Summary
우리는 분할 테인 - 매개 단백질 겔의 합성을 제시한다. 이러한 하이드로 겔의 빌딩 블록은 각각 분할 테인의 가교제 및 반 역할 삼량 단백질의 서브 유닛을 포함하는 단백질이 공중 합체이다. 두 단백질 공중 합체의 혼합은 하이드로 겔로 자기 조립 폴리펩티드 단위를 산출 테인 트랜스 - 스 플라이 싱 반응을 트리거합니다. 하이드로 겔은 높은 산도와 온도 안정, 유기 솔벤트와 함께, 쉽게 기능을 구형 단백질을 포함하고 있습니다.
Abstract
우리는 분할 테인-촉매 단백질 트랜스 - 스 플라이 싱 반응에 의해 매개되는 매우 안정한 단백질 겔의 합성을 제시한다. 이러한 하이드로 겔의 빌딩 블록은 각각 분할 테인의 가교제 및 반 역할 삼량 단백질의 서브 유닛을 포함하는 단백질이 블록 공중 합체이다. 친수성이 높은 임의의 코일은 물 보존을위한 블록 공중 합체 중 하나에 삽입된다. 두 단백질의 블록 공중 합체의 혼합은 한쪽 끝에서 가교제와 폴리 펩타이드 단위를 산출 테인 트랜스 - 스 플라이 싱 반응을 유발하는 하이드로 겔에 신속하게 자기 조립. 하이드로 겔은 50 ° C까지, 및 유기 용매에 온도에서 모두 산성과 염기성 조건에서 매우 안정적입니다. 전단에 의한 파열 후 하이드로 겔은 빠른 속도로 개혁. 하이드로 겔 빌딩 블록에 "도킹 스테이션 펩티드"의 설립은 "도킹 단백질"- 태그 표적 단백질을 편리하게 결합 할 수 있습니다.히드로 겔은 조직 배양 성장 배지와 호환되는 20 kDa의 분자 확산을 지원하고, 생리 활성 단백질의 구형 고정화를 가능하게한다. 유기 용제 대응의 생체 촉매로서 테인 - 매개 단백질 겔의 적용은 고추 냉이 퍼 옥시 다제 효소를 캡슐화하고 그 활성을 확증에 의해 입증되었다.
Introduction
단백질 완전히 만든 하이드로 겔은 크게 조직 공학, 약물 전달 및 biofabrication 1 등 다양한 분야를 발전 할 수있는 잠재력을 가지고 다니십시오. 그들은 생체 적합성 및 비 침습적 생체 활성 구형 단백질의 결합을 지원하는 가능성을 포함하여 기존의 합성 고분자 하이드로 젤에 이점을 제공합니다.
이 작품에서 우리는 단백질 고정화 발판으로 분할 테인 매개 단백질 트랜스 - 스 플라이 싱 반응과 그 응용 (그림 1)를 통해 형성되는 새로운 단백질 하이드로 겔의 개발을 설명합니다. 이러한 하이드로 겔을위한 빌딩 블록은 각각 (IN 및 IC)를 테인 분할 및 가교제 다중 체 단백질의 서브 유닛의 N-또는 C-말단 단편을 포함 두 단백질 블록 공중 합체이다. 테인 Nostoc의 punctiforme (NPU)에서 DnaE 2,3 테인 분할 및 작은 삼량 단백질 피로 코커스 (12 kDa의) CUTA 리코 쉬이 <로 사용되었다/ EM은> 가교제 단백질 4,5로서 사용 하였다. 다른 가교 결합제는 고도로 가교 결합 된 단백질 네트워크 (하이드로 겔)의 형성으로 이어지는 테인 촉매 된 트랜스 - 스 플라이 싱 반응을 통해 결합된다. NPU의 테인이 때문에 빠른 반응 속도 (t 1 / 2 = 63 초)과 높은 트랜스 - 스 플라이 싱 수익률 (에 가까운 80 %), 3의 선택되었다. CUTA 단백질은 높은 안정성으로 인해 가교제로 선정되었습니다. CUTA 트리머 근처 150 ° C의 변성 온도를 가지고 많은 M 5로 구아니딘 염산염 4,6를 포함하는 솔루션 삼량 차 구조를 유지합니다. 다른 가교제 사이의 서브 유닛 교환이 물리적 하이드로 겔 표면 침식 7의 주요 원인이기 때문에, CUTA에서 매우 강한 서브 유닛 간 상호 작용은보다 안정적인 하이드로 겔로 이어지는, 그런 서브 유닛 교환을 억제해야한다. 이러한 빌딩 블록 중 하나는 물을 용이하게하기 위해 중간 블록으로 친수성이 높은 펩티드 S-단편을 포함보존 8.
