Summary
Nous présentons la synthèse d'un hydrogel split-induite par une intéine de protéines. Les éléments constitutifs de cet hydrogel sont deux copolymères de protéines contenant chacun une sous-unité d'une protéine trimérique qui sert d'agent de réticulation et une moitié d'une intéine dissociée. Le mélange des deux copolymères de protéine déclenche une réaction de trans-épissage d'intéine, ce qui donne une unité de polypeptide qui s'auto-assemble en un hydrogel. Cet hydrogel est très stable au pH et à la température, compatible avec des solvants organiques, et incorpore facilement les protéines globulaires fonctionnels.
Abstract
Nous présentons la synthèse d'un hydrogel de protéine hautement stable à médiation par une réaction de trans-épissage d'intéine divisée catalysée par la protéine. Les éléments constitutifs de cet hydrogel sont deux copolymères à blocs de protéines contenant chacun une sous-unité d'une protéine trimérique qui sert d'agent de réticulation et une moitié d'une intéine dissociée. Un enroulement aléatoire hautement hydrophile est insérée dans l'un des copolymères séquences pour la rétention d'eau. Le mélange des deux copolymères séquences de la protéine déclenche une réaction de trans-épissage d'intéine, ce qui donne une unité de polypeptide avec des agents de réticulation à chaque extrémité qui rapidement s'auto-assemble en un hydrogel. Cet hydrogel est très stable dans les conditions acides et basiques, à des températures allant jusqu'à 50 ° C, et dans des solvants organiques. L'hydrogel rapidement des réformes après la rupture due au cisaillement. Constitution d'une "station d'accueil peptide" dans le bloc de construction d'hydrogel permet l'incorporation pratique de «protéine d'accueil" marqués protéines cibles.L'hydrogel est compatible avec un milieu de croissance de culture de tissus, favorise la diffusion des molécules de 20 kDa, et permet l'immobilisation de protéines globulaires bioactifs. L'application de l'hydrogel de protéine induite par une intéine en tant que biocatalyseur-solvant organique compatible avec l'encapsulation a été démontrée par l'enzyme de peroxydase de raifort et corroborer son activité.
Introduction
Hydrogels entièrement en protéines transportent le potentiel de faire progresser considérablement domaines aussi divers que l'ingénierie tissulaire, l'administration de médicaments et biofabrication 1. Ils offrent des avantages plus hydrogels traditionnels de polymères synthétiques dont la biocompatibilité et la possibilité de soutenir de manière non invasive l'incorporation de protéines globulaires bioactifs.
Dans ce travail, nous décrivons le développement d'un nouveau hydrogel protéique formé par l'intermédiaire d'une fraction de protéine induite par une intéine réaction de trans-épissage et de son application comme un échafaudage de protéines d'immobilisation (figure 1). Les blocs de construction pour cet hydrogel sont deux copolymères à blocs de protéines, chacune comprenant le fragment N-ou C-terminale d'une intéine dissociée (IN et IC) et une sous-unité d'une protéine multimérique de réticulation. L'intéine DnaE de Nostoc punctiforme (Npu) a été utilisé comme le 2,3 intéine dissociée et une petite protéine trimérique (12 kDa) ACTU de Pyrococcus horikoshii </ Em> a été utilisé comme le 4,5 de protéine de réticulation. Différents agents de réticulation sont reliés par le biais réaction de trans-épissage d'intéine catalysée, ce qui conduit à la formation d'un réseau de protéines hautement réticulé (hydrogel). Npu intéine a été choisi en raison de sa cinétique de réaction rapide (t 1/2 = 63 sec) et le rendement de trans-épissage élevé (près de 80%) 2,3. La protéine de l'ACTU a été choisi comme l'agent de réticulation en raison de sa grande stabilité. ACTU trimères ont une température de dénaturation de près de 150 ° C et de conserver la structure quaternaire trimérique dans des solutions contenant pas moins de 5 M de chlorhydrate de guanidine 4,6. Depuis l'échange d'unité entre les différents agents de réticulation est un contributeur majeur de la surface hydrogel physique érosion 7, la très forte interaction entre la sous-unité dans l'ACTU devrait décourager de tels échanges de sous-unités, conduisant à un hydrogel plus stable. L'un de ces blocs de construction contient également un peptide S-fragment hautement hydrophile que le mi-bloc pour faciliter l'eaurétention 8.
Le mélange des deux éléments de base d'hydrogel initie une réaction de trans-épissage entre l'IN et IC fragments d'intéine, la génération d'une chaîne polypeptidique plus longtemps avec des agents de reticulation aux deux extrémités. Les agents de reticulation à partir de plusieurs de ces unités moléculaires interagissent les uns avec les autres, formant un réseau d'hydrogel hautement réticulé (Figure 1A). Un «peptide station d'accueil" spécifique (DSP) est incorporé dans l'un des blocs de construction d'hydrogel pour faciliter l'immobilisation stable d'une "protéine d'amarrage» (DP) à marquage protéine cible dans l'hydrogel. L'utilisation d'une intéine dissociée de servir de médiateur de l'ensemble de l'hydrogel non seulement fournit une flexibilité supplémentaire pour la synthèse de protéines de l'hydrogel, mais permet également à haute densité, le chargement uniforme de la protéine cible dans l'ensemble de l'hydrogel, comme les protéines cibles sont chargées avant la formation de l'hydrogel.
