Summary
نقدم توليف هيدروجيل تقسيم بوساطة intein البروتين. اللبنات الأساسية لهذا هيدروجيل نوعان من بوليمرات البروتين تحتوي كل منها على حدة فرعية من البروتين مثلوثي التي هي بمثابة crosslinker ونصف من intein الانقسام. خلط اثنين من بوليمرات بروتين يطلق رد فعل عبر الربط intein، مما أسفر عن وحدة ببتيد تتحول ذاتيا إلى هيدروجيل. هذا هو غاية هيدروجيل درجة الحموضة ودرجة الحرارة مستقرة، ومتوافقة مع المذيبات العضوية، ويشتمل على البروتينات الكروية بسهولة وظيفية.
Abstract
نقدم تخليق البروتين هيدروجيل درجة عالية من الاستقرار بوساطة تقسيم المحفزة intein البروتين رد فعل عبر الربط. اللبنات الأساسية لهذا هيدروجيل نوعان من البروتين كتلة بوليمرات تحتوي كل منها على حدة فرعية من البروتين مثلوثي التي هي بمثابة crosslinker ونصف من intein الانقسام. يتم إدخال اللولب عشوائي ماء غاية في واحدة من كتلة بوليمرات لاحتباس الماء. خلط اثنين من بوليمرات كتلة البروتين يؤدي رد فعل عبر الربط intein، مما أسفر عن وحدة ببتيد مع crosslinkers إما في نهاية بسرعة أن تتحول ذاتيا إلى هيدروجيل. هذا هيدروجيل مستقرة جدا في ظل الظروف الحمضية والأساسية على حد سواء، في درجات حرارة تصل إلى 50 درجة مئوية، وفي المذيبات العضوية. هيدروجيل بسرعة بعد الإصلاحات التي يسببها تمزق القص. إدماج "الالتحام محطة الببتيد" في لبنة هيدروجيل تمكن من إدماج مريحة "بروتين الالتحام" الموسومة البروتينات المستهدفة.هيدروجيل متوافق مع وسائل الاعلام نمو زراعة الأنسجة، ويدعم نشر 20 كيلو دالتون جزيئات، وتمكن من تجميد البروتينات الكروية النشطة بيولوجيا. وقد تجلى تطبيق هيدروجيل البروتين بوساطة intein-بمثابة حفاز بيولوجي العضوية المذيبات متوافق عن طريق التغليف أنزيم البيروكسيداز الفجل ومؤيدة نشاطها.
Introduction
الهلاميات المائية مصنوع بالكامل من البروتينات تنطوي على إمكانية لتحقيق تقدم كبير حقول متنوعة مثل هندسة الأنسجة، والتسليم المخدرات وbiofabrication 1. أنها توفر مزايا أكثر من الهلاميات المائية الاصطناعية البوليمر التقليدية بما في ذلك توافق مع الحياة والقدرة على دعم noninvasively إدراج البروتينات الكروية النشطة بيولوجيا.
في هذا العمل، ونحن تصف وضع هيدروجيل البروتين الرواية شكلت عن طريق تقسيم بوساطة intein البروتين عبر الربط رد الفعل وتطبيقه كما سقالة البروتين الشلل (الشكل 1). اللبنات الأساسية لهذا هيدروجيل هما البروتين كتلة بوليمرات يتألف كل منها جزء أو N-C-محطة من انقسام intein (IN و IC) وحدة فرعية من البروتين crosslinker multimeric. تم استخدام DnaE intein من نوستوك punctiforme (NPU) كما الانقسام وintein 2،3 بروتين صغير مثلوثي (12 كيلو دالتون) CutA من Pyrococcus horikoshii <م /> وقد استخدم بوصفه 4،5 بروتين crosslinker. وانضم crosslinkers المختلفة من خلال تحفيز intein رد فعل عبر الربط، مما يؤدي إلى تكوين شبكة البروتين crosslinked للغاية (هيدروجيل). وقد تم اختيار NPU intein بسبب حركية في رد فعل سريع (ر 1/2 = 63 ثانية) وعالية الغلة عبر الربط (على مقربة من 80٪) 2،3. وقد تم اختيار البروتين CutA كما crosslinker بسبب الاستقرار العالية. أرتب CutA لديها درجة حرارة تمسخ من قرب 150 درجة مئوية، والاحتفاظ هيكل رباعي مثلوثي في الحلول التي تحتوي على قدر 5 M جوانيداين هيدروكلوريد 4،6. منذ الصرف الوحيدات بين crosslinkers مختلفة هو المساهم الرئيسي في هيدروجيل المادية تآكل السطح 7، ينبغي أن التفاعل بين الوحيدات قوية جدا في CutA تثبيط مثل هذه التبادلات الوحيدات، مما أدى إلى هيدروجيل أكثر استقرارا. واحدة من هذه اللبنات يحتوي أيضا على درجة عالية من الببتيد ماء S-جزء من منتصف لبنة لتسهيل المياهالاحتفاظ 8.
خلط اثنين من اللبنات هيدروجيل يبدأ رد فعل عبر الربط بين IN و IC intein شظايا، وتوليد سلسلة ببتيد أطول مع crosslinkers في كل المحطات. Crosslinkers من هذه الوحدات الجزيئية متعددة تتفاعل مع بعضها البعض، وتشكيل شبكة هيدروجيل crosslinked عالية (الشكل 1A). وأدرج محددة "الالتحام محطة الببتيد" (DSP) في واحدة من اللبنات هيدروجيل لتسهيل الشلل مستقرة من "البروتين لرسو السفن" (DP) الموسومة البروتين المستهدف في هيدروجيل. استخدام انقسام intein للتوسط في التجمع هيدروجيل لا يوفر فقط المزيد من المرونة لتخليق البروتين هيدروجيل، ولكن أيضا تمكن عالية الكثافة والتحميل موحدة من البروتين المستهدفة في جميع أنحاء هيدروجيل بأكمله، كما يتم تحميل البروتينات المستهدفة قبل تشكيل هيدروجيل.