하이드로 겔이 빌딩 블록의 혼합 양 말단에 가교제와 더 긴 폴리펩티드 사슬을 생성 단편 테인 IN과 IC 사이의 트랜스 - 스 플라이 싱 반응을 개시한다. 여러 그러한 분자 단위에서 가교제는 고도로 가교 하이드로 겔 네트워크 (도 1a)을 형성하는, 서로 상호 작용. 구체적인 "도킹 스테이션 펩티드"(DSP)는 "도킹 단백질"(DP) - 태그 된 하이드로 겔로 표적 단백질을 안정적으로 고정화를 용이하게 하이드로 겔 빌딩 블록 중 하나에 포함된다. 하이드로 겔 어셈블리를 중재하는 테인 분할의 사용은 표적 단백질이 종래의 하이드로 겔 형성에 로딩 될 때, 단백질의 겔 합성에 추가적인 유연성을 제공하지만, 또한 전체 하이드로 걸쳐 표적 단백질의 고밀도, 균일 한 하중을 가능 아닙니다.
테인 매개 단백질 하이드로 겔이 높은 역입니다과 수용액에 적합한 용 작은 - 투 - 더 실온에서 3 개월 만에 검출 침식. 안정성은 pH 값 (6-10)과 온도 (4-50 ℃)의 넓은 범위에서 유지하고, 하이드로 겔은 유기 용매와 호환된다. 녹색 형광 단백질 (GFP)와 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)이 하이드로 겔은 두 개의 공 모양 단백질의 고정화에 사용됩니다. 후자 단백질을 포획 하이드로 겔은, 유기 용매 중에서 생물 촉매를 수행하는데 사용된다.
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Protocol
1. 플라스미드 건설
참고 : 모든 유전자가 제조업체의 사양에 따라 Phusion 하이 피델리티 DNA 중합 효소를 사용하여 표준 PCR 반응에서 증폭되었다. 클로닝을 위해 사용 된 프라이머는 앞서 설명되었다 (9). 모든 구조는 표 1에 나타내었다.
- CUTA-NpuN (N, 표 1)를 생성하려면 :
- PCR은 적절한 프라이머를 사용하여, 각각 플라스미드 pET30-CUTA-TIP1 10 KanR-IntRBS-NpuNC CFN-11에서와 CUTA NpuN 유전자를 증폭한다.
- 적절한 제한 효소로이 조각을 소화하고 순차적으로 T7 프로모터와 N (그림 2A)를 생성 할 수있는 C-말단 6xHistidine 태그 사이의 pET26b 벡터에이 조각을 삽입합니다.
- NpuC-S-CUTA (C, 표 1)를 생성하려면 :
- PCR 증폭 NpuC, CUTA 및 S fragmen적절한 프라이머를 사용하여 플라스미드 KanR-IntRBS-NpuNC - CFN 11 pET30-CUTA-TIP1 10 pQE9 AC 10 각각 ATRP 12 일부터 T [AG 3 (PEG)] 10.
- 적절한 제한 효소로이 조각을 소화하고 순차적으로 T7 프로모터와 C (그림 2B)를 생성 할 수있는 C-말단 6xHistidine의 pET26b 벡터에이 조각을 삽입합니다.
- : NpuC-S-SH3 LIG-CUTA (C-SH3 LIG 손해, 표 1)를 생성하려면
- PCR 증폭 CUTA SH3 LIG 손해 (PPPALPPKRRR) 및 조각 SH3 LIG-CUTA을 생성하는 유연한 링커 (GGGGS) 2를 포함하는 프라이머를 사용하여.
- 조각 SH3 LIG-CUTA와 C에서 CUTA 유전자를 교체합니다.
- SH3-GFP (표 1)를 생성하려면 :
- 사용하여 플라스미드 pJD757 13에서 SH3 유전자를 증폭적합한 프라이머.
