Summary
אנו מציגים את הסינתזה של הידרוג'ל-תיווך intein פיצול חלבון. אבני הבניין של הידרוג'ל הזה הוא שני קופולימרים חלבון המכילים כל מקטע של חלבון trimeric המשמש כcrosslinker וחצי אחד של intein מפוצלת. ערבוב של שני קופולימרים החלבון מעורר תגובת טרנס שחבור intein, מניב יחידת פוליפפטיד שעצמי מרכיבה לתוך הידרוג'ל. הידרוג'ל זו משלבת חלבונים כדוריים מאוד פונקציונליים pH והטמפרטורה יציבה, תואם עם ממסים אורגניים, ובקלות.
Abstract
אנו מציגים את הסינתזה של חלבון הידרוג'ל מאוד יציב בתיווך תגובת טרנס שחבור-זרז intein פיצול חלבון. אבני הבניין של הידרוג'ל זה שני בלוק קופולימרים חלבון המכילים כל מקטע של חלבון trimeric המשמש כcrosslinker וחצי אחד של intein מפוצלת. סליל אקראי הידרופילי מאוד מוכנס לתוך אחד מבלוק קופולימרים להחזקת מים. ערבוב של שני קופולימרים לחסום חלבון מעורר תגובת טרנס שחבור intein, מניב יחידת פוליפפטיד עם crosslinkers בכל צד שמהירות עצמי מרכיב להידרוג'ל. הידרוג'ל זה מאוד יציב תחת שני תנאים חומציים ובסיסיים, בטמפרטורות של עד 50 מעלות צלזיוס, ובממסים אורגניים. הידרוג'ל במהירות רפורמות לאחר קרע מושרה גזירה. התאגדות של "פפטיד תחנת עגינה" לאבן בניין הידרוג'ל מאפשרת שילוב נוח של "חלבון עגינה" מתויג חלבוני יעד.הידרוג'ל תואם תקשורת צמיחה בתרבית רקמה, תומך בדיפוזיה של מולקולות 20 kDa, ומאפשר הקיבוע של חלבונים כדוריים ביו. היישום של הידרוג'ל חלבון intein בתיווך כbiocatalyst אורגני ממס תואם הודגם על ידי המתמצת את אנזים peroxidase חזרת והאימות את פעילותה.
Introduction
הידרוג עשוי כולו מחלבונים לשאת הפוטנציאל לקדם באופן משמעותי תחומים מגוונים כמו הנדסת רקמות, אספקת הסמים וbiofabrication 1. הם מציעים יתרונות על פני הידרוג פולימר סינטטי מסורתי כולל התאמה ביולוגית ואת הפוטנציאל לתמוך שילוב של חלבונים כדוריים ביו noninvasively.
בעבודה זו, אנו מתארים את הפיתוח של הידרוג'ל חלבון חדש שנוצר באמצעות תגובה-תיווך intein פיצול חלבון טרנס שחבור ויישומה כפיגום קיבוע חלבון (איור 1). אבני הבניין להידרוג'ל זה שני בלוק קופולימרים חלבון בכל המרכיבים את שבר N-או C-המסוף של פיצול intein (IN וIC) ומקטע של חלבון crosslinker Multimeric. DnaE intein מpunctiforme Nostoc (NPU) שימש כפיצול intein 2,3 וחלבון קטן trimeric (12 KDA) CutA מPyrococcus horikoshii </ Em> שימש כ4,5 חלבון crosslinker. הם הצטרפו crosslinkers שונה באמצעות תגובת טרנס שחבור זרז intein, מה שמוביל להיווצרות של רשת crosslinked מאוד חלבון (הידרוג'ל). intein NPU נבחרה בגלל קינטיקה שלה תגובה מהירה (t 1/2 = 63 שניות) ותשואה גבוהה טרנס שחבור (קרוב ל80%) 2,3. חלבון CutA נבחר כcrosslinker בשל היציבות הגבוהה שלה. יש לי trimers CutA טמפרטורת denaturation של ליד 150 ° C ולשמור על מבנה של הרביעון trimeric בפתרונות המכילים ככל 5 M hydrochloride guanidine 4,6. מאז החלפת מקטע בין crosslinkers השונים היא תורם עיקרי לשחיקת משטח הידרוג'ל הפיזי 7, האינטראקציה מקטע היתר חזקה מאוד בCutA צריכה להרתיע חילופי מקטע כזה, מה שמוביל להידרוג'ל יציב יותר. אחת מאבני הבניין הללו מכיל גם פפטיד S-בר הידרופילי מאוד כפי שאמצע הבלוק כדי להקל על מיםשמירה 8.
ערבוב של שני אבני בניין הידרוג'ל יוזם תגובת טרנס שחבור בין IN וIC intein ברים, יצירת שרשרת פוליפפטיד כבר עם crosslinkers בשני המסופים. Crosslinkers מיחידות מולקולריות כגון מרובות לתקשר אחד עם השני, ויוצר רשת crosslinked מאוד הידרוג'ל (איור 1 א). "פפטיד עגינה תחנה" ספציפי (DSP) הוא שולב אחד מאבני בניין הידרוג'ל כדי להקל על קיבוע יציב של "חלבון עגינה" (DP), מתויג חלבון המטרה להידרוג'ל. השימוש בפיצול intein לתווך ההרכבה הידרוג'ל לא רק מספק גמישות נוספת לסינתזת הידרוג'ל החלבון, אלא גם מאפשר צפיפות גבוהה, טעינה אחידה של חלבון המטרה לאורך כל הידרוג'ל, כמו חלבוני היעד נטענים לפני היווצרות הידרוג'ל.