La protéine hydrogel intéine médiation est très stable dans une solution aqueuse avec peu ou pas d'érosion détectable après 3 mois à température ambiante. La stabilité est maintenue dans une large gamme de pH (6-10) et de températures (4-50 ° C), et l'hydrogel est également compatible avec des solvants organiques. Cet hydrogel est utilisé pour l'immobilisation de deux protéines globulaires: la protéine fluorescente verte (GFP) et de la peroxydase de raifort (HRP). Hydrogel emprisonner cette dernière protéine est utilisée pour réaliser la biocatalyse dans un solvant organique.
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Protocol
Une. Construction des plasmides
REMARQUE: Tous les gènes ont été amplifiés dans des réactions de PCR standard utilisant Phusion haute fidélité ADN polymérase selon les spécifications du fabricant. Les amorces utilisées pour le clonage ont été décrits précédemment 9. Toutes les constructions sont énumérés dans le tableau 1.
- Pour générer ACTU-NpuN (N, tableau 1):
- Amplifier par PCR des gènes de l'ACTU et NpuN de plasmides PET30-ACTU-Astuce1 10 et KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, respectivement, en utilisant les amorces appropriées.
- Digérer ces fragments avec les enzymes de restriction appropriées et insérer séquentiellement ces fragments dans le vecteur pET26b entre le promoteur T7 et un 6xHistidine tag C-terminal pour générer N (figure 2A).
- Pour générer NpuC-S-ACTU (C, tableau 1):
- Amplifier par PCR NpuC, l'ACTU et S fragmentationt [AG 3 (PEG)] 10 à partir du plasmide KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, PET30-ACTU-Astuce1 10 et pQE9 AC 10 ATRP 12, respectivement, en utilisant les amorces appropriées.
- Digérer ces fragments avec les enzymes de restriction appropriées et insérer séquentiellement ces fragments dans le vecteur pET26b entre le promoteur T7 et un 6xHistidine C-terminale de générer C (figure 2B).
- Pour générer NpuC-S-SH3 lig-ACTU (C-SH3 lig, tableau 1):
- Amplifier par PCR utilisant des amorces contenant ACTU une lig SH3 (PPPALPPKRRR) et une liaison flexible (GGGGS) 2 pour générer fragment SH3 lig-ACTU.
- Remplacer le gène de l'ACTU de C avec un fragment de SH3 lig-ACTU.
- Pour générer SH3-GFP (tableau 1):
- Amplifier le gène SH3 de plasmide pJD757 13 en utilisant laamorces appropriées.
- Fusionner ce fragment avec le gène de la GFP et l'insérer dans le vecteur pET26b entre le promoteur T7 (figure 2C) et une 6xHistidine tag C-terminal.
2. Expression de la protéine
- Transformer 50 ul d'chimiquement compétente Escherichia coli BL21 (DE3) par le plasmide d'expression approprié.
- Après transformation, diluer en série de ces cellules, et de la plaque sur les Luria-Bertani (LB) / plaques de gélose contenant 50 ug / ml de kanamycine.
- Incuber les plaques contenant des cellules transformées à 37 ° C pendant environ 15 heures.
- Après incubation, choisir une plaque qui contient 50-100 colonies et la suspension de toutes les colonies dans 5 ml de bouillon LB.
- Transfert suspension à 1 L de bouillon LB contenant de la kanamycine (50 pg / ml) et la culture de cellules à 37 ° C avec agitation à 250 tours par minute. Surveillance de l'absorbance à 600 nm (DO 600). Cultiver la culture jusqu'à DO600 ~ 0,8.
- C et C-SH3 lig, induire l'expression de protéine par addition d'isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à la culture (1 mM de concentration finale) et incuber la culture à 37 ° C pendant 4 heures avec une agitation à 250 tours par minute.
- Pour les N-GFP et SH3, refroidir la culture à ~ 18 ° C en plongeant le flacon de culture dans un bain d'eau glacée pendant ~ 5 min. Induire l'expression de protéine par addition d'IPTG à la culture (concentration finale 1 mM) et incuber la culture à 18 ° C pendant 14 à 18 heures avec une agitation à 250 tours par minute.
- Après expression de la protéine, centrifuger la culture à 6000 g pendant 20 min à 4 ° C pour recueillir le culot. culot cellulaire de magasin à -80 ° C jusqu'à utilisation.
3. Protein Purification
- La purification du N (conditions dénaturantes)
- les culots de cellules de remettre en suspension dans du tampon A (tableau 2) à 10 ml / g de culot humide.