البروتين هيدروجيل بوساطة intein هو ستا عاليةبلي في محلول مائي مع القليل إلى أي تآكل اكتشافها بعد 3 أشهر في درجة حرارة الغرفة. يتم الاحتفاظ الاستقرار في مجموعة واسعة من بالوسط (6-10) ودرجات الحرارة (4-50 درجة مئوية)، وهيدروجيل هو أيضا متوافقة مع المذيبات العضوية. ويستخدم هذا هيدروجيل لتجميد اثنين من البروتينات الكروية: بروتين الفلورية الخضراء (GFP) والبيروكسيداز الفجل (HRP). يستخدم هيدروجيل رهينة البروتين الأخير لأداء التحفيز الأحيائي في المذيبات العضوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. البلازميد البناء
ملاحظة: تم تضخيم كل الجينات في إطار تفاعلات PCR باستخدام معيار Phusion عالية الدقة البلمرة DNA فقا للمواصفات الشركة المصنعة. وقد وصفت الاشعال المستخدمة في الاستنساخ في السابق 9. يتم سرد كافة بنيات في الجدول 1.
- لتوليد CutA-NpuN (N، الجدول 1):
- PCR تضخيم CutA وNpuN الجينات من البلازميدات pET30-CutA-Tip1 10 و KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11، على التوالي، وذلك باستخدام الاشعال المناسب.
- هضم هذه الشظايا مع إنزيمات التقييد المناسبة وإدراج بالتسلسل هذه الشظايا في ناقلات pET26b بين المروج T7 وعلامة 6xHistidine-C محطة لتوليد N (الشكل 2A).
- لتوليد NpuC-S-CutA (C، الجدول 1):
- PCR تضخيم NpuC، CutA وS fragmenر [3 AG (PEG)] 10 من البلازميد KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11، pET30-CutA-Tip1 10 و 10 pQE9 AC Atrp 12، على التوالي، وذلك باستخدام الاشعال المناسب.
- هضم هذه الشظايا مع إنزيمات التقييد المناسبة وإدراج بالتسلسل هذه الشظايا إلى ناقلات pET26b بين المروج T7 و6xHistidine-C محطة لتوليد C (الشكل 2B).
- لتوليد NpuC-S-SH3-CutA الممتاز (C-SH3 الممتاز، الجدول 1):
- PCR تضخيم CutA باستخدام بادئات تحتوي على دوري الدرجة SH3 (PPPALPPKRRR) ورابط مرنة (GGGGS) 2 لتوليد جزء SH3-CutA الممتاز.
- استبدال الجينات CutA من C مع جزء SH3-CutA الممتاز.
- لتوليد SH3-GFP (الجدول 1):
- تضخيم الجين SH3 من البلازميد pJD757 باستخدام 13الاشعال المناسب.
- صهر هذا الجزء إلى الجين GFP وأدخله في ناقلات pET26b بين المروج T7 (الشكل 2C) وعلامة 6xHistidine-C المحطة.
2. التعبير البروتين
- تحويل 50 ميكرولتر من كيميائيا المختصة القولونية BL21 (DE3) مع البلازميد التعبير المناسب.
- بعد التحول، متسلسل تمييع هذه الخلايا، ومنها لوحة على لوريا، BERTANI (LB) / لوحات أجار يحتوي على 50 ميكروغرام / لتر الكانامايسين.
- احتضان لوحات تحتوي على خلايا تتحول عند 37 درجة مئوية لمدة 15 ساعة ~.
- بعد الحضانة، واختيار لوحة تحتوي على 50-100 المستعمرات و resuspend جميع المستعمرات في 5 مل من مرق LB.
- نقل التعليق إلى 1 L مرق LB تحتوي على الكاناميسين (من 50 ميكروغرام / لتر) وتنمو الخلايا عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة. رصد الامتصاصية في 600 نانومتر (OD 600). تنمو ثقافة حتى OD 600 ~ 0.8.
- لC و C-SH3 الممتاز، وحمل بروتين تعبير بإضافة الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) إلى ثقافة (1 ملي تركيز النهائي)، واحتضان الثقافة في 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات في حين تهتز في 250 دورة في الدقيقة.
- لN-SH3 وGFP، تبريد الثقافة إلى ~ 18 ° C بغمر قارورة الثقافة في حمام الماء المثلج لل~ 5 دقائق. حمل بروتين تعبير بإضافة IPTG إلى ثقافة (تركيز النهائي 1MM)، واحتضان الثقافة في 18 درجة مئوية لمدة 14-18 ساعة في حين تهتز في 250 دورة في الدقيقة.
- بعد البروتين التعبير، أجهزة الطرد المركزي في الثقافة 6،000 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية لجمع بيليه، بيليه خلية تخزين في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
3. تنقية البروتين
- تنقية N (تغيير طبيعة الظروف)
- كريات الخلية resuspend في الاحتياطي A (الجدول 2) في 10 مل / غرام من بيليه الرطب.
- Immersالبريد تعليق بيليه في حمام الماء المثلج وتعطيل الخلايا عن طريق صوتنة (الأمبير 10، 1 ثانية مع نبض و 6 ثانية وقفة لمدة 1 دقيقة).
- أجهزة الطرد المركزي لالمحللة في 16،000 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- تجاهل طاف. resuspend الكرية في الواق DA (التي تحتوي على 8 M اليوريا) وأجهزة الطرد المركزي تعليق على 16،000 XG لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- تمرير طاف من خلال 5 مل حمض ني nitrilotriacetic (NTA) العمود سبق معايرتها مع العازلة DA.
- غسل العمود مع 30 مل من العازلة DA تستكمل مع 45 ملي إيميدازول. أزل البروتين النقي باستخدام 20 مل من العازلة DA تستكمل مع 150 ملم إيميدازول.
- الحد من تركيز اليوريا في العينة البروتين ل<1 ملم من قبل أي أحد الأساليب التالية الواردة في 3.1.7.1 أو 3.1.7.2:
- Dialyze البروتين في DPBS العازلة (الجدول 2) في 4 درجات مئوية خلال الليل باستخدام أنابيب مع <20 كيلو دالتون قطع.