הידרוג'ל החלבון בתיווך intein הוא STA מאודble בתמיסה מימית עם מעט לשחיקה לא לגילוי לאחר 3 חודשים בטמפרטורת חדר. יציבות נשמרת במגוון רחב של PHS (6-10) וטמפרטורות (4-50 מעלות צלזיוס), והידרוג'ל הוא גם תואם עם ממסים אורגניים. הידרוג'ל זה משמש לקיבוע של שני חלבונים כדוריים: החלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP) והחזרה peroxidase (HRP). הידרוג'ל הכולא החלבון האחרון משמש לבצע biocatalysis בממס אורגני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בניית פלסמיד
הערה: כל הגנים היו מוגבר בתגובות סטנדרטיות PCR באמצעות Phusion גבוהים פידליטי DNA פולימראז לפי המפרטים של היצרן. פריימרים המשמשים לשיבוט תוארו בעבר 9. כל המבנים מפורטים בטבלה 1.
- כדי ליצור CutA-NpuN (N, טבלת 1):
- PCR להגביר גנים CutA וNpuN מפלסמידים pET30-CutA-Tip1 10 ו11 KanR-IntRBS-NpuNC-CFN, בהתאמה, תוך שימוש בפריימרים המתאימים.
- לעכל שברים אלה עם אנזימי ההגבלה המתאימים ורצף להוסיף שברים אלה לתוך וקטור pET26b בין אמרגן T7 ותג 6xHistidine טרמינל C-לייצר N (איור 2 א).
- כדי ליצור NpuC-S-CutA (C, טבלת 1):
- fragmen PCR להגביר NpuC, CutA ו-St [AG 3 (PEG)] 10 מפלסמיד 11 KanR-IntRBS-NpuNC-CFN, pET30-CutA-Tip1 10 וpQE9 AC 10 12 Atrp, בהתאמה, תוך שימוש בפריימרים המתאימים.
- לעכל שברים אלה עם אנזימי ההגבלה המתאימים ורצף להוסיף שברים אלה לתוך וקטור pET26b בין אמרגן T7 ו6xHistidine טרמינל C-ליצור C (איור 2).
- כדי ליצור NpuC-S-SH3 lig-CutA (lig C-SH3, טבלת 1):
- PCR להגביר CutA באמצעות פריימרים המכילים lig SH3 (PPPALPPKRRR) ומקשר גמיש (GGGGS) 2 כדי ליצור שבר SH3 lig-CutA.
- להחליף את גן CutA מC עם SH3 הבר lig-CutA.
- כדי ליצור SH3-GFP (טבלת 1):
- להגביר את גן SH3 מפלסמיד pJD757 13 באמצעותפריימרים מתאימים.
- הפתיל שבר זה לגן ה-GFP ולהכניס אותו לתוך וקטור pET26b בין אמרגן T7 (איור 2 ג) ותג 6xHistidine C-מסוף.
2. ביטוי חלבון
- להפוך 50 μl של כימי המוסמך Escherichia coli BL21 (DE3) עם פלסמיד הביטוי ההולם.
- לאחר שינוי, סדרתי לדלל את התאים האלה, וצלחת אותם על לוריא-Bertani (LB) / צלחות אגר המכילות 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin.
- דגירה צלחות המכילות תאים הפכו ב37 מעלות צלזיוס במשך ~ שעות 15.
- לאחר דגירה, להרים צלחת המכילה 50-100 מושבות וresuspend כל המושבות ב5 מיליליטר של מרק LB.
- העברת השעיה ל1 kanamycin L LB מרק המכיל (50 מיקרוגרם / מיליליטר) ולגדל תאים על 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב250 סל"ד. לנטר את הספיגה ב 600 ננומטר (OD 600). לגדול בתרבות עד OD 600 ~ 0.8.
- עבור lig C ו-C-SH3, לגרום ביטוי חלבון על ידי הוספת איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) לתרבות (ריכוז סופי 1 מ"מ) ודגירת התרבות ב37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות תוך רועד ב250 סל"ד.
- עבור N וSH3-GFP, לקרר את התרבות ל~ 18 מעלות צלזיוס ידי טבילת בקבוק התרבות באמבט מי קרח ל~ 5 דקות. לגרום ביטוי חלבון על ידי הוספת IPTG לתרבות (ריכוז סופי 1 מ"מ) ודגירת התרבות ב18 מעלות צלזיוס במשך שעה 14-18 תוך רועד ב250 סל"ד.
- אחרי ביטוי חלבון, צנטריפוגות התרבות ב6,000 XG עבור 20 דקות ב 4 ° C לאסוף את הכדור. תא גלולה חנות ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
3. טיהור חלבון
- טיהור של N (denaturing תנאים)
- כדורי תא גלול במאגר (טבלה 2) בשעה 10 מיליליטר / גרם של גלולה רטובה.
- Immersדואר ההשעיה גלולה באמבט קרח מים ולשבש תאים על ידי sonication (Amp 10, עם דופק 1 שניות והפסקת שניות 6 דקות 1).
- צנטריפוגה lysate XG 16,000 עבור 20 דקות ב 4 ° C.
- בטל supernatant. Resuspend את הכדור בהצפה DA (המכיל 8 מ אוריאה) וצנטריפוגה ההשעיה XG 16,000 עבור 20 דקות ב 4 ° C.
- להעביר את supernatant דרך עמודה 5 חומצת Ni-nitrilotriacetic מיליליטר (נ.ת. ע) equilibrated בעבר עם תובע חיץ.
- לשטוף טור עם 30 מיליליטר של הצפת DA בתוספת 45 imidazole מ"מ. Elute חלבון מטוהר באמצעות 20 מיליליטר של הצפת DA בתוספת 150 imidazole מ"מ.
- להפחית את ריכוז האוריאה במדגם החלבון ל< 1 מ"מ על ידי אחד משתי השיטות הבאות שניתן ב3.1.7.1 או 3.1.7.2:
- Dialyze חלבון במאגר DPBS (טבלה 2) בשעה 4 בלילה מעלות צלזיוס באמצעות צינורות עם <20 הפסקת kDa.