- Immersenvoyer la suspension de granulés dans un bain d'eau glacée et de rompre les cellules par traitement aux ultrasons (10 ampères, avec une impulsion de s et 6 s pause pendant 1 min).
- Centrifuger le lysat à 16 000 x g pendant 20 min à 4 ° C.
- Jeter le surnageant. Reprendre le culot dans du tampon DA (contenant 8 M d'urée) et centrifuger la suspension à 16 000 xg pendant 20 min à 4 ° C.
- Passez le surnageant à travers une colonne de 5 ml d'acide Ni-nitrilotriacétique (NTA) préalablement équilibrée avec DA tampon.
- Laver la colonne avec 30 ml de tampon DA supplémenté avec 45 mM d'imidazole. Éluer la protéine purifiée en utilisant 20 ml de tampon DA supplémenté avec 150 mM d'imidazole.
- Réduire la concentration d'urée dans l'échantillon de protéine à <1 mM, soit par l'une des méthodes suivantes données dans 3.1.7.1 3.1.7.2 ou:
- Dialyser la protéine dans du tampon DPBS (tableau 2) à 4 ° C pendant une nuit en utilisant des tubes avec <20 kDa coupure.
- Centrifugeuse purifié la protéine dans un 30 & #160; kDa colonne de centrifugation ultra-filtration à 2800 x g, 4 ° C jusqu'à ce que le volume est inférieur à 1 ml. Ajouter 14 ml de tampon DPBS à la colonne de diluer l'échantillon de protéine. Répétez la centrifugation / dilution étapes trois fois.
- Après l'échange de tampon, ajouter du dithiothréitol (DTT) à la protéine purifiée (finale 2 mM) et on concentre la protéine à ~ 100 mg / ml par centrifugation à travers une colonne de centrifugation ultra-filtration de 30 kDa à 2800 x g, 4 ° C.
- Aliquoter la protéine concentré et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation.
- Purification de C et C-SH3 lig (état natif)
- les culots de cellules de remettre en suspension dans du tampon B (pH 6,0) (Tableau 2) complété avec un inhibiteur de protéase 1x cocktail à 10 ml / g de culot humide. Utilisation tampon acide pour réduire au minimum la dégradation protéolytique de la protéine cible.
- Perturber suspension cellulaire par sonication comme décrit au paragraphe 3.1.2. Centrifuger les lysmangé à 16 000 g pendant 20 min à 4 ° C et garder le surnageant.
- Passer le lysat soluble à travers une colonne Ni-NTA de 5 ml équilibrée au préalable avec du tampon B.
- Laver la colonne avec du tampon B supplémenté avec 45 mM d'imidazole, et éluer la protéine cible dans 20 ml de tampon B supplémenté avec 150 mM d'imidazole.
- C, passez à l'étape 3.2.6. C-SH3 lig, procéder à une étape de purification par échange d'ions supplémentaires pour éliminer la protéine partiellement dégradée comme indiqué dans les étapes 3.2.5.1 à 3.2.5.3
- Réduire la concentration de NaCl dans C-SH3 lig <1 mM suivant la procédure décrite au point 3.1.7.
- Charger la protéine cible sur un échangeur d'anions ml perlé colonne de la matrice d'agarose à 5 préalablement équilibrée avec du tampon phosphate de sodium (50 mM, pH 7,0).
- Éluer la protéine cible à partir de la colonne par l'exécution d'un gradient à partir d'une solution contenant 10 mM Tris-HCl pH 8,0 buffer à une solution contenant le même tampon additionné de NaCl 1 M. Prélever des échantillons au cours de l'élution de la protéine et de mise en commun des échantillons avec la plus grande pureté sur la base de sodium dodécyl sulfate polyacrylamide L'électrophorèse sur gel (SDS-PAGE).
- Échanger le tampon de la protéine purifiée dans du tampon DPBS, comme décrit dans 3.1.7.
- Ajouter du DTT pour la protéine purifiée (concentration finale de 2 mM) et on concentre la protéine à ~ 100 mg / ml en utilisant une colonne de centrifugation ultra-filtration de 30 kDa comme décrit dans 3.1.8. Aliquote et magasin concentrés de protéines à -80 ° C jusqu'à utilisation.
- La purification de la GFP-SH3
- culots cellulaires Remettre en suspension à l'aide d'un tampon A à 10 ml / g de culot humide.
- Perturber culot suspension par sonication comme décrit au paragraphe 3.1.2.
- Centrifuger le lysat à 16 000 x g pendant 20 min à 4 ° C et collecter le surnageant.
- Passer le surnageant (lysat soluble) à travers une colonne Ni-NTA de 5 ml équilibrée au préalable avecTampon A.
- Laver la colonne avec 30 ml de tampon A additionné de 45 mM d'imidazole. Éluer la protéine purifiée en utilisant 20 ml de tampon A additionné de 150 mM d'imidazole.
- Échanger le tampon de la protéine purifiée dans du tampon DPBS utilisant une approche similaire à celle décrite dans 3.1.7 et concentrer la protéine de ~ 150 mg / ml en utilisant une colonne de centrifugation ultra-filtration de 30 kDa comme décrit dans 3.1.8.