- الطرد المركزي تنقية البروتين في 30 & #160؛ كيلو دالتون الترشيح فائقة عمود الدوران في 2،800 x ج، 4 درجات مئوية حتى حجم أقل من 1 مل. إضافة 14 مل DPBS العازلة إلى العمود لتخفيف العينة البروتين. تكرار الطرد المركزي / التخفيف خطوات ثلاث مرات أكثر.
- بعد تبادل العازلة، إضافة dithiothreitol (DTT) إلى البروتين النقي (النهائي 2 ملم) والتركيز البروتين إلى ~ 100 ملغ / مل بواسطة الطرد المركزي من خلال 30 كيلو دالتون الترشيح فائقة عمود الدوران في 2،800 x ج، 4 درجات مئوية.
- قسامة البروتين مركزة وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- تنقية C و C-SH3 الممتاز (حالة الأم)
- كريات الخلية resuspend في الواق B (الرقم الهيدروجيني 6.0) (الجدول 2) تستكمل مع 1X كوكتيل مثبط البروتياز في 10 مل / غرام من بيليه الرطب. استخدام العازلة الحمضية للحد من تدهور بروتين من البروتين الهدف.
- تعطيل تعليق خلية بواسطة صوتنة كما هو موضح في 3.1.2. أجهزة الطرد المركزي في الزنبقيأكلون في 16،000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية، والحفاظ على طاف.
- تمرير المحللة للذوبان خلال 5 مل العمود ني NTA سبق معايرتها مع العازلة B.
- تستكمل غسل العمود مع العازلة B مع 45 ملي إيميدازول، وأزل البروتين المستهدف في 20 مل من العازلة B تستكمل مع 150 ملي إيميدازول.
- لC، انتقل إلى الخطوة 3.2.6. لC-SH3 الممتاز، تنفيذ خطوة إضافية تنقية التبادل الأيوني لإزالة البروتين المتدهورة جزئيا على النحو الوارد في الخطوات 3.2.5.1 3.2.5.3 ل
- تقليل تركيز كلوريد الصوديوم في C-SH3 الممتاز ل<1 ملم التالية الإجراء الموضح في 3.1.7.
- تحميل البروتين المستهدف على بعد 5 مل أنيون مبادل مطرز الاغاروز عمود مصفوفة سبق معايرتها مع الصوديوم العازلة الفوسفات (50 ملي، ودرجة الحموضة 7.0).
- البروتين الهدف أزل من العمود عن طريق تشغيل التدرج من محلول يحتوي على 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0 العازلهr لمحلول يحتوي على نفس العازلة تستكمل مع 1 M كلوريد الصوديوم. أخذ عينات أثناء شطف البروتين وعينات تجمع مع أعلى نقاء يعتمد على الصوديوم كبريتات دوديسيل بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام (SDS-PAGE).
- العازلة تبادل البروتين النقي في DPBS العازلة، كما هو موضح في 3.1.7.
- إضافة DTT إلى البروتين النقي (تركيز النهائي 2 ملم) وتركيز البروتين إلى ~ 100 ملغ / مل باستخدام 30 كيلو دالتون الترشيح فائقة عمود الدوران كما هو موضح في 3.1.8. قسامة وتخزين البروتين تتركز في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- تنقية SH3-GFP
- الكريات الخلايا في resuspend باستخدام الاحتياطي A في 10 مل / غرام من بيليه الرطب.
- تعطيل بيليه التعليق من صوتنة كما هو موضح في 3.1.2.
- أجهزة الطرد المركزي في 16000 x ج المحللة في لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية، وجمع طاف.
- تمرير طاف (المحللة للذوبان) خلال 5 مل العمود ني NTA سبق معايرتها معالعازلة A.
- غسل العمود مع 30 مل من الاحتياطي A تستكمل مع 45 ملي إيميدازول. أزل البروتين النقي باستخدام 20 مل من الاحتياطي A تستكمل مع 150 ملم إيميدازول.
- العازلة تبادل البروتين النقي في DPBS العازلة باستخدام نهج مماثل لذلك وصفها في 3.1.7 وتركيز البروتين إلى ~ 150 ملغ / مل باستخدام 30 كيلو دالتون الترشيح فائقة عمود الدوران كما هو موضح في 3.1.8.
- قسامة وتخزينها تنقية البروتين في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- تحليل SDS-PAGE العينات النقية التي تحتوي على CutA
- تمييع كل البروتين المنقى في الماء المقطر المزدوج لتقليل تركيز كلوريد الصوديوم إلى ~ 1 ملم. في هذه تركيز كلوريد الصوديوم، فإن معظم البروتينات CutA مثلوث تشغيل كما مونومرات على المواد الهلامية SDS-PAGE.
- مزج العينات مع 2X العازلة عينة SDS (0.5 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 6.8، 20٪ الجلسرين، و 10٪ ث / ت SDS، 0.1٪ ث / ت برومو الفينول الأزرق، 2٪ β-المركابتويثانول)، حضنت في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- تحميل سامبليس على 12٪ هلام SDS-PAGE. تنفيذ الكهربائي في الجهد المستمر من 200 V ل~ 50 دقيقة.
- مراقبة البروتين في المواد الهلامية التي تلطيخ مع Coomassie الأزرق الرائعة R250 التالية البروتوكولات القياسية (الشكل 1C).
4. هيدروجيل تشكيل
ملاحظة: الهلاميات المائية عينة المحرز في هذه الدراسة تحتوي على 1.6 ملي من كل كتلة بناء هيدروجيل ما لم يذكر خلاف ذلك. هذا تركيز البروتين تعطي هيدروجيل ناعمة ومستقرة. يضاف أزيد الصوديوم (نان 3) إلى هيدروجيل إلى تركيز النهائي من 0.5٪ ث / ت لمنع التلوث الجرثومي: تنبيه. نان 3 هي شديدة السمية ويجب التعامل بحرص شديد كما هو مبين في ورقة بيانات سلامة المواد.