- צנטריפוגה מטוהרים חלבון ב# 30 &160; עמודת kDa Ultra-סינון ספין ב2,800 XG, 4 ° C עד הנפח הוא פחות מ 1 מיליליטר. הוסף חוצץ 14 DPBS מיליליטר לעמודה לדלל מדגם החלבון. חזור צנטריפוגה / דילול צעדים שלוש פעמים נוספות.
- לאחר חילופי חיץ, להוסיף dithiothreitol (DTT) לחלבון מטוהר (סופי 2 מ"מ) ולהתרכז חלבון ל~ 100 מ"ג / מיליליטר על ידי צנטריפוגה דרך עמודת 30 kDa Ultra-סינון ספין ב2,800 XG, 4 ° C.
- Aliquot החלבון וחנות מרוכזים ב-80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- טיהור של lig C ו-C-SH3 (מצב מקורי)
- כדורי תא גלול במאגר B (pH 6.0) (טבלה 2) בתוספת מעכבי פרוטאז קוקטייל 1x ב10 מיליליטר / גרם של גלולה רטובה. השתמש חיץ חומצי כדי למזער את השפלת מפרקי חלבונים של חלבון המטרה.
- לשבש את ההשעיה תא על ידי sonication כמתואר ב3.1.2. צנטריפוגה ליסאכלתי בXG 16,000 ל20 דקות ב 4 ° C ולשמור את supernatant.
- להעביר את lysate המסיסים באמצעות Ni-נ.ת. ע עמודת 5 מ"ל equilibrated בעבר עם B. החיץ
- טור לשטוף עם הצפת B בתוספת imidazole 45 מ"מ, וelute חלבון המטרה ב20 מיליליטר של הצפת B בתוספת 150 imidazole מ"מ.
- לג, דלג לשלב 3.2.6. עבור lig C-SH3, לבצע צעד נוסף חילופי יונים טיהור להסיר חלבון מושפל באופן חלקי, כפי שנמסר בצעדים 3.2.5.1 ל3.2.5.3
- להפחית את ריכוז NaCl בlig C-SH3 ל< 1 מ"מ ביצוע ההליך המתואר ב3.1.7.
- טען את חלבון המטרה על גבי 5 עמודת מיליליטר אניון חרוזים מחליף agarose מטריצת equilibrated בעבר עם חיץ פוספט נתרן (50 מ"מ, pH 7.0).
- חלבון מטרת Elute מהעמודה על ידי הפעלה הדרגתית מתמיסה המכילה buffe 8.0 pH 10 מ"מ טריס-HClr לתמיסה המכילה את אותו החיץ בתוספת 1 M NaCl. לקחת דגימות במהלך elution חלבון ודגימות בריכה עם הטוהר הגבוה ביותר המבוסס על אלקטרופורזה נתרן גופרתי dodecyl polyacrylamide ג'ל (SDS-PAGE).
- חיץ להחליף החלבונים המטוהרים למאגר DPBS, כפי שתואר ב3.1.7.
- הוספת DTT לחלבון מטוהר (הריכוז סופי 2 מ"מ) ולרכז את החלבון ל~ 100 מ"ג / מיליליטר באמצעות טור ספין Ultra-סינון 30 kDa כפי שמתואר ב3.1.8. Aliquot ולאחסן מרוכז חלבון ב-80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- טיהור SH3-GFP
- כדורי תא resuspend באמצעות הצפת ב10 מיליליטר / גרם של גלולה רטובה.
- לשבש השעיה גלולה ידי sonication כמתואר ב3.1.2.
- צנטריפוגה lysate XG 16,000 ל20 דקות ב 4 ° C ולאסוף את supernatant.
- להעביר את supernatant (lysate מסיס) דרך עמודת Ni-נ.ת. ע 5 מ"ל equilibrated בעבר עםא חיץ
- לשטוף טור עם 30 מיליליטר של הצפת בתוספת 45 imidazole מ"מ. Elute חלבון מטוהר באמצעות 20 מיליליטר של הצפת בתוספת 150 imidazole מ"מ.
- חיץ להחליף חלבונים המטוהרים למאגר DPBS באמצעות גישה דומה לזה שתואר ב3.1.7 ולרכז את החלבון ל~ 150 מ"ג / מיליליטר באמצעות טור ספין Ultra-סינון 30 kDa כפי שמתואר ב3.1.8.
- Aliquot ולאחסן מטוהרים חלבון ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- SDS-PAGE ניתוח של דגימות מטוהרים המכילות CutA
- לדלל כל חלבון מטוהר במים מזוקקים כפולים כדי להפחית את ריכוז NaCl ל~ 1 מ"מ. בריכוז NaCl זה, רוב חלבוני trimer CutA לרוץ כמו מונומרים על ג'לי-SDS.
- מערבבים את הדגימות עם חיץ מדגם SDS 2x (0.5 M טריס-HCl, pH 6.8, 20% גליצרול, 10% w / v SDS, 0.1% w / 2% β-mercaptoethanol bromo-פנול v הכחול,), טופחו על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- טען את סםPles על 12% ג'ל SDS-PAGE. לבצע אלקטרופורזה במתח מתמיד של 200 V ל~ 50 דקות.
- שים לב לחלבון בג'לים על ידי צביעה עם R250 הכחול המבריק Coomassie הבא הפרוטוקולים סטנדרטיים (איור 1 ג).
4. גיבוש הידרוג'ל
הערה: הידרוג המדגם שנעשה במחקר זה מכיל 1.6 מ"מ של כל אבן בניין הידרוג'ל אלא אם צוין אחרת. ריכוז חלבון זה מניב הידרוג'ל רך ויציב. זהירות: יזיד הנתרן (NAN 3) הוא הוסיף להידרוג'ל לריכוז סופי של .0.5% w / v כדי למנוע זיהום חיידקים. NaN 3 הוא רעילים מאוד ויש לטפל בם בזהירות רבה כפי שצוינו בגיליון בטיחות חומר.