- Aliquote et magasin de protéines purifiées à -80 ° C jusqu'à utilisation.
- Analyse SDS-PAGE des échantillons purifiés contenant ACTU
- Diluer chaque protéine purifiée dans de l'eau bidistillée pour réduire la concentration de NaCl à ~ 1 mM. A cette concentration de NaCl, la plupart des protéines ACTU trimères exploités en tant que monomères sur les gels SDS-PAGE.
- Mélanger les échantillons avec un tampon échantillon SDS 2x (0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 20% glycerol, 10% p / v de SDS, 0,1% p / v bromo-phénol bleu, 2% β-mercaptoéthanol), incubées à 95 ° C pendant 5 min.
- Chargez le samples sur un gel SDS-PAGE à 12%. Effectuer l'électrophorèse à une tension constante de 200 V pendant environ 50 min.
- Observer les protéines dans les gels par coloration au bleu brillant de Coomassie R250 suivant les protocoles standards (Figure 1C).
4. Hydrogel Formation
REMARQUE: les hydrogels échantillons effectuées dans cette étude contiennent 1,6 mM de chaque bloc de construction d'hydrogel, sauf indication contraire. Cette concentration de protéine donne un hydrogel souple et stable. ATTENTION: azide de sodium (NaN3) est ajouté à l'hydrogel à une concentration finale de 0,5% p / v pour empêcher la contamination bactérienne. NaN3 est très toxique et doit être manipulé avec un soin extrême, comme indiqué dans la fiche de données de sécurité.
- Calculer le volume de chacune des protéines concentrées nécessaires pour atteindre une concentration finale de 1,6 mM dans un échantillon de 100 ul hydrogel. Par exemple:
Concentration de N:100 mg / ml
Poids moléculaire de N: 26,3 kDa (voir le tableau 1)
Concentration 100 pi désiré: Volume désiré 1,6 mM
- Pour faire un pi hydrogel 100 (1,6 mM), mélange C (x pi, volume calculé d'après 4,1) avec 5% de NaN 3 (10 ul), 100 mM de DTT (5 de pi) et N (y ul, volume calculé d'après 4.1) à l'intérieur d'un flacon de 2 ml en verre.
- Ajouter tampon DPBS ((85 - x - y) ul) dans le flacon pour obtenir un volume final de 100 ul, et mélanger tous les composants manuellement par l'intermédiaire d'un mouvement de tourbillonnement au moyen d'un embout de pipette. Remarque: La solution devient très visqueuse lors du mélange.
- Centrifuger le mélange pendant 2 min à 8000 xg pour éliminer les bulles d'air.
- Incuber le mélange à la chambretempérature pendant une nuit pour permettre à la réaction de trans-épissage d'intéine pour atteindre l'achèvement. Confirmez formation d'hydrogel en tournant le tube à l'envers. Les protéines ne seront pas versés si un hydrogel est formé.
- Estimer le rendement de trans-épissage d'intéine en vérifiant des échantillons (0,5 pi chacun) prélevés avant et après l'étape 4.2 étape 4.5 sur un gel SDS-PAGE, tel que décrit au point 3.4 (figure 1C).
5. Immobilisation de la GFP via accueil Protein (DP) et station d'accueil pour Peptide (DSP) Interaction
- Pour effectuer une 50 ul GFP-hydrogel fonctionnalisé (1,2 mM), combiner C-SH3 lig (x pi, calculé selon 4.1) et SH3-GFP (y ul, calculé selon 4.1) à 1:01 dans un rapport molaire de 1,7 ml microtube et incuber le mélange à la température ambiante pendant 30 min.
- Ajouter 5% de NaN3 (5 pi), 100 mM de DTT (2.5 pi), (42,5 - x - <em> y) ul DPBS à la même tube. Ajouter N (y ul, calculé selon l'4,1) pour atteindre un rapport molaire de 1:1 de N et C-SH3 lig. Mélanger l'échantillon en utilisant une pointe de pipette par un mouvement tourbillonnant.
- Centrifuger le mélange à 8000 g pendant 2 min et laisser incuber le mélange à la température ambiante pendant une nuit dans l'obscurité. Un hydrogel encapsulation formes SH3-GFP pendant l'incubation.
6. L'utilisation de mM hydrogel 1.6 comme un échafaudage d'immobilisation pour la réaction enzymatique dans un solvant organique
- Utiliser la HRP comme enzyme de modèle. Préparer une solution stock de HRP (28 mg / ml ou 0,63 mM) dans du DPBS.
- Pour faire un hydrogel 30 ul (1,6 mM) piégeant HRP, combiner C (x pi, calculé selon 4.1) avec HRP (2 ul), 5% de NaN3 (3 pi) et du DTT (1,5 ul de 100 mM) dans un 1,7 ml tube de centrifugation.