- حساب حجم كل من البروتينات المركزة اللازمة لتحقيق تركيز النهائي من 1.6 ملم في هيدروجيل 100 عينة ميكرولتر. على سبيل المثال:
تركيز N:100 ملغ / مل
الوزن الجزيئي للN: 26.3 كيلو دالتون (راجع الجدول 1)
تركيز 100 ميكرولتر المرغوب: المجلد المطلوب 1.6 ملي
- لجعل 100 ميكرولتر هيدروجيل (1.6 ملم)، ومزيج C (خ ميكرولتر، تحسب وفقا لحجم 4.1) مع 5٪ نان 3 (10 ميكرولتر)، وتحسب 100 ملي DTT (5 ميكرولتر) و N (ذ ميكرولتر، وحجم وفقا ل 4.1) داخل الزجاج 2 مل قارورة.
- إضافة DPBS العازلة ((85 - ه - و) ميكرولتر) إلى القارورة لتحقيق الحجم النهائي من 100 ميكرولتر، ويدويا خلط جميع مكونات الحركة عبر دوامات باستخدام طرف ماصة. ملاحظة: الحل يصبح لزج جدا على الخلط.
- أجهزة الطرد المركزي الخليط لمدة 2 دقيقة في 8،000 x ج لإزالة فقاعات الهواء.
- احتضان الخليط في الغرفةدرجة الحرارة بين عشية وضحاها للسماح للتفاعل intein عبر الربط لتصل إلى الاكتمال. تأكيد تشكيل هيدروجيل من خلال تحويل أنبوب رأسا على عقب. فإن البروتينات لا تتدفق حالة تشكيل هيدروجيل.
- ويقدر العائد intein عبر الربط عن طريق فحص عينات (0.5 ميكرولتر لكل منهما) جمعها قبل الخطوة بعد الخطوة 4.2 و 4.5 على هلام SDS-PAGE، كما هو موضح في 3.4 (الشكل 1C).
5. تجميد GFP البروتين عن طريق الإرساء (DP) ومحطة الإرساء الببتيد (DSP) التفاعل
- لجعل 50 ميكرولتر-GFP بين functionalized هيدروجيل (1.2 ملم)، والجمع بين C-SH3 الممتاز (خ ميكرولتر، وتحسب وفقا ل4.1) وSH3-GFP (ذ ميكرولتر، وتحسب وفقا ل4.1) في نسبة 1:1 المولي في 1.7 مليلتر أنبوب microcentrifuge واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- إضافة 5٪ نان 3 (5 ميكرولتر)، و 100 ملي DTT (2.5 ميكرولتر)، (42.5 - س - <م> ذ) DPBS ميكرولتر لنفس الأنبوب. إضافة غ (ذ ميكرولتر، وتحسب وفقا ل4.1) لتحقيق نسبة 1:1 المولي ن وC-SH3 الممتاز. مزيج العينة باستخدام طرف ماصة من قبل حركة دوامات.
- أجهزة الطرد المركزي الخليط في 8،000 x ج لمدة 2 دقيقة واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها في الظلام. A هيدروجيل التغليف أشكال SH3-GFP أثناء الحضانة.
6. استخدام 1.6 ملي هيدروجيل بمثابة سقالة لتجميد رد الفعل الأنزيمية في بالمذيبات العضوية
- استخدام برنامج الصحة الإنجابية باعتبارها انزيم الطراز. إعداد محلول المخزون من برنامج الصحة الإنجابية (28 ملغ / مل أو 0.63 ملم) في DPBS.
- لجعل 30 ميكرولتر هيدروجيل (1.6 ملم) رهينة HRP، والجمع بين C (خ ميكرولتر، وتحسب وفقا ل4.1) مع HRP (2 ميكرولتر)، و 5٪ نان 3 (3 ميكرولتر) والتلفزيون الرقمي الأرضي (1.5 ميكرولتر من 100 ملي) داخل 1.7 مل أنبوب الطرد المركزي.
- إضافة N (ذ <م /> ميكرولتر، وتحسب وفقا ل4.1) وDPBS (23.5 - ه - و) ميكرولتر. خلط مع طرف ماصة مع حركة دوامات.
- أجهزة الطرد المركزي الخليط في 8،000 x ج لمدة 2 دقيقة ويحضن في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
تنبيه: الحكام تستخدم لفحص النشاط التالي شديدة السمية. استخدام توصيات السلامة المحددة من قبل المقابلة صحائف بيانات سلامة المواد. - لرد الفعل الأنزيمية، يغرق هيدروجيل في 1 مل من الكوكتيل رد فعل تحتوي على N، N-ثنائي ميثيل ديامين-P-فنيلين (5.8 ملم)، والفينول (5.8 ملم) وثالثي بوتيل هيدرو (2.9 ملم) في ن هيبتان 14. تعطيل يدويا الجل باستخدام تلميح ماصة لزيادة مساحة سطح التلامس في هيدروجيل والمذيبات.
- كشف HRP المنتج، والإندوفينول نوع الصبغة، عن طريق قياس الامتصاصية البصرية للعينات المأخوذة في أوقات مختلفة في 546 نانومتر في قارئ لوحة (الشكل 5). </ رأ>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد التخطيطي للتوسط intein-تكوين البروتين هيدروجيل في الشكل 1A. لبنات بناء هيدروجيل هي البروتين الاسهامية CutA-NpuN (N) وNpuC-S-CutA (C) (الشكل 1A، الجدول 1). NpuN / C هي N-/C-fragments من DnaE تقسيم طبيعي intein من نوستوك punctiforme (NPU). CutA هو بروتين مثلوثي مستقرة من Pyrococcus horikoshii 4،5. اختلاط المنقى N و C في وجود عامل مختزل DTT الحث على تشكيل البروتين الثالث - المنتج ligated (J: CutA-S-CutA) (أرقام 1A و 1C). فردي، اللبنات هيدروجيل N و C وجود سوائل لزجة مثل (الشكل 1B). اختلاط N و C ينتج مادة شبه صلبة شفافة يتم الاحتفاظ على الجزء السفلي من قارورة زجاجية بعد انقلاب، مما يدل على تشكيل هيدروجيل 15،16 (1B الشكل) 18،19.