- לחשב את הנפח של כל אחד מהחלבונים מרוכזים הדרושים להשגת ריכוז סופי של 1.6 מ"מ בהידרוג'ל מדגם μl 100. לדוגמא:
ריכוז של N:100 מ"ג / מיליליטר
משקל מולקולרי של N: 26.3 kDa (ראה טבלת 1)
ריכוז 100 μl רצוי:: נפח רצוי 1.6 מ"מ
- כדי להפוך הידרוג'ל μl 100 (1.6 מ"מ), ומערבב C (x μl, נפח מחושב לפי 4.1) עם 5% 3 NaN (10 μl), המחושב 100 מ"מ DTT (5 μl) ו-N (μl y, נפח פי 4.1) בתוך בקבוקון זכוכית 2 מיליליטר.
- הוסף חוצץ DPBS ((85 - x - μl y)) לבקבוקון כדי להשיג נפח סופי של μl 100, ומערבבים באופן ידני את כל המרכיבים באמצעות תנועות סיבוביות באמצעות קצה פיפטה. הערה: הפתרון הופך צמיג מאוד על ערבוב.
- צנטריפוגה את התערובת במשך 2 דקות ב 8,000 XG כדי להסיר בועות האוויר.
- דגירה את התערובת בחדרטמפרטורה בלילה כדי לאפשר תגובת intein טרנס השחבור להגיע לסיום. לאשר הקמת הידרוג'ל ידי הפיכת צינור הפוכה. החלבונים לא יזרמו אם הידרוג'ל נוצר.
- להעריך את תשואת intein טרנס השחבור על ידי בדיקת דגימות (0.5 μl כל אחד) שנאספו לפני שלב 4.2 ואחרי שלב 4.5 על ג'ל SDS-PAGE, כפי שתואר ב3.4 (תרשים 1C).
5. חוסר תנועה של ה-GFP באמצעות חלבון עגינה (DP) ותחנת עגינה לפפטיד אינטראקציה (DSP)
- כדי להפוך הידרוג'ל פונקציונליות GFP 50 μl (1.2 מ"מ), לשלב lig C-SH3 (x μl, המחושב על פי 4.1) וSH3-GFP (μl y, מחושב לפי 4.1) ב1:1 טוחנת ב1.7 צינור מיליליטר microcentrifuge דגירה את התערובת בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות.
- הוסף 5% NaN 3 (5 μl), 100 מ"מ DTT (2.5 μl), (42.5 - x - <em> y DPBS μl) לאותו צינור. הוספת N (μl y, מחושב לפי 4.1) כדי להשיג יחס של 1:1 טוחנת של lig N ו-C-SH3. מערבבים את הדגימה באמצעות פיפטה קצה על ידי תנועות סיבוביות.
- צנטריפוגה את התערובת על 8,000 XG במשך 2 דקות ו דגירה את התערובת בטמפרטורת חדר למשך הלילה בחושך. הידרוג'ל encapsulating צורות SH3-GFP במהלך דגירה.
6. שימוש ב1.6 מ"מ Hydrogel כפיגום קיבוע לתגובה האנזימטית בממס אורגני
- השתמש HRP כאנזים מודל. הכן פתרון מניות של HRP (מ"ג 28 / מיליליטר או 0.63 מ"מ) בDPBS.
- כדי להפוך הידרוג'ל μl 30 (1.6 מ"מ) כולאים HRP, לשלב C (x μl, המחושב על פי 4.1) עם HRP (2 μl), 5% NaN 3 (3 μl) וDTT (1.5 μl של 100 מ"מ) בתוך צינור צנטריפוגות 1.7 מיליליטר.
- הוספת N (y <μl / em>, המחושב על פי 4.1) וDPBS (23.5 - μl y) - x. מערבבים עם קצה פיפטה עם תנועות סיבוביות.
- צנטריפוגה את התערובת על 8,000 XG במשך 2 דקות ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך הלילה.
זהירות: העוצרים משמשים עבור assay הפעילות הבא הם רעילות ביותר. השתמש בהמלצות בטיחות ספציפיות על ידי גיליונות נתוני בטיחות חומרים המתאימים. - לתגובה האנזימטית, להטביע את הידרוג'ל ב 1 מיליליטר של קוקטייל תגובה המכיל N, N-diamine דימתיל-P-phenylene (5.8 מ"מ), פנול (5.8 מ"מ) וhydroperoxide טרט בוטיל (2.9 מ"מ) בn-heptane 14. ידני לשבש את הג'ל באמצעות קצה פיפטה כדי להגדיל את שטח הפנים של מגע הידרוג'ל והממס.
- זיהוי מוצר HRP, צבע indophenol סוג, על ידי מדידת הספיגה האופטית של דגימות שנלקחו בזמנים שונים ב546 ננומטר בקורא צלחת (איור 5). </ Ol>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סכמטי להיווצרות החלבון הידרוג'ל intein תיווך מוצג באיור 1 א. אבני הבניין של הידרוג'ל הוא חלבון קופולימרים CutA-NpuN (N) וNpuC-S-CutA (ג) (איור 1 א, טבלת 1). NpuN / C הוא N-/C-fragments של DnaE לפצל באופן טבעי intein מpunctiforme Nostoc (NPU). CutA הוא חלבון trimeric יציב מPyrococcus horikoshii 4,5. ערבוב של N מטוהר ו-C בנוכחות סוכן הפחתת DTT גורם להיווצרות חלבון שלישי - מוצר ligated (J: CutA-S-CutA) (איורים 1 א ו 1 ג). בנפרד, את אבני בניין הידרוג'ל N ו-C קיימים נוזלים צמיג כ( איור 1). ערבוב של N ו-C תשואות חומר שקוף חצי מוצק שנשמר בחלק התחתון של בקבוקון זכוכית לאחר היפוך, מעיד על היווצרות של 15,16 (איור 1) הידרוג'ל 18,19.