- Ajouter N (y </ Em> pi, calculé conformément au point 4.1) et DPBS (23,5 - x - y) ul. Mélanger avec une pointe de pipette avec un mouvement tourbillonnant.
- Centrifuger le mélange à 8000 g pendant 2 min et incuber à température ambiante pendant une nuit.
ATTENTION: les régents utilisés pour le dosage de l'activité suivante sont hautement toxiques. Utilisez les recommandations de sécurité spécifiques par les fiches de données de sécurité correspondantes. - Par réaction enzymatique, immerger l'hydrogel dans 1 ml de cocktail de réaction contenant du N, N-diméthyl-p-phénylène diamine (5,8 mM), du phénol (5,8 mM) et de l'hydroperoxyde de tert-butyle (2,9 mM) dans du n-heptane 14. Perturber le gel manuellement en utilisant un embout de pipette pour augmenter la zone de surface de contact de l'hydrogel et le solvant.
- Détecter la HRP produit, un colorant du type indophénol, par mesure de l'absorbance optique des échantillons prélevés à des moments différents à 546 nm dans un lecteur de plaque (Figure 5). </ Ol>
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Representative Results
Un schéma pour la formation induite par une intéine de protéines d'hydrogel est présentée en figure 1A. Les blocs de construction de l'hydrogel sont la protéine copolymères ACTU-NpuN (N) et NpuC-S-ACTU (C) (figure 1A, tableau 1). NpuN / C sont les N-/C-fragments du DnaE naturellement intéine dissociée de Nostoc punctiforme (Npu). L'ACTU est une protéine trimérique stable de Pyrococcus horikoshii 4,5. Le mélange purifié de N et de C, en présence de l'agent réducteur DTT induit la formation d'une troisième protéine - le produit ligaturé (J:-S-ACTU ACTU) (figures 1A et 1C). Individuellement, les blocs de construction d'hydrogel N et C existent en tant que fluides visqueux (Figure 1B). Mélange de N et C donne un matériau semi-transparent solide qui est retenu sur le fond d'un flacon en verre, après inversion, indicative de la formation d'un hydrogel 15,16 (figure 1B), une8,19.
Cet hydrogel de protéine induite par une intéine (1,6 mM) présente une stabilité élevée en solution. Il est peu-à-pas de perte d'hydrogel réticulé échafaudage après 21 jours à 22 ° C dans du tampon DPBS, comme la quantité totale de protéine libérée dans le tampon DPBS ne dépasse que légèrement la quantité théorique de l'intéine épissé à partir de l'hydrogel (en supposant 100 % intéine efficacité de trans-épissage) (Figure 3A). Densitométrie a révélé que, lors de la formation d'hydrogel, les réactions de trans-épissage étaient ~ 80% d'efficacité (figure 1C). L'analyse sur gel SDS-PAGE a montré que seulement des traces du produit trans-épissé étaient présentes dans la mémoire tampon environnant de l'hydrogel (Figure 3B, bande J), ce qui confirme que la perte de l'hydrogel réticulé échafaudage à l'érosion est minimale. La principale protéine présente dans la mémoire tampon environnante de l'hydrogel est la épissé intéine. Aucun signe visible d'érosion ont été observés dansun hydrogel non perturbé immergé dans une solution aqueuse à température ambiante pendant plus de 3 mois (Figure 3A d'entrée d'). L'hydrogel est également très stable à 37 ° C (Figure 3C) et dans les deux tampons acides et basiques (figure 3D).
Pour faciliter l'immobilisation des protéines, une paire de protéines et son ligand peptidique a été utilisée pour ancrer des protéines d'intérêt dans l'échafaudage d'hydrogel. Nous avons choisi la protéine SH3, une homologie Src 3 domaine de la CRK protéine adaptatrice, comme la protéine d'amarrage (DP) pour la fusion d'une protéine d'intérêt, et son ligand (SH3 lig) que le peptide de la station d'accueil (DSP) pour l'incorporation dans l'échafaud d'hydrogel. Cette paire d'interaction a été choisi en raison de la taille relativement petite moléculaire (56 aa pour SH3 et 11 bis pour SH3 lig) et une forte affinité (Kd = 0,1 M) 17,18. SH3 lig a été inséré entre NpuC et l'ACTU pour former C-SH3 lig(Tableau 1). La protéine SH3 a été fusionné à l'extrémité N-terminale d'une protéine globulaire de cible modèle, la protéine fluorescente verte (GFP) pour former SH3-GFP. Le procédé décrit dans le protocole (article 5, figure 4A), on obtient un hydrogel contenant 1,2 mM trans-épissage hydrogel squelette blocs de construction et mM GFP 1.2. L'hydrogel contenant GFP-présentait une stabilité similaire à l'hydrogel manque GFP (figure 4B) avec ~ 35% de perte de protéine totale après 21 jours dans du tampon DPBS. La plupart des protéines présentes dans le tampon d'érosion sont les intéines clivées. Le taux de lixiviation de SH3-GFP à partir d'un hydrogel contenant de la lig SH3 est de ~ 30% au bout de 3 semaines, de manière significative plus petite que celle d'un hydrogel manquant de la lig SH3 (> 70% de la perte de protéines dans la même période de temps, la figure 4C). Le SH3-GFP immobilisée dans l'hydrogel rougeoie sous lumière UV. Comme on le voit sur la figure 4D, hydrogel contenant la station accueil PeptiSH3 de lig conserve la plupart de la fluorescence de la GFP au bout de 3 semaines, tandis que l'hydrogel manque SH3 lig devient essentiellement non fluorescent. Il est prévu que l'utilisation d'une affinité DP / DSP pair plus élevé peut réduire davantage le taux de la protéine immobilisée de lixiviation.