هذا هيدروجيل البروتين بوساطة intein (1.6 ملم) يسلك الاستقرار الحلول عالية. هناك القليل لعدم فقدان crosslinked هيدروجيل سقالة بعد 21 أيام في 22 درجة مئوية في المخزن DPBS، حيث أن المبلغ الإجمالي للبروتين يطلق في المخزن المؤقت DPBS يتجاوز قليلا فقط من كمية النظرية من تقسم intein من هيدروجيل (على افتراض 100 ٪ intein الكفاءة عبر الربط) (الشكل 3A). كشفت كثافة أنه خلال تشكيل هيدروجيل، وكانت ردود الفعل عبر الربط ~ كفاءة 80٪ (الشكل 1C). وأظهر تحليل هلام SDS-PAGE أن تتبع سوى كميات من المنتج عبر تقسم كانت موجودة في المخزن هيدروجيل والمحيطة (الشكل 3B، والفرقة J)، مؤكدا أن فقدان هيدروجيل سقالة crosslinked إلى تآكل هو الحد الأدنى. الحاضر البروتين الرئيسي في المنطقة العازلة المحيطة هيدروجيل هو تقسم من intein. لم يلاحظ أي علامات واضحة للانجراف فيوهيدروجيل دون عائق المغمورة في محلول مائي في درجة حرارة الغرفة لأكثر من 3 أشهر (الشكل 3A مدخل). هيدروجيل هو أيضا درجة عالية من الاستقرار عند 37 درجة مئوية (الشكل 3C) ومخازن في كل من الحمضية والقاعدية (الشكل 3D).
لتسهيل البروتين الشلل، تم استخدام زوج من البروتين والببتيد يجند لها بالرسو البروتينات من الاهتمام إلى السقالة هيدروجيل. اخترنا البروتين SH3، وهو SRC تناظر 3 المجال من البروتين CRK محول، والبروتين لرسو السفن (DP) للانصهار لبروتين من الفائدة، ويجند لها (SH3 الممتاز) كما الببتيد محطة لرسو السفن (DSP) لإدماجها السقالة هيدروجيل. وقد تم اختيار هذا الزوج التفاعل بسبب حجم الجزيئية صغيرة نسبيا (56 أأ لSH3 و 11 أأ لSH3 الممتاز) وتقارب عالية (ك د = 0.1 ميكرومتر) 17،18. تم إدراج SH3 الممتاز بين NpuC وCutA لتشكيل C-SH3 الممتاز(الجدول 1). وتنصهر البروتين SH3 إلى N-محطة من هدف نموذج كروي البروتين، بروتين الفلورية الخضراء (GFP) لتشكيل SH3-GFP. عملية موضح في البروتوكول (القسم 5، الشكل 4A) تعطي هيدروجيل تحتوي على 1.2 ملي العابرة تقسم-اللبنات هيدروجيل العمود الفقري و 1.2 ملي GFP. هيدروجيل المحتوية على GFP أظهرت الاستقرار على غرار هيدروجيل تفتقر GFP (الشكل 4B) مع ~ 35٪ من إجمالي خسارة البروتين بعد 21 يوما في العازلة DPBS. وكانت معظم البروتينات الموجودة في المخزن المؤقت للتآكل inteins المشقوق. معدل الرشح من SH3-GFP من هيدروجيل تحتوي على دوري الدرجة SH3 هو ~ 30٪ بعد 3 أسابيع، أصغر بكثير من أن من هيدروجيل تفتقر إلى دوري الدرجة SH3 (> 70٪ فقدان البروتين في نفس الفترة من الزمن، الشكل 4C). ويجمد SH3-GFP في هيدروجيل يضيء تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. كما رأينا في الشكل 4D، هيدروجيل تحتوي على محطة لرسو السفن peptiدي SH3 الممتاز يحتفظ معظم مضان GFP بعد 3 أسابيع في حين أن هيدروجيل تفتقر SH3 الممتاز nonfluorescent يصبح أساسا. ومن المتوقع أن يكون هذا الاستخدام من أعلى النسب DP / الزوج DSP يمكن زيادة خفض معدل الرشح من البروتين يجمد.
في هذه التجربة، كما تم استخدام البروتين GFP الهدف، ولكن أي بروتين DP الموسومة يمكن أن يجمد مريح في هذا هيدروجيل. وبالتالي، يجب أن البروتين هيدروجيل بوساطة intein-توفير سقالة العامة لتجميد البروتين. كثافة GFP يجمد تثبت في هذا العمل هو ~ 33٪ من مول هيدروجيل. يحتمل أن يتم التوصل إلى كثافة أعلى الشلل عندما تدمج DSP متعددة في لبنة هيدروجيل.