הידרוג'ל זה intein בתיווך החלבון (1.6 מ"מ) מפגין יציבות פתרון גבוהה. אין כמעט לשום הפסד של פיגום הידרוג'ל crosslinked לאחר 21 ימים ב22 ° C במאגר DPBS, כסכום הכולל של חלבון משתחרר לחיץ DPBS רק מעט עולה על הסכום התיאורטי של intein איחתה מהידרוג'ל (בהנחת 100 (איור 3A% intein יעילות טרנס שחבור)). צפיפות עולה כי, במהלך היווצרות הידרוג'ל, תגובות טרנס שחבור היו ~ 80% יעילים (איור 1 ג). ניתוח ג'ל SDS-PAGE הראה שנתגלה רק עקבות של המוצר-איחה טרנס נכחו בחיץ שמסביב של הידרוג'ל (איור 3B, להקת J), המאשרות כי אובדן של פיגום הידרוג'ל crosslinked לשחיקה היא מינימאלי. הווה החלבון העיקרי בחיץ שמסביב של הידרוג'ל הוא הנגזרים מן intein. לא נראו סימנים לשחיקה נצפו בהידרוג'ל באין מפריע מתחת למים בתמיסה מימית בטמפרטורת חדר במשך 3 חודשים (כניסת איור 3 א). הידרוג'ל הוא גם יציב מאוד על 37 ° C (איור 3 ג) ובשני מאגרים חומציים ובסיסיים (איור 3D).
כדי להקל על חוסר תנועת חלבון, זוג החלבון ויגנד פפטיד שימש לעגון חלבונים של עניין לפיגום הידרוג'ל. אנחנו בחרנו בחלבון SH3, הומולוגיה Src תחום 3 מCRK חלבון מתאם, כמו חלבון העגינה (DP) להיתוך לחלבון של עניין, ויגנד (lig SH3) כפפטיד תחנת עגינה (DSP) לצורך שילובם פיגום הידרוג'ל. זוג אינטראקציה זו נבחר בגלל הגודל המולקולרי הקטן יחסית (56 aa לSH3 ו11 aa לlig SH3) וזיקה גבוהה (ד k = 0.1 מיקרומטר) 17,18. lig SH3 הוכנס בין NpuC וCutA כדי ליצור lig C-SH3(טבלה 1). חלבון SH3 היה התמזגו לN-הסופית של חלבון מטרת מודל כדורי, חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ליצירת SH3-GFP. התהליך שתואר בפרוטוקול (סעיף 5, איור 4 א) מניב הידרוג'ל המכיל 1.2 לוקי שחבור טרנס מ"מ עמוד השדרה הידרוג'ל בניין ו1.2 מ"מ ה-GFP. הידרוג'ל המכיל GFP הציג יציבות דומה להידרוג'ל חסר GFP (איור 4) עם ~ כולל 35% אובדן חלבון לאחר 21 ימים במאגר DPBS. רוב החלבונים המצויים במאגר השחיקה היה inteins ביקע. שיעור השטיפה של SH3-GFP מהידרוג'ל המכיל lig SH3 הוא ~ 30% אחרי 3 שבועות, קטן יותר באופן משמעותי מזה מהידרוג'ל חסר lig SH3 (> 70% אובדן חלבון באותה תקופה של זמן, איור 4C). SH3-GFP המשותק בהידרוג'ל זוהר תחת אור UV. כפי שניתן לראות באיור 4D, הידרוג'ל המכיל pepti תחנת העגינהlig דה SH3 שומר את רוב הקרינה ה-GFP אחרי 3 שבועות ואילו הידרוג'ל חסר lig SH3 הופך למעשה nonfluorescent. צפוי כי השימוש בDP / זוג DSP זיקה גבוה יותר יכול להמשיך להפחית את שיעור השטיפה של החלבון המשותק.
בניסוי זה, ה-GFP שימשה כחלבון המטרה, אך כל חלבון מתויג-DP יכול להיות משותק בנוחות לתוך הידרוג'ל זה. לפיכך, הידרוג'ל חלבון intein התיווך אמור לספק פיגום כללי לקיבוע חלבון. הצפיפות של ה-GFP המשותק להפגין בעבודה זו הוא ~ 33% mol של הידרוג'ל. צפיפות קיבוע גבוהה יותר ניתן להשיג באופן פוטנציאלי, כאשר DSP המרובים שולב אבן בניין הידרוג'ל.
