - Normalisatie
- Selecteer het tabblad Normaliseren in het linkerpaneel. Fluorescentie variantie elimineren, handmatig de parallelle dubbele lijn in de pre-(initiële) positioneren en post (eind)-smelt regio's zoals afgebeeld (figuur 2C, pijlpunten) en normaliseren premelt en post-melt fluorescentie signalen van alle monsters op 1 en 0 respectievelijk 14.
- Pas de positie van de lijnen, zodat de smelt regio in het gebied tussen de pre-en post-smelt lijnen, maar niet geselecteerd. In het algemeen, de Tweede Min en Lower Max (en Upper Min en Upper Max) temperatuur lijnen moeten worden geplaatst ongeveer 1 ° C uit elkaar.
- Kies temperatuur posities voor normalisatie zodanig dat alle monsters maximale of volledige (100%) fluorescentie voor de premelt regio en minimale of geen (0%) fluorescentie voor de post-smelt regio (zo goed als mogelijklijk). Normalisatie moet resulteren in een bijna horizontale lijn op de maximale fluorescentie van 1 dat zich uitstrekt tot het smeltpunt en een bijna horizontale lijn van het smeltpunt bij de minimale fluorescentie van 0, er mag geen fluorescentie niveaus boven of onder 1 0 . Bijvoorbeeld, in figuur 2C, normaliseren voorsmelten krommen met temperaturen van 79-80 ° C.
- Groepering / Clustering
Onderscheid genotypes op basis van hun smelttemperatuur (figuur 2C, groene doos). Selecteer Groepering.- Selecteer Autogroup uit de lijst Standards selectie onder de sectie Groepering.
- Selecteer Normaal of Hoog voor het smelten van profielen met een enkele overgangen of meerdere overgangen respectievelijk uit de lijst Gevoeligheid selectie onder de sectie Groepering.
- Selecteer ComputeGroepen onder de sectie Groepering.
- Ga naar het menu Bestand en klik op Opslaan om de resultaten op te slaan.
- Deelverzameling instelling
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het protocol kan gedurende een dag worden uitgevoerd of gescheiden stappen over meerdere dagen (stroomdiagram van werk wordt getoond in Figuur 1). DNA-extractie wordt gevolgd door de smelt en analyse van PCR amplicons. De temperatuur van de smelt van het amplicon afhankelijk van de grootte en de GC inhoud, maar algemeen beginnen en eindigen temperatuur van 50 ˚ C en 95 ˚ C geschikt (Figuren 2A en 2B). Zodra de smelt wordt uitgevoerd, analyse van de fluorescentie smelt curven vereist meestal normalisatie van de variatie van de verschillende monster curves, met pre-en post-smelt gebieden als standaarden (figuur 2C). Dit verbetert vergelijking van de resultaten van verschillende monsters waarbij de variatie van de fluorescentie is gerelateerd aan kleine experimentele variaties. Elk paar temperatuur lijnen voor normalisatie zal ca. 1 ˚ C uit elkaar worden geplaatst (figuur 2C, pijlpunten)., Groepering van gegevens resultaten is vertegenwoordigd op twee verschillende manieren: een bovenste grafiek die smelt curve profielen toont, en een onderste grafiek dat een subtractieve verschil perceel in vergelijking met een referentie-monster (figuur 2D) toont.
HRMA analyse kan worden gebruikt om mutaties (Figuren 3A en 3B) of transgenen (Figuur 3C) detecteren. In figuur 3A, zijn twee verschillende mutaties in eif2b5 gen getoond (rood en blauw curven in figuur 3A) door het aftrekken van de genormaliseerde fluorescentie gegevens van het wildtype monster. Het maakt niet uit welk genotype gekozen referentie. Meer subtiele of verwarrende verschillen in smelt-curves kunnen worden onderscheiden door het gebruik van de subtractieve verschil plot. In figuur 3B, wordt een voorbeeld van vier verschillende genotypen in een verzameling van embryo's.
Figuur 1. Overzicht van protocol voor PCR gebaseerde HRMA zebravis genomisch DNA. DNA-extractie uit vol weefsel (fin-clip of embryo) gevolgd door PCR-amplificatie in aanwezigheid van een fluorescerend dubbelstrengs-DNA-bindende kleurstof. De PCR amplicon gedenatureerd en fluorescentie is opgetekend, gevolgd door smelt-curve analyse de amplicon te detecteren en / of genotypen onderscheiden.