المقبل، تأسست الانزيم HRP في هيدروجيل البروتين لإثبات قدرته على دعم التحفيز الأحيائي في المذيبات العضوية. وقد تم قياس نشاط انزيم من خلال رصد اقتران التأكسدي من
_upload/51202/51202fig1.jpg "/>
الشكل 1. بوساطة Intein-هيدروجيل البروتين. (أ) الخطط من intein رد فعل عبر الربط الذي يقوم بتشغيل تشكيل سلسلة طويلة من البروتين (J) مع البروتينات crosslinker في كل تيرميني. البروتينات Crosslinker من عدة سلاسل J البروتين noncovalently المنتسبين، وعند بوساطة intein البروتين ربط، لحث على تكوين شبكة البروتين عبر ربط عالية مع خصائص هيدروجيل. NpuN / C: intein N-/C-fragment. (ب) خلط من المنقى N و C (8.3٪ ث / ت) يؤدي إلى تشكيل شبكة هيدروجيل crosslinked للغاية (1.6 ملي J). تحليل (C) SDS-PAGE تنقيته من N و C اللبنات قبل وبعد الخلط. "N + C" يتوافق مع العينة المأخوذة مباشرة من هيدروجيل 1.6 ملم. "*" يدل على-C محطة intein الانقسام الاشتراكيةدي ناتج التفاعل. وكان كميا كثافة كل فرقة باستخدام "وحدة التتبع في برنامج" الكمية واحد ". تم تقسيم شدة الفرقة من البروتين الوزن الجزيئي للحصول على ما يعادل المولي. الكفاءة عبر الربط (~ 80٪) تم حسابها من مبلغ المنتج J وغير المتفاعل N / C في نفس الممر. طبع بإذن من مجلة الجمعية الكيميائية الأمريكية. (دوى: 10.1021/ja401075s) اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 2. خرائط البلازميد من بنيات البروتين. (A) CutA-NpuN، (B) NpuC-S-CutA و(C) SH3-GFP (<قوي> الجدول 1) والمستنسخة في pET26b ناقلات تحت سيطرة المروج T7. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الرقم 3. استقرار الهلاميات المائية البروتين بوساطة intein في DPBS. (A) ملف تآكل هيدروجيل 1.6 ملي في 22 درجة مئوية. الخط المنقط يمثل كتلة النظري للinteins المشقوق. يظهر مدخل أحد هيدروجيل دون عائق في DPBS بعد 3 أشهر في درجة حرارة الغرفة. (ب) تحليل SDS-PAGE العازلة المحيطة هيدروجيل ل. وكان يتم تجميع جميع العينات من المخزن المؤقت التي كانت مغمورة هيدروجيل في (A) (المجموع 7.5 مل)، وتتركز 75 أضعاف عن طريق الترشيح الفائق من خلال 10 دينار كويتيغشاء قبل هلام التحميل J: intein عبر تقسم المنتج N:. غير المتفاعل CutA-NpuN NpuN: تقسم جزء من N-intein. غير المتفاعل C وتقسم من NpuC تكون غير مرئية في هلام ونظرا لكمية صغيرة وصغيرة الحجم (4 كيلو دالتون)، على التوالي. النجمة يدل على عصابات مجهولة الهوية. (C) ملف تآكل هيدروجيل المحتضنة في درجات حرارة مختلفة. (D) ملف تآكل الهلاميات المائية المحتضنة في اثنين بالوسط مختلفة. طبع بإذن من مجلة الجمعية الكيميائية الأمريكية. (دوى: 10.1021/ja401075s) اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 4. Intein-هيدروجيل بوساطة تؤيد تجميد البروتينات كروي وظيفية: (أ) رسم تخطيطي للبروتين GFP الشلل باستخدام باعتباره كروي البروتين الطراز. يتم خلط بنة هيدروجيل المحتوية على DSP الأولى مع موانئ دبي تنصهر البروتين المستهدف للبروتين الهدف التحميل على كتلة المبنى. التكميلية intein التي تحتوي على جزء بنة هيدروجيل يضاف إلى خليط مما أسفر عن هيدروجيل مع GFP يجمد. (ب) إجمالي الشخصي تآكل البروتين من هيدروجيل تحتوي على نسبة 1:1 المولي من SH3-GFP. الخط المنقط يمثل كتلة النظري للinteins تقسم بها. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري من 2 تجارب مستقلة. (C) النض الشخصى SH3-GFP من هيدروجيل مع وبدون DSP. (D) التي تحتوي على صور GFP الهلاميات المائية تحت التعرض للأشعة فوق البنفسجية مباشرة بعد تشكيل هيدروجيل وبعد 21 يوما. طبع بإذن من مجلة الجمعية الكيميائية الأمريكية (دوى: 10.1021/ja401075s) اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الرقم 5. الفجل البيروكسيداز (HRP) شرك البروتين أثار intein-هيدروجيل يسهل تفاعل HRP المحفزة في مذيب عضوي ن هيبتان. (A) نموذج رد الفعل يحفزه HRP في المذيبات العضوية. (ب) صورة من الهلاميات المائية تحتوي على HRP مغلفة بعد أن تعطلت إلى أجزاء صغيرة وحضنت في مزيج رد فعل لمدة 10 دقيقة و 30 دقيقة (يسار) والتجربة التحكم مع نفس الكمية من HRP nonimmobilized في المخزن DPBS (يمين). تم رصد (C) تشكيل المنتج بواسطة الامتصاصية في 546 نانومتر. تكييفها بإذن من مجلة العامرييمكن الجمعية الكيميائية. (دوى: 10.1021/ja401075s) اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الجدول 1. يبني البروتين المستخدمة في هذه الدراسة.
| اسم قصير | تسلسل البروتين | MW (كيلو دالتون) |
| CutA-NpuN (N) | CutA-EAC (GGGGS) 2-AS-NpuN-HHHHHH | 26.3 |
| NpuC-S-CutA (C) | NpuC-CFNKLYRDPMG [(جي) 3 PEG] 10 -ARMPYV-C UTA- HHHHHH | 26.1 |
| NpuC-S-SH3 الممتاز - CutA (C-SH3 الممتاز) | NpuC-CFNKLYRDPMG [(AG) 3 PEG] 10 -ARMPYVGS- PPPALPPKRRR (GGGGS) 2-AS-CutA-HHHHHH | 28.3 |
| SH3-GFP | SH3-KL (GGGGS) 2-AS-GFP-HHHHHH | 34.5 |
طبع بإذن من مجلة الجمعية الكيميائية الأمريكية (دوى: 10.1021/ja401075s).