בשלב הבא, את אנזים HRP שולב הידרוג'ל החלבון כדי להוכיח את יכולתה לתמוך biocatalysis בממסים אורגניים. פעילות אנזים נמדדה על ידי ניטור צימוד חמצוני של
_upload/51202/51202fig1.jpg "/>
איור 1. הידרוג'ל חלבון intein בתיווך. שרטוטים (א) לintein תגובת טרנס שחבור שמפעילה את היווצרות שרשרת מורחבת חלבון (J) עם חלבוני crosslinker בשני טרמיני. חלבוני crosslinker מרשתות מרובות J חלבון noncovalently עמית ו, על קשירת חלבונים בתיווך intein, לגרום להיווצרות של רשת חלבון מאוד צולבים עם מאפייני הידרוג'ל. NpuN / C: intein N-/C-fragment. (ב) ערבוב של N מטוהר ו-C (.8.3% w / v) מוביל להיווצרות של רשת crosslinked מאוד הידרוג'ל (1.6 מ"מ J). ניתוח (C)-SDS של אבני בניין מטוהר N ו-C לפני ואחרי הערבוב. "N + C" מתאים לדגימה שנלקחה ישירות מהידרוג'ל 1.6 מ"מ. "*" מציין si מחשוף בטרמינל C-inteinמוצר התגובה דה. אינטנסיביות של כל להקה הייתה לכמת באמצעות 'מודול העקבות בתוכנה "כמות אחת". עוצמת להקה מחולקת במשקל המולקולרי של החלבון כדי לקבל את המקבילה טוחנת. יעילות חוצה שחבור (~ 80%) חושב מהסכום של המוצר J וN / C unreacted באותה הסמטה. התפרסם באישור כתב העת של האגודה האמריקנית לכימיה. (DOI: 10.1021/ja401075s) לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. מפות פלסמיד של מבני חלבונים. () CutA-NpuN, (ב) NpuC-S-CutA ו( C) SH3-GFP (<strong> טבלת 1) משובט לתוך וקטור pET26b תחת השליטה של אמרגן T7. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. יציבות של הידרוג חלבון intein בתיווך בDPBS. () פרופיל שחיקת הידרוג'ל 1.6 מ"מ ב22 ° C. קו מקווקו מייצג את המסה התיאורטית של inteins ביקע. הכניסה מציגה הידרוג'ל באין מפריע בDPBS לאחר 3 חודשים בטמפרטורת חדר. (ב) SDS-PAGE ניתוח של החיץ שמסביב של הידרוג'ל. כל הדגימות למאגר שבו היה שקוע בהידרוג'ל () היו נקוות (סה"כ 7.5 מיליליטר) והתרכזו 75 פי דרך אולטרה דרך 10 KDקרום לפני טעינת ג'ל J:. מוצר intein-איחה טרנס N:.. CutA-NpuN unreacted NpuN: הנגזרים מן שבר N-intein. C unreacted ונגזרים מן NpuC אינם נראים לעין בג'ל בשל הכמות הקטנה וגודל קטן (4 KDA), בהתאמה. הכוכבית מציינת להקות לא מזוהות. (C) פרופיל שחיקת הידרוג'ל הודגרו בטמפרטורות שונות. (ד) פרופיל שחיקת הידרוג טופח על שני PHS שונה. התפרסם באישור כתב העת של האגודה האמריקנית לכימיה. (DOI: 10.1021/ja401075s) לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 4. Intein-הידרוג'ל תיווך תומך בחוסר התנועה של חלבונים כדוריים פונקציונליים. (א) סכמטי של חוסר תנועת חלבון באמצעות GFP כחלבון כדורי מודל. אבן בניין הידרוג'ל המכיל DSP מעורבב ראשונה עם חלבון המטרה התמזגו-DP להעמסה חלבון המטרה על גבי אבן הבניין. המשלים intein אבן בניין הידרוג'ל המכיל בר מתווסף לתערובת מניב הידרוג'ל עם GFP המשותק. (ב) פרופיל שחיקת חלבון סה"כ של הידרוג'ל המכיל 1:1 טוחנת של SH3-GFP. קו מקווקו מייצג את המסה התיאורטית של inteins הנגזרים מן. הברים השגיאה מייצגים סטיית התקן של 2 ניסויים בלתי תלויים. (ג) שטיפת פרופיל של SH3-GFP מהידרוג'ל עם וללא DSP. תמונות (ד ') של ה-GFP מכילה הידרוג תחת חשיפה לקרינת UV באופן מיידי לאחר היווצרות הידרוג'ל ואחרי 21 ימים. התפרסם באישור כתב העת של האגודה האמריקנית לכימיה (DOI:. 10.1021/ja401075s) לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 5. חזרת peroxidase (HRP) וממולכד-הידרוג'ל החלבון intein-מופעל מאפשר תגובת זרז-HRP בממס אורגני n-heptane. () תגובת דגם זרזה ידי HRP בממסים אורגניים. (ב) צילום של הידרוג מכיל HRP במארז לאחר ששבש לרסיסים קטנים וטופחו בקוקטייל תגובה ל10 דקות ו30 דקות (משמאל) וניסוי ביקורת עם אותה הכמות של HRP nonimmobilized במאגר DPBS (מימין). היווצרות מוצרים (ג) הייתה במעקב על ידי הספיגה ב 546 ננומטר. הותאם באישור Journal of אמרייכול כימית חברה. (DOI: 10.1021/ja401075s) לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
טבלת 1. מבני חלבון המשמשים במחקר זה.
| שם קצר | רצף חלבון | MW (KDA) |
| CutA-NpuN (N) | CutA-EAC-(GGGGS) 2-AS-NpuN-hhhhhh | 26.3 |
| NpuC-S-CutA (C) | NpuC-CFNKLYRDPMG-[(AG) PEG 3] 10 -ARMPYV-C אוטה- Hhhhhh | 26.1 |
| lig NpuC-S-SH3 - CutA (lig C-SH3) | NpuC-CFNKLYRDPMG-[(AG) 3 PEG] 10 -ARMPYVGS- PPPALPPKRRR-(GGGGS) 2-AS-CutA-hhhhhh | 28.3 |
| SH3-GFP | SH3-KL-(GGGGS) 2-AS-GFP-hhhhhh | 34.5 |
התפרסם באישור כתב העת של האגודה האמריקנית לכימיה (DOI: 10.1021/ja401075s).
