Analizzando craniofacciale morfogenesi in Zebrafish Uso 4D Microscopia confocale

Summary

Time-lapse imaging confocale è una tecnica potente utile per caratterizzare sviluppo embrionale. Qui, descriviamo la metodologia e caratterizzare morfogenesi craniofacciale wild-type, così come PDGFRA, smad5, e SMO embrioni mutanti.

Abstract

Time-lapse imaging è una tecnica che permette l'osservazione diretta del processo di morfogenesi, o la generazione di forma. Grazie alla loro chiarezza e la riconducibilità alla manipolazione genetica ottica, l'embrione zebrafish è diventato un organismo modello popolare con cui eseguire l'analisi time-lapse della morfogenesi in embrioni viventi. Confocale di un embrione zebrafish vivo richiede che un tessuto di interesse è persistentemente marcata con un marcatore fluorescente, quale un transgene o colorante iniettato. Il processo richiede che l'embrione è anestetizzato e tenuto in posizione in modo tale che lo sviluppo sano procede normalmente. Parametri per l'imaging devono essere impostati per spiegare la crescita tridimensionale e di bilanciare le esigenze di risolvere singole cellule mentre ottenere rapidi snapshot di sviluppo. I nostri risultati dimostrano la capacità di eseguire a lungo termine imaging in vivo di embrioni di zebrafish fluorescenza etichettati e per rilevare vari comportamenti dei tessuti incresta neurale cranica che causano anomalie cranio-facciali. Ritardi nello sviluppo causati da anestesia e montaggio sono minime, e gli embrioni sono illesi dal processo. Embrioni Time-lapse impressi possono essere restituiti a mezzo liquido e successivamente ripreso o fissati ai punti successivi dello sviluppo. Con l'abbondanza crescente di linee di zebrafish transgenici e mappatura destino ben caratterizzato e tecniche di trapianto, l'imaging qualsiasi tessuto desiderato è possibile. Come tale, time-lapse imaging in vivo coniuga potentemente con metodi genetici zebrafish, comprese le analisi di embrioni mutanti e microiniettati.

Introduction

Morfogenesi craniofacciale è un complesso processo multi-step che richiede interazioni coordinate tra più tipi di cellule. La maggior parte dello scheletro craniofacciale è derivato da cellule della cresta neurale, molti dei quali devono migrare dal tubo neurale dorsale in strutture transitori chiamati archi faringei ^1. Come in molti tessuti, morfogenesi dello scheletro craniofacciale è più complicato che può essere compreso da immagini statiche di embrioni in punti temporali specifici dello sviluppo. Sebbene per funzionare richiede tempo, in vivo microscopia time-lapse fornisce un aspetto continuo a cellule e tessuti di un embrione di sviluppo. O....

Protocol

1. Zootecnia e mutante alleli

1. Sollevare e razza zebrafish come descritto ^21.
2. Zebrafish alleli mutanti utilizzati in questo studio sono stati PDGFRA ^{b1059 16, B1100} smad5 ^22, e SMO ^{B577 23.} Fonti per questi ceppi di zebrafish sono Zirc.

2. Preparazione di soluzioni e attrezzi

Nota: Tutte le soluzioni e gli strumenti possono essere fatte in anticipo e conservati per uso futuro.

1. Rendere i media embrione (EM), come descritto in precedenza ^21.
2. Fai 4 g / L MS-222 (Tricaine). Sciogliere 4 g di fosfato di sodio (Na <....

Results

In wild-type embrioni, seguendo la popolazione cresta neurale, gli archi faringei allungano lungo gli assi ventrali anteriori / posteriori e dorsali / mentre si muove in una direzione rostrale (Movie 1). A 30 ore dopo la fecondazione (HPF), la lunghezza anteriore / posteriore del primo arco faringeo è compreso tra 1,8-1,9 volte la sua dorsale / ventrale altezza. Dorsale / allungamento ventrale procede costantemente, più veloce di estensione anteriore / posteriore fino a 36,5 hpf. Da qui, dorsale / ventr.......

Discussion

Time-lapse microscopia confocale è un potente strumento per l'analisi dello sviluppo. Qui, dimostriamo l'utilità del metodo nello studio della faringe arco morfogenesi in zebrafish che sono mutante per vie di segnalazione importanti utilizzando un transgenici che le etichette cellule della cresta neurale. Oltre al livello del tessuto analisi, analisi lasso di tempo sono applicabili ad analisi su scala cellulare ²⁸ anche. Molti metodi di zebrafish ampiamente utilizzati possono anche essere incorporati .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Linea monofilamento di prova da 6 libbre	Cortland Line Company	SLB16
Agarosio I	Amresco	0710
Laser ad argon	LASOS Lasertechnik GmbH	LGN 3001
Cloruro di calcio	Sigma-Aldrich	C8106
Tubo capillare, 100 mm, 0,9 mm ID	FHC	30-31-0
Olio di chiodi di garofano	Hilltech Canada, Inc.	HB-102
Grasso per alto vuoto	Dow Corning	2021846-0807
Incubatore a bagno secco Isotemp	Fisher Scientific	2050FS
Microscopio a scansione laser	Carl Zeiss AG	LSM 710
Solfato di magnesio esaidrato	Sigma-Aldrich	230391
Vetro di copertura per microscopio, 22 x 22-1	Fisher Scientific	12-542-B
Vetro di copertura per microscopio, 24 x 60-1	Fisher Scientific	12-545-M
Cloruro di potassio	Fisher Scientific	M-11321
Fosfato di potassio bibasico	Sigma-Aldrich	P3786
Cloruro di sodio	Fisher Scientific	M-11624
Fosfato di sodio bibasico	Sigma-Aldrich	S7907
TempController 2000-2	PeCon GmbH
Tricaine-S	Western Chemical, Inc.