الجدول 2. التراكيب العازلة.
| العازلة A | 500 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0 |
| العازلة DA | 500 ملي مول كلوريد الصوديوم، 8 M اليوريا، و 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0 |
| العازلة B | 500 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 50 ملي NaPOi، ودرجة الحموضة 6.0 |
| DPBS | برنامج تلفزيوني Dulbecco و، 137.9 مم كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل، 1.5 ملي KH 2 PO 4، 8.1 ملي نا 2 هبو 4، ودرجة الحموضة 7.4 |
طبع بإذن من مجلة الجمعية الكيميائية الأمريكية (دوى: 10.1021/ja401075s).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا العمل، أثبتنا تركيب مستقر للغاية بوساطة intein البروتين هيدروجيل. استخدام انقسام تمكن intein هيدروجيل التي سيتم تشكيلها مشروط في استجابة لخلط اثنين من مكونات السائل المرحلة. على وجه التحديد، وانقسام يربط intein تساهميا اثنين من اللبنات السائل المرحلة عن طريق تفاعل عبر الربط، مما أسفر عن وحدة ببتيد يحيط بها وحدات يشابك هذا بدوره بتجميع الذاتي في هيدروجيل. تشكيل الناجم عن اختلاط هيدروجيل يتجاوز الصعوبات التقنية في تركيب مكون واحد الهلاميات المائية البروتين حيث يمكن أن يحدث بوساطة هلام انسداد أعمدة تنقية الكروماتوغرافي. وعلاوة على ذلك، فإن أشكال هيدروجيل في ظل الظروف الفسيولوجية دون الحاجة إلى أي محرضات كيميائية دخيلة و / أو مشغلات المادية.
يحتفظ هيدروجيل بوساطة intein استقرار عالية في مخازن كلا الحمضية والأساسية، وعند درجة حرارة الفسيولوجية. يمكن الهلاميات المائية تشكل وايال أقل من 0.8 ملي من كل كتلة بناء الفرد (لا تظهر البيانات)، ولكن أعلى تركيزات البروتين (~ 1.6 ملم) الهلاميات المائية العائد مع الاستقرار ميكانيكية أفضل. ويعزى استقرار هيدروجيل العالية لاستخدام 1) مثلوثي البروتين مستقرة جدا، CutA، باعتبارها crosslinker، و 2) intein للانضمام تساهميا crosslinkers مختلفة. وأظهر تحليل الكثافة من المواد الهلامية SDS PAGE-أن ~ 80٪ من البروتينات المدخلات خضع بنجاح الانقسام حفز intein رد فعل عبر الربط.
لتشكيل هيدروجيل، تتركز اللبنات الأولى الفردية إلى ~ 100 ملغ / مل. وكيل الحد، مثل التلفزيون الرقمي الأرضي، يجب أن يكون حاضرا أثناء الخطوة تركيز البروتين لمنع تشكيل السندات ثاني كبريتيد الجزيئات. في غياب الحد من وكيل، يمكن مركزة بنة هيدروجيل الفردية تشكل في بعض الأحيان مادة تشبه هيدروجيل. ومع ذلك، يذوب هذا مادة تشبه الجل بسرعة عندما مغمورة في منطقة عازلة و / أو في وجودللحد من وكيل.
للحصول على هيدروجيل مع أقصى قدر من الاستقرار، فمن المهم التأكد من أن نسبة المولي اثنين من اللبنات هيدروجيل هو 1:1. فإن أي بنة الزائدة لا تكون crosslinked ويمكن أن تؤثر على الخواص الميكانيكية للهيدروجيل. يحتاج البروتين تتركز على أن aliquoted وتخزينها بشكل فردي لتقليل المتكررة تجميد أذاب دورات.
نحن أيضا أثبتت استخدام بوساطة intein البروتين هيدروجيل باعتبارها حفاز بيولوجي العضوية المذيبات متوافق. على وجه التحديد، لوحظ الهلاميات المائية دمج الانزيم كانت مغمورة في HRP ن هيبتان تحتوي على الركيزة وتحويل ناجح من الركيزة إلى المنتج. يخدم هيدروجيل البروتين بمثابة سقالة فعالة لالتحفيز الأحيائي في المذيبات العضوية على الأرجح بسبب حماية من تمسخ العضوية المذيبات بوساطة التي تقدمها بيئة رطب للغاية من هيدروجيل.
واحدة من القيود المفروضة على الهو التكنولوجيا الشلل الانزيم هو الحاجة إلى دمج البروتين الهدف مع الببتيد لرسو السفن (DP). هذا التعديل قد تؤثر على النشاط وذوبان بعض البروتينات المستهدفة، وبالتالي تتطلب حالة على حدة تعظيم الاستفادة من بنيات البروتين DP الموسومة. بالإضافة إلى ذلك، كمية صغيرة من البروتينات الموسومة ترشح من الببتيد محطة لرسو السفن (DSP) التي تحتوي على هيدروجيل بعد 1 في الاسبوع. يتأثر استقرار البروتين يجمد من تقارب من الزوج DSP / DP. لتحقيق أفضل كفاءة الشلل، وسوف تكون هناك حاجة لتقارب أعلى DSP / DP الزوج. أخيرا، وهذا ضعيف نسبيا الملكية المعارض هيدروجيل الميكانيكية ويرجع ذلك إلى معامل التخزين هضبة منخفضة (100-200 كيلو باسكال) 9. ويتأثر معامل التخزين الهضبة من قبل هياكل كل من crosslinker وmidblock 19. في هيدروجيل الحالي، تم استخدام البروتين مثلوث كما crosslinker. استخدام البروتين crosslinker مع دولة multimeric أعلى يمكن أن يحتمل زيادة هضبة هيدروجيل الحادي وأوراج معامل وممتلكاتها الميكانيكية.