טבלה 2. יצירות חיץ.
| חיץ | 500 mM NaCl, 10 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0 |
| החיץ DA | 500 mM NaCl, 8 M אוריאה, 10 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0 |
| הצפת B | 500 mM NaCl, 50 מ"מ NaPOi, pH 6.0 |
| DPBS | של Dulbecco PBS, 137.9 mM NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 1.5 מ"מ KH 2 PO 4, 8.1 מ"מ Na 2 HPO 4, pH 7.4 |
התפרסם באישור כתב העת של האגודה האמריקנית לכימיה (DOI: 10.1021/ja401075s).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעבודה זו, שהדגמנו את הסינתזה של חלבון הידרוג'ל intein תיווך מאוד יציב. השימוש בפיצול intein מאפשר הידרוג'ל להיווצר בתנאים בתגובה לערבוב של שני מרכיבי נוזל שלב. באופן ספציפי, פיצול intein קוולנטית מחבר בין שני אבני בניין נוזל שלב באמצעות תגובת טרנס שחבור, מניב יחידת פוליפפטיד המוקף crosslinking יחידות שבתורו עצמי מרכיב לתוך הידרוג'ל. היווצרות מושרה הערבוב של הידרוג'ל עוקפת קשיים טכניים בסינתזה של חלבון הידרוג יחיד מרכיב שבו סתימה בתיווך ג'ל עמודות טיהור chromatographic יכולה להתרחש. יתר על כן, צורות הידרוג'ל בתנאים פיסיולוגיים, ללא צורך בשום מעוררים כימיים זרים ו / או מפעילה גופנית.
הידרוג'ל בתיווך intein שומר יציבות גבוהה במאגרים שני חומציים ובסיסיים, ובטמפרטורה פיזיולוגית. הידרוג יכול להיווצר wiה כהידרוג תשואת ריכוזי חלבון קטנים כמו 0.8 מ"מ של כל אבן בניין בודדת (מידע לא מוצג), אך גבוהים יותר (~ 1.6 מ"מ) עם יציבות מכאנית טובה יותר. היציבות הגבוהה של הידרוג'ל מיוחס לשימוש ב1) חלבון יציב מאוד trimeric, CutA, כcrosslinker, ו2) intein להצטרף קוולנטית crosslinkers שונה. ניתוח densitometric של ג'ל SDS-PAGE הראה כי ~ 80% מחלבוני הקלט עברו פיצול תגובת טרנס שחבור intein-זרז בהצלחה.
להיווצרות הידרוג'ל, אבני בניין בודד מרוכז ראשון ~ 100 מ"ג / מיליליטר. סוכן צמצום, כגון DTT, צריך להיות נוכח במהלך שלב ריכוז חלבון כדי למנוע היווצרות של קשרי דיסולפיד מולקולאריים. בהעדרו של צמצום סוכן, אבן בניין הידרוג'ל הבודד מרוכזת יכולה לפעמים ליצור חומר דמוי הידרוג'ל. עם זאת, חומר דמוי ג'ל זה מתמוסס במהירות כאשר שקוע במאגר ו / או בנוכחותשל צמצום הסוכן.
כדי להשיג הידרוג'ל עם היציבות מרבית, חשוב על מנת להבטיח כי היחס טוחנת של שני אבני בניין הידרוג'ל הוא 1:1. כל אבן בניין עודפת לא תהיה crosslinked ויכולה להשפיע על התכונות מכאניות של הידרוג'ל. חלבון מרוכז צריך להיות aliquoted ומאוחסן בנפרד כדי למזער להקפיא להפשיר מחזורים חוזרים ונשנים.
אנחנו גם הדגמנו את השימוש בהידרוג'ל החלבון בתיווך intein כbiocatalyst אורגני ממס תואם. באופן ספציפי, הידרוג שילוב האנזים HRP היו שקועים בn-heptane המכיל מצע והמרה מוצלחת של מצע למוצר נצפה. הידרוג'ל החלבון משמש כפיגום יעיל לbiocatalysis בממס אורגני הנראה בשל ההגנה מפני denaturation אורגני בתיווך ממס המוצע על ידי סביבת התייבשות מאוד של הידרוג'ל.
אחת המגבלות של ההוא טכנולוגית קיבוע אנזים היא הצורך למזג את חלבון מטרה עם פפטיד עגינה (DP). שינוי זה עשוי להשפיע על הפעילות ומסיסות של כמה חלבון מטרה ולכן דורש אופטימיזציה מקרה לפי מקרה של מבני החלבון מתויגים-DP. בנוסף, כמות קטנה של חלבונים מתויגים דלפה אל מחוץ לפפטיד תחנת עגינה (DSP) המכיל הידרוג'ל אחרי השבוע 1. היציבות של החלבון המשותק מושפעת מהזיקה של זוג DSP / העקורים. כדי להשיג יעילות חוסר תנועה טובה יותר, זוג DSP / DP זיקה גבוה יותר יהיה צורך. לבסוף, נכס זה מוצגי הידרוג'ל חלש יחסית מכאני בשל מודול אחסון רמה הנמוך (100-200 kPa) 9. מודול אחסון המישור מושפע מהמבנים של שני crosslinker ואמצע גוש הבניינים 19. בהידרוג'ל הנוכחי, חלבון trimer שימש כcrosslinker. שימוש חלבון crosslinker של עם מדינת Multimeric גבוהה עלול להגביר את רמת הידרוג'ל stמודולוס orage והרכוש המכני שלה.