Dans cette expérience, la GFP a été utilisé comme protéine cible, cependant, aucune protéine DP-marqué peut être facilement immobilisé dans cet hydrogel. Ainsi, l'hydrogel protéique induite par une intéine devrait fournir un échafaudage général pour l'immobilisation des protéines. La densité de la GFP montrent immobilisé dans ce travail est d'environ 33% en moles de l'hydrogel. Une densité d'immobilisation ultérieure peut éventuellement être réalisé lors de DSP multiples sont intégrés dans le bloc de construction d'hydrogel.
Ensuite, l'enzyme HRP a été incorporé dans l'hydrogel protéique de démontrer sa capacité à soutenir la biocatalyse dans les solvants organiques. L'activité enzymatique a été mesurée en contrôlant le couplage oxydatif du
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Figure 1. Induite par une intéine hydrogel protéique. (A) Schéma de intéine réaction de trans-épissage qui déclenche la formation d'une chaîne protéique étendue (J) avec des protéines de reticulation aux deux extrémités. des protéines de reticulation à partir de plusieurs chaînes protéiques non covalente J associé et, sur induite par une intéine de protéines ligature, induisent la formation d'un réseau de protéines hautement réticulé ayant des propriétés d'hydrogel. NpuN / C: intéine N-/C-fragment. (B) le mélange de N et C purifiée (8,3% p / v) conduit à la formation d'un réseau d'hydrogel hautement réticulé (1,6 mM J). Analyse (C) SDS-PAGE de N et C blocs de construction purifiés avant et après le mélange. "N + C" correspond à un échantillon prélevé directement à partir d'un hydrogel de 1,6 mM. "*" Indique un clivage si intéine C-terminalproduit de la réaction de. Intensité de chaque bande a été quantifiée en utilisant le «module de trace dans le logiciel" Quantité One ". l'intensité de la bande a été divisé par le poids moléculaire de la protéine pour obtenir l'équivalent molaire. efficacité de trans-épissage (~ 80%) a été calculée à partir de la quantité du produit J n'ayant pas réagi et le N / C dans la même voie. Reproduit avec la permission de Journal of American Chemical Society. (Doi: 10.1021/ja401075s) Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 2. Cartes plasmidiques de constructions de protéines. (A) ACTU-NpuN, (B) NpuC-S-ACTU et (C) SH3-GFP (<strong> Tableau 1) ont été clonés dans pET26b vecteur sous le contrôle du promoteur T7. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 3. Stabilité des hydrogels de protéines intéine médiation dans DPBS. (A) le profil de l'érosion d'un hydrogel de 1,6 mM à 22 ° C. La ligne pointillée représente la masse théorique des intéines clivés. L'orifice d'entrée présente un hydrogel intact dans DPBS après 3 mois à température ambiante. (B) Analyse par SDS-PAGE de la mémoire tampon d'hydrogel entourant. Tous les échantillons de la mémoire tampon dans laquelle l'hydrogel a été immergée dans (A) ont été rassemblées (total 7,5 ml) et concentrées 75 fois par ultrafiltration à travers une 10 kDune membrane avant le chargement du gel J:. intéines produit trans-épissé N:.. n'ayant pas réagi ACTU-NpuN NpuN: épissé sur fragment N-intéine. C n'ayant pas réagi et épissé NpuC rupture ne sont pas visibles dans le gel en raison de la faible quantité et de petite taille (4 kDa), respectivement. L'astérisque indique bandes non identifiés. (C) le profil de l'érosion d'hydrogel incubés à des températures différentes. (D) le profil de l'érosion des hydrogels incubées à deux pH différents. Reproduit avec la permission de Journal of American Chemical Society. (Doi: 10.1021/ja401075s) Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 4. Intéine-hydrogel médiation prend en charge l'immobilisation de protéines globulaires fonctionnels. (A) Schéma d'immobilisation de protéines utilisant la GFP comme une protéine globulaire de modèle. Le bloc de construction d'hydrogel contenant DSP est d'abord mélangé avec le DP-fusion protéine cible de la protéine cible chargement sur le bloc de construction. La complémentaire intéine bloc de construction d'hydrogel contenant le fragment est ajouté au mélange qui donne un hydrogel avec la GFP immobilisé. (B) Total profil de l'érosion de la protéine d'hydrogel contenant un rapport molaire 1:1 de SH3-GFP. La ligne pointillée représente la masse théorique des intéines épissé. Les barres d'erreur représentent l'écart-type de deux expériences indépendantes. (C) Le lessivage profil de SH3-GFP de l'hydrogel avec et sans la DSP. (D) Les images de GFP contenant des hydrogels moins de l'exposition aux UV immédiatement après la formation de l'hydrogel et au bout de 21 jours. Reproduit avec la permission de Journal of American Chemical Society (doi:. 10.1021/ja401075s) Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 5. La peroxydase de raifort (HRP)-intéine piégé déclenchée Hydrogel de protéine facilite la réaction catalysée par la HRP dans un solvant organique le n-heptane. (A) réaction d'un Modèle catalysée par la HRP dans les solvants organiques. (B) Photographie d'hydrogels contenant HRP encapsulé après avoir été perturbé en petits fragments et incubées dans un cocktail de réaction pendant 10 min et 30 min (à gauche) et expérience de contrôle avec la même quantité de HRP non immobilisé dans un tampon DPBS (à droite). (C) La formation du produit a été contrôlée par absorbance à 546 nm. Adapté avec la permission de Journal de Ameripeut Chemical Society. (doi: 10.1021/ja401075s) Cliquez ici pour agrandir l'image.