باختصار، نحن تقرير توليف وتوصيف هيدروجيل البروتين الجديد الذي يشكل مشروط على خلط اثنين من السائل المرحلة اللبنات البروتينية، تحتوي كل منها على نصف واحد من انقسام intein. الهلاميات المائية البروتين بوساطة Intein-تمثل المواد الجديدة واعدة مع التطبيقات المحتملة في التفاعلات الأنزيمية الاصطناعية، التركيب العضوي، والتسليم المخدرات عن طريق الحقن، وهندسة الأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا توجد المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أنوه الدكتور ديفيد Tirrell (كالتك) لله هدية نوع من البلازميد pQE9 AC 10 Atrp 12، والدكتور توم موير (جامعة برينستون) لله هدية نوع من البلازميد KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11، الدكتور تاكيهيسا ماتسودا (معهد كانازاوا للتكنولوجيا، Hakusan، إيشيكاوا، اليابان) لله هدية نوع من البلازميد pET30-CutA-Tip1 10، والدكتور جاي D. كسيلينغ (UC بيركلي) لله هدية نوع من البلازميد pJD757 13 . وأيد هذا العمل في جزء من المؤسسة الوطنية للعلوم المهنية، الولايات المتحدة القوات الجوية بييب ونورمان هاكمان برنامج البحوث المتقدمة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase |
New England BioLabs | M0530S |
|
| Competent Escherichia coli BL21 (DE3) |
New England BioLabs | C2527I |
|
| Luria Bertani |
VWR | 90003-350 |
|
| Bacto Agar Media |
VWR | ||
Kanamycin sulfate |
VWR | ||
| IPTG |
VWR | EM-5820 |
|
| Imidazole |
VWR | EM-5720 |
|
| Urea |
VWR | EM-9510 |
|
| Dithiothreitol (DTT) |
Fisher | BP172-5 |
|
| Protease Inhibitor cocktail |
Roche Applied Science | 11836153001 |
|
| DPBS |
VWR | 82020-066 |
|
| Brilliant Blue R |
Acros Organics | A0297990 |
|
| Sodium Azide |
Fisher | AC190380050 |
Caution, highly toxic |
| Horseradish peroxidase |
Sigma | P8125-5KU |
|
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine |
Fisher | AC408460250 |
Caution, highly toxic |
| phenol |
Fisher | AC149340500 |
Caution, highly toxic |
tert-butyl hydroperoxide |
Fisher | AC180340050 |
Caution, highly toxic |
| n-heptane |
Acros Organics | 120340010 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shaker/Incubator |
Fisher Scientific | Max Q 6000 |
|
| Centrifuge |
Sorvall | RC 6 |
|
| Sonicator |
QSonica | Misonix 200 |
|
| Ultrafiltration Tubes |
Amicon Ultra | UFC903024 |
|
| Ni Sepharose High Performance HisTrap column |
GE Healthcare Life Sciences | 17-5248-01 |
|
| HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column |
GE Healthcare Life Sciences | 17-5156-01 |
|
| Plate reader |
Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM |
References
- Banta, S., Wheeldon, I. R., Blenner, M. Protein Engineering in the Development of Functional Hydrogels. Ann. Rev. Biomed. Eng. 12, 167-186 (2010).
- Iwai, H., Zuger, S., Jin, J., Tam, P. H. Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostoc punctiforme. FEBS Lett. 580, 1853-1858 (2006).
- Zettler, J., Schutz, V., Mootz, H. D. The naturally split Npu DnaE intein exhibits an extraordinarily high rate in the protein trans-splicing reaction. FEBS Lett. 583, 909-914 (2009).
- Tanaka, Y., et al. Structural implications for heavy metal-induced reversible assembly and aggregation of a protein: the case of Pyrococcus horikoshii CutA. FEBS Lett. 556, 167-174 (2004).
- Sawano, M., et al. Thermodynamic basis for the stabilities of three CutA1s from Pyrococcus horikoshii,Thermus thermophilus, and Oryza sativa, with unusually high denaturation temperatures. Biochemistry. 47, 721-730 (2008).
- Tanaka, T., et al. Hyper-thermostability of CutA1 protein, with a denaturation temperature of nearly 150 degrees C. FEBS Lett. 580, 4224-4230 (2006).
- Shen, W., Zhang, K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Tuning the erosion rate of artificial protein hydrogels through control of network topology. Nat. Mater. 5, 153-158 (2006).
- McGrath, K. P., Fournier, M. J., Mason, T. L., Tirrell, D. A. Genetically directed syntheses of new polymeric materials. Expression of artificial genes encoding proteins with repeating -(AlaGly)3ProGluGly- elements. J. Am. Chem. Soc. 114, 727-733 (1992).
- Ramirez, M., Guan, D., Ugaz, V., Chen, Z. Intein-triggered artificial protein hydrogels that support the immobilization of bioactive proteins. J. Am. Chem. Soc. 135, 5290-5293 (2013).
- Ito, F., et al. Reversible hydrogel formation driven by protein-peptide-specific interaction and chondrocyte entrapment. Biomaterials. 31, 58-66 (2010).
- Lockless, S. W., Muir, T. W. Traceless protein splicing utilizing evolved split inteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10999-11004 (2009).
- Shen, W., Lammertink, R. G. H., Sakata, J. K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Assembly of an artificial protein hydrogel through leucine zipper aggregation and disulfide bond formation. Macromolecules. 38, 3909-3916 (2005).
- Dueber, J. E., et al. Synthetic protein scaffolds provide modular control over metabolic flux. Nat. Biotechnol. 27, (2009).
- Bruns, N., Tiller, J. C. Amphiphilic network as nanoreactor for enzymes in organic solvents. Nano Lett. 5, 45-48 (2005).
- Das, D., et al. Water gelation of an amino acid-based amphiphile. Chem. Eur. J. 12, 5068-5074 (2006).
- Cao, Y., Li, H. Engineering tandem modular protein based reversible hydrogels. Chem. Commun. , 4144-4146 (2008).
- Wu, X., et al. Structural basis for the specific interaction of lysine-containing proline-rich peptides with the N-terminal SH3 domain of c-Crk. Structure. 3, 215-226 (1995).
- Nguyen, J. T., Turck, C. W., Cohen, F. E., Zuckermann, R. N., Lim, W. A. Exploiting the basis of proline recognition by SH3 and WW domains: Design of n-substituted inhibitors. Science. 282, 2088-2092 (1998).
- Olsen, B. D., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Yielding Behavior in Injectable Hydrogels from Telechelic Proteins. Macromolecules. 43, 9094-9099 (2010).