Figuur 2. Screen-shots van software om HRMA presteren en resultaten te analyseren. A. B gele vakje wordt uitvergroot in de "B"; screenshot van LightScanner software.. Vergrote weergave van boxed regio in "A". Instellen van begin en einde Temp worden getoond (pijlen). C. Plaats de premelt en post-smelt parallelle lijnen voor normalisatie (pijlpunten). Merk de fluorescentie variantie in pre-en post-smelten gebieden (rood kader). Onderste grafiek (groene doos) toont smelt-curves afgeleid van de ruwe data plots na normalisatie. D. Bovenste grafiek laat smelten curve profielen na automatische groepering; verschillende genotypen zijn weergegeven in verschillende kleuren (rood kader). Onderste grafiek (groene doos) toont de fluorescentie verschil curve. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 3. Met behulp van HR. MA mutaties en transgenen identificeren Fluorescentie tijdsverschil krommen weergegeven, verandering in fluorescentie (Y-as) temperatuur (x-as) wordt getoond.. HRMA werd van vis die mutaties in het gen eif2b5 detecteren. Wild-type wordt weergegeven in grijs (pijl). Rode en blauwe kleuren vertegenwoordigen twee verschillende eif2b5 mutaties, bevestigd door sequencing van het PCR-product. B. Vier verschillende FoxP2 mutante allelen worden geïdentificeerd met HRMA. Rood: zc82 / + (8 bp schrapping), groen: zc83 / + (17 bp deletie), blauw: zc82/zc83 (8bp deletion/17bp schrapping), grijs. Zc83/zc83 (17bp schrapping homozygoten) C. Gal4 transgene vis (grijze curves) kunnen worden onderscheiden van wildtype (bruine kromme, pijl). Merk op dat voor transgene detectie, genormaliseerd zullen niet worden uitgevoerd. Klik hier voor grotere afbeelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PCR gecombineerd met HRMA is een krachtige technologie voor zebravis genotypering. De voordelen van deze benadering zijn snelheid, robuustheid en gevoeligheid voor zelfs puntmutaties te detecteren. De gehele protocol, van fin-clip te smelten-curve analyse kunnen worden in minder dan acht uur uitgevoerd door een enkel individu. Bovendien is de techniek vatbaar voor hoge-doorvoer screening, niet het gebruik van ethidium bromide vereist, en is afgesloten voor alle PCR en analysestappen die helpt minimaliseren verontreinigingsproblemen.
Een kritische stap voor deze techniek is PCR amplicon en primer design. Standaardlengte voor PCR-producten in HRMA is 50-200 bp. Korte amplicons verhogen de gevoeligheid en zijn ideaal voor het opsporen van single nucleotide veranderingen. Als smelt-curven van nauw verwante soorten PCR-product niet gemakkelijk te onderscheiden, kan een kleine oligonucleotide complementair aan de SNP en geblokkeerd op het 3 'uiteinde wordt opgenomen in de PCR reactie (Lunaprobes; probes). De probes worden gegenereerd door asymmetrische PCR met verschillende concentraties van de voorwaartse en achterwaartse primers met een 3 'C3 blocker sondeverlenging de daaropvolgende HRMA PCR voorkomen. De sonde wordt dan opgenomen in de HRMA PCR reactie. HRMA gebeurt dan met de probe, waarbij de asymmetrische probe bindt aan het PCR-product genereert en probe-doelwit duplexen met verschillende smelt curven die kunnen worden gebruikt om allelen te onderscheiden.
Verschillende bedrijven bieden smelt-curve analyse systemen. Deze omvatten de Biofire Lightscanner, de Roche LightcyclerVR 480 en de Qiagen Rotor-Gene Q. Verschillende TL, DNA-bindende kleurstoffen zijn beschikbaar, waaronder LC Groen PLUS en SYT09 EvaGreen. Er is enige variatie in gevoeligheid mutatie detectie gebaseerd op verschillende fluorescente kleurstoffen en smelt-curve machines 8,15. Nonsaturating kleurstoffen bijvoorbeeld SYBR Green I, zijn ongeschikt voor de meeste toepassingen HRMA: bij hoge concentraties SYBR Green I inhibitiets de activiteit van DNA-polymerase, en bij lagere concentraties, SYBR Green Ik kan niet precies smeltgedrag te meten als gevolg van de herverdeling van gesmolten regio's terug naar de regio's van dsDNA 16. In het algemeen de meeste bestaande Real Time PCR platforms zijn in staat preforming HRMA gebruik van een softwarepakket add-on en een tweede-generatie fluorescerende DNA-bindende kleurstof. Terwijl de technische details van de software en volgorde van experimentele stappen enigszins variëren tussen platforms, de algemene wetenschappelijke begrippen zijn in wezen identiek.
Ons laboratorium en anderen hebben aangetoond dat HRMA kan worden gebruikt in zowel embryonale en volwassen zebravis over transgenen detecteren en mutaties geïnduceerd door ZFNs en Talens 6,12,13. HRMA is gebruikt om polymorfismen ontdekken in zebravis 6,12. Ons laboratorium gebruikt HRMA zowel initiële screening van TALEN geïnduceerde mutaties en voor het sorteren van vast stramien (TSQ en JLB, ongepubliceerd). Andere potentiële applicationen die kunnen worden toegepast bij de zebravis bevatten methylatie-gevoelige HRMA (ms-HRMA) 17, kwantificatie van copy-nummer varianten 5, en het opsporen van ziekteverwekkers in vivariums 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken de leden van de Blaschke, Grunwald, en Wittwer labs voor advies en technische bijstand. Dit werk wordt ondersteund door de PCMC Foundation, NIH R01 MH092256 en DP2 MH100008, en de March of Dimes Foundation onderzoek subsidie # 1-FY13-425, naar JLB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com |
| Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com |
| 96-well LightScanner Instrument | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com |
| LightScanner Software with Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| High-resolution Melting Analysis 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| LightScanner Primer Design Software | BioFire | www.biofiredx.com | |
| Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | |
| Tricaine | |||
| Paraformaldehyde |
References
- Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Sander, J. D., Cade, L., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
- Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
- Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening. Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).
- Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8 (8), (2012).
- Liew, M., Pryor, R., et al. Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons. Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).
- Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes. Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).
- Carrillo, J., Martínez, P., et al. High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita. Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).
- Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping. PloS one. 7 (9), (2012).
- Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method. J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).
- Xing, L., Hoshijima, K., et al. Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding. PloS one. 7 (8), (2012).
- Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns. BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).
- Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping. Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).
- Wittwer, C. T. High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen. Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).
- Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples. BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).
- Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).