Tableau 1. constructions de protéines utilisées dans cette étude.
| Nom court | Protein Sequence | MW (kDa) |
| ACTU-NpuN (N) | ACTU-EAC (GGGGS) 2-AS-NpuN-HHHHHH | 26,3 |
| NpuC-S-ACTU (C) | NpuC-CFNKLYRDPMG-[(AG) 3 PEG] 10 -ARMPYV-C utA- HHHHHH | 26.1 |
| NpuC-S-SH3 lig - ACTU (C-SH3 lig) | NpuC-CFNKLYRDPMG-[(AG) 3 PEG] 10 -ARMPYVGS- PPPALPPKRRR (GGGGS) 2-AS-ACTU-HHHHHH | 28,3 |
| SH3-GFP | SH3-KL (GGGGS) 2-AS-GFP-HHHHHH | 34,5 |
Reproduit avec la permission de Journal of American Chemical Society (doi: 10.1021/ja401075s).
Tableau 2. compositions tampons.
| Tampon A | 500 mM de NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 |
| Tampon DA | NaCl 500 mM, urée 8 M, 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0 |
| Tampon B | 500 mM de NaCl, 50 mM NaPOi, pH 6,0 |
| DPBS | De PBS Dulbecco, NaCl 137,9 mM KCl 2,7, 1,5 mM KH 2 PO 4, 8,1 mM Na 2 HPO 4, pH 7,4 |
Reproduit avec la permission de Journal of American Chemical Society (doi: 10.1021/ja401075s).
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Discussion
Dans ce travail, nous avons démontré la synthèse d'un hydrogel de protéine induite par une intéine très stable. L'utilisation d'une fraction de l'hydrogel permet intéine être conditionnellement formée en réponse au mélange de deux composants en phase liquide. Plus précisément, la scission de façon covalente relie intéine deux blocs de construction en phase liquide par une réaction de trans-épissage, ce qui donne une unité de polypeptide flanqué par des unités de réticulation qui à son tour, auto-assemble en un hydrogel. La formation induite par le mélange de l'hydrogel-contourne les difficultés techniques dans la synthèse des protéines à un seul composant hydrogels où le colmatage de gel à médiation par des colonnes de purification chromatographique peut se produire. En outre, les formes d'hydrogel dans des conditions physiologiques sans la nécessité pour toutes les inducteurs chimiques étrangers et / ou des déclencheurs physiques.
L'hydrogel de intéine médiation conserve une grande stabilité dans des tampons à la fois acides et basiques, et à la température physiologique. Hydrogels peuvent former wie aussi peu que 0,8 mM de chaque bloc de construction individuels (données non présentées), mais des concentrations plus élevées de protéines (~ 1,6 mM) hydrogels de rendement avec une meilleure stabilité mécanique. Une grande stabilité de l'hydrogel est attribuée à l'utilisation de 1) une protéine trimérique très stable, l'ACTU, comme un agent de réticulation, et 2) intéine à rejoindre de manière covalente différents agents de réticulation. Une analyse densitométrique de gels SDS-PAGE a montré que ~ 80% des protéines d'entrée a subi avec succès la scission de la réaction de trans-épissage d'intéine catalysée.
Pour la formation de l'hydrogel, des blocs de construction individuels sont tout d'abord concentrées à ~ 100 mg / ml. Un agent réducteur, tel que le DTT, doit être présent pendant l'étape de concentration de protéine pour empêcher la formation de liaisons disulfure intermoléculaires. En l'absence d'agent réducteur, concentré bloc de construction d'hydrogel particulier peut parfois former un matériau semblable à un hydrogel. Cependant, ce matériau de type gel se dissout rapidement lorsqu'il est immergé dans un tampon et / ou en présenced'un agent réducteur.