לסיכום, אנו מדווחים על הסינתזה ואפיון של הידרוג'ל חלבון חדש שעל תנאי מהווה על הערבוב של שני אבני בניין של חלבון נוזל שלב, ובכל אחד מחצית מפיצול intein. הידרוג חלבון intein תיווך מייצג חומר חדש ומבטיח עם פוטנציאל יישומים בתגובות אנזימטיות סינתטיות, סינתזה אורגנית, משלוח סמים בהזרקה, והנדסת רקמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין אינטרסים כלכליים מתחרים קיימים.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות ד"ר דוד Tirrell (קלטק) למתנה מסוגו של פלסמיד pQE9 AC 10 12 Atrp, ד"ר טום מויר (אוניברסיטת פרינסטון) למתנה מסוגו של פלסמיד 11 KanR-IntRBS-NpuNC-CFN, ד"ר Takehisa מאטסודה (קאנאזאווה מכון טכנולוגי, האקאסאן, אישיקאווה, יפן) למתנה מסוגו של פלסמיד pET30-CutA-Tip1 10, וד"ר ג'יי ד Keasling (UC ברקלי) למתנה מסוגו של פלסמיד 13 pJD757 . עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי הקרן הלאומית למדע הקריירה, חיל האוויר האמריקאי ייפ ונורמן הקמן מתקדם תכנית המחקר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase |
New England BioLabs | M0530S |
|
| Competent Escherichia coli BL21 (DE3) |
New England BioLabs | C2527I |
|
| Luria Bertani |
VWR | 90003-350 |
|
| Bacto Agar Media |
VWR | ||
Kanamycin sulfate |
VWR | ||
| IPTG |
VWR | EM-5820 |
|
| Imidazole |
VWR | EM-5720 |
|
| Urea |
VWR | EM-9510 |
|
| Dithiothreitol (DTT) |
Fisher | BP172-5 |
|
| Protease Inhibitor cocktail |
Roche Applied Science | 11836153001 |
|
| DPBS |
VWR | 82020-066 |
|
| Brilliant Blue R |
Acros Organics | A0297990 |
|
| Sodium Azide |
Fisher | AC190380050 |
Caution, highly toxic |
| Horseradish peroxidase |
Sigma | P8125-5KU |
|
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine |
Fisher | AC408460250 |
Caution, highly toxic |
| phenol |
Fisher | AC149340500 |
Caution, highly toxic |
tert-butyl hydroperoxide |
Fisher | AC180340050 |
Caution, highly toxic |
| n-heptane |
Acros Organics | 120340010 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shaker/Incubator |
Fisher Scientific | Max Q 6000 |
|
| Centrifuge |
Sorvall | RC 6 |
|
| Sonicator |
QSonica | Misonix 200 |
|
| Ultrafiltration Tubes |
Amicon Ultra | UFC903024 |
|
| Ni Sepharose High Performance HisTrap column |
GE Healthcare Life Sciences | 17-5248-01 |
|
| HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column |
GE Healthcare Life Sciences | 17-5156-01 |
|
| Plate reader |
Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM |
References
- Banta, S., Wheeldon, I. R., Blenner, M. Protein Engineering in the Development of Functional Hydrogels. Ann. Rev. Biomed. Eng. 12, 167-186 (2010).
- Iwai, H., Zuger, S., Jin, J., Tam, P. H. Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostoc punctiforme. FEBS Lett. 580, 1853-1858 (2006).
- Zettler, J., Schutz, V., Mootz, H. D. The naturally split Npu DnaE intein exhibits an extraordinarily high rate in the protein trans-splicing reaction. FEBS Lett. 583, 909-914 (2009).
- Tanaka, Y., et al. Structural implications for heavy metal-induced reversible assembly and aggregation of a protein: the case of Pyrococcus horikoshii CutA. FEBS Lett. 556, 167-174 (2004).
- Sawano, M., et al. Thermodynamic basis for the stabilities of three CutA1s from Pyrococcus horikoshii,Thermus thermophilus, and Oryza sativa, with unusually high denaturation temperatures. Biochemistry. 47, 721-730 (2008).
- Tanaka, T., et al. Hyper-thermostability of CutA1 protein, with a denaturation temperature of nearly 150 degrees C. FEBS Lett. 580, 4224-4230 (2006).
- Shen, W., Zhang, K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Tuning the erosion rate of artificial protein hydrogels through control of network topology. Nat. Mater. 5, 153-158 (2006).
- McGrath, K. P., Fournier, M. J., Mason, T. L., Tirrell, D. A. Genetically directed syntheses of new polymeric materials. Expression of artificial genes encoding proteins with repeating -(AlaGly)3ProGluGly- elements. J. Am. Chem. Soc. 114, 727-733 (1992).
- Ramirez, M., Guan, D., Ugaz, V., Chen, Z. Intein-triggered artificial protein hydrogels that support the immobilization of bioactive proteins. J. Am. Chem. Soc. 135, 5290-5293 (2013).
- Ito, F., et al. Reversible hydrogel formation driven by protein-peptide-specific interaction and chondrocyte entrapment. Biomaterials. 31, 58-66 (2010).
- Lockless, S. W., Muir, T. W. Traceless protein splicing utilizing evolved split inteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10999-11004 (2009).
- Shen, W., Lammertink, R. G. H., Sakata, J. K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Assembly of an artificial protein hydrogel through leucine zipper aggregation and disulfide bond formation. Macromolecules. 38, 3909-3916 (2005).
- Dueber, J. E., et al. Synthetic protein scaffolds provide modular control over metabolic flux. Nat. Biotechnol. 27, (2009).
- Bruns, N., Tiller, J. C. Amphiphilic network as nanoreactor for enzymes in organic solvents. Nano Lett. 5, 45-48 (2005).
- Das, D., et al. Water gelation of an amino acid-based amphiphile. Chem. Eur. J. 12, 5068-5074 (2006).
- Cao, Y., Li, H. Engineering tandem modular protein based reversible hydrogels. Chem. Commun. , 4144-4146 (2008).
- Wu, X., et al. Structural basis for the specific interaction of lysine-containing proline-rich peptides with the N-terminal SH3 domain of c-Crk. Structure. 3, 215-226 (1995).
- Nguyen, J. T., Turck, C. W., Cohen, F. E., Zuckermann, R. N., Lim, W. A. Exploiting the basis of proline recognition by SH3 and WW domains: Design of n-substituted inhibitors. Science. 282, 2088-2092 (1998).
- Olsen, B. D., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Yielding Behavior in Injectable Hydrogels from Telechelic Proteins. Macromolecules. 43, 9094-9099 (2010).