Pour obtenir un hydrogel avec le maximum de stabilité, il est important de veiller à ce que le rapport molaire des deux blocs de construction d'hydrogel est de 1:1. Un bloc de construction excès ne sera pas réticulé et peut affecter les propriétés mécaniques de l'hydrogel. Concentré de protéines doit être réparti en portions aliquotes et stockée individuellement pour réduire au minimum les cycles répétés de congélation-décongélation.
Nous avons également démontré l'utilisation de l'hydrogel de protéine induite par une intéine en tant que biocatalyseur-solvant organique compatible. Plus précisément, les hydrogels incorporant l'enzyme HRP ont été immergés dans du n-heptane contenant le substrat et la conversion réussie du substrat en produit a été observée. Hydrogel de protéine sert d'échafaudage efficace pour la biocatalyse dans un solvant organique probablement en raison de la protection contre la dénaturation de solvant organique à médiation offerte par le milieu hautement hydratée de l'hydrogel.
Une des limitations de thest la technologie de l'immobilisation enzyme est la nécessité de fusionner la protéine cible avec un peptide d'ancrage (DP). Cette modification peut affecter l'activité et la solubilité de certains protéine cible et donc exiger l'optimisation au cas par cas des constructions de protéines DP-marqués. En outre, une petite quantité de protéines marquées lessivé du peptide d'une station d'accueil (PSD) contenant un hydrogel après 1 semaine. La stabilité de la protéine immobilisée est affectée par l'affinité de la paire DSP / DP. Pour parvenir à une meilleure efficacité d'immobilisation, une paire d'affinité DSP / DP plus élevé sera nécessaire. Enfin, cette expositions d'hydrogel relativement faible propriété mécanique en raison de la faible module de stockage de plateau (100-200 kPa) 9. Le module de stockage de plateau est influencée par les structures à la fois de l'agent de réticulation et le bloc central 19. Dans l'hydrogel en cours, une protéine de trimère a été utilisé comme agent de réticulation. L'utilisation de protéines de réticulation avec un état multimérique supérieur peut potentiellement augmenter le plateau d'hydrogel storage module et sa propriété mécanique.
En résumé, nous rapportons la synthèse et la caractérisation d'un nouvel hydrogel protéique qui se forme sous la condition que le mélange de deux blocs de construction des protéines en phase liquide, contenant chacun une moitié d'une intéine dissociée. Hydrogels de protéines Intéine médiation représentent un nouveau matériau prometteur avec des applications potentielles dans des réactions de synthèse enzymatique, la synthèse organique, la livraison de drogues injectables, et le génie tissulaire.
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Disclosures
Aucun intérêt financier concurrentes existent.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le Dr David Tirrell (Caltech) pour son aimable don du plasmide pQE9 AC 10 ATRP 12, le Dr Tom Muir (Université de Princeton) pour son aimable don du plasmide KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, Dr Takehisa Matsuda (Kanazawa Institute of Technology, Hakusan, Ishikawa, Japon) pour son aimable don du plasmide PET30-ACTU-Astuce1 10, et le Dr Jay D. Keasling (UC Berkley) pour son aimable don du plasmide pJD757 13 . Ce travail a été financé en partie par la National Science Foundation CARRIÈRE, US Air Force PIJ et de recherche avancée Hackman Norman.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase |
New England BioLabs | M0530S |
|
| Competent Escherichia coli BL21 (DE3) |
New England BioLabs | C2527I |
|
| Luria Bertani |
VWR | 90003-350 |
|
| Bacto Agar Media |
VWR | ||
Kanamycin sulfate |
VWR | ||
| IPTG |
VWR | EM-5820 |
|
| Imidazole |
VWR | EM-5720 |
|
| Urea |
VWR | EM-9510 |
|
| Dithiothreitol (DTT) |
Fisher | BP172-5 |
|
| Protease Inhibitor cocktail |
Roche Applied Science | 11836153001 |
|
| DPBS |
VWR | 82020-066 |
|
| Brilliant Blue R |
Acros Organics | A0297990 |
|
| Sodium Azide |
Fisher | AC190380050 |
Caution, highly toxic |
| Horseradish peroxidase |
Sigma | P8125-5KU |
|
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine |
Fisher | AC408460250 |
Caution, highly toxic |
| phenol |
Fisher | AC149340500 |
Caution, highly toxic |
tert-butyl hydroperoxide |
Fisher | AC180340050 |
Caution, highly toxic |
| n-heptane |
Acros Organics | 120340010 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shaker/Incubator |
Fisher Scientific | Max Q 6000 |
|
| Centrifuge |
Sorvall | RC 6 |
|
| Sonicator |
QSonica | Misonix 200 |
|
| Ultrafiltration Tubes |
Amicon Ultra | UFC903024 |
|
| Ni Sepharose High Performance HisTrap column |
GE Healthcare Life Sciences | 17-5248-01 |
|
| HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column |
GE Healthcare Life Sciences | 17-5156-01 |
|
| Plate reader |
Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM |
References
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