- GFP 유전자에이 조각을 융합하고 T7 프로모터 (그림 2C)과 C-말단 6xHistidine 태그 사이의 pET26b 벡터에 삽입합니다.
2. 단백질 발현
- 적절한 발현 플라스미드와 화학적 유능한 대장균 BL21 (DE3)의 50 μL를 변형.
- 변환 후, 순차적으로 이들 세포를 희석하고, 루리아 - 베르 타니 (LB)에 그들을 접시 / 50 ㎍ / ㎖의 카나마이신을 포함하는 한천 플레이트.
- ~ 15 시간 동안 37 ° C에서 형질 전환 된 세포를 포함하는 번호판을 품어.
- 배양 후, 50 ~ 100 식민지를 포함하는 판을 선택하고 LB의 국물 5 ㎖의 모든 식민지를 재현 탁.
- 전송 1 L LB의 국물 포함 카나마이신 (50 ㎍ / ㎖)에 서스펜션과 250 rpm에서 진탕 37 ° C에서 세포를 성장. 600 nm의 (OD 600)에서 흡광도를 모니터링합니다. OD 600 ~ 0.8까지의 문화를 성장.
- C 및 C-SH3 LIG 손해 보험의 경우, 문화 (1 mM의 최종 농도)에 이소 프로필 β-D-1-티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하고 250 rpm에서 진탕하면서 4 시간 동안 37 ° C에서 문화를 품어.
- N 및 SH3-GFP를 들어, 문화를 냉각 ~ ~ 5 분 동안 얼음 수조에서 배양 플라스크를 침지하여 18 ° C에서. 문화 (1mM의 최종 농도)에 IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도하고 250 rpm에서 진탕하면서 14 ~ 18 시간 동안 18 ° C에서 문화를 배양한다.
- 단백질 발현 후, 펠렛을 수집하기 위해 4 ° C에서 20 분 동안 6,000 XG에 문화를 원심 분리기. -80 ° C까지 사용에 보관 세포 펠렛.
3. 단백질 정제
- N의 정제 (변성 조건)
- 10 젖은 펠렛 ㎖ / g에서 버퍼 A (표 2)에 재현 탁 세포 펠렛.
- Immers빙수 욕에서 펠릿 서스펜션 및 전자 (1 초 펄스 및 1 분 10 초의 일시 정지와 앰프 10) 초음파 처리에 의해 세포를 방해.
- 4 ℃에서 20 분 동안 16,000 XG에서 해물을 원심 분리기
- 상층 액을 버린다. (8 M 요소를 포함하는) 버퍼 DA의 펠렛을 재현 탁하고 4 ℃에서 20 분 동안 16,000 XG에서 현탁액을 원심 분리
- 이전에 버퍼 DA와 평형을 5 ㎖ 니켈 니트릴 로트리 아세트산 (NTA) 칼럼을 통해 뜨는을 전달합니다.
- 45 mM의 이미 다졸 보충 버퍼 DA 30 ㎖로 컬럼을 씻으십시오. 150 mM의 이미 다졸과 보충 버퍼 DA 20 ㎖를 사용하여 정제 된 단백질을 용출.
- 3.1.7.1 또는 3.1.7.2에 주어진 다음 방법 중 하나가 <1 mm로 단백질 샘플의 요소 농도를 감소 :
- <20 kDa의 차단과 함께 튜브를 사용하여 4 ° C에서 하룻밤에 DPBS 버퍼 (표 2)에서 단백질을 Dialyze.
- 원심 분리기는 30 & # 단백질을 정제160, 2,800 XG에 kDa의 초 여과 스핀 열, 4 ° C 볼륨까지보다 1 ㎖이다. 단백질 시료를 희석하기 위해 열을 14 ML의 DPBS 버퍼를 추가합니다. 원심 분리 / 희석 세 번 단계를 반복합니다.
- 버퍼 교환 한 후, 정제 된 단백질 (최종 2 ㎜)에 디티 오 트레이 톨 (DTT)를 추가하고 2,800 XG에 30 kDa의 초 여과 스핀 열, 4 ° C.를 원심 분리하여 ~ 100 ㎎ / ㎖로 단백질을 집중
- 사용할 때까지 -80 ° C에서 농축 된 단백질과 상점을 나누어지는.
- C 및 C-SH3 LIG의 정화 (기본 조건)
- 버퍼 B (10) 습식 펠렛 ㎖ / g에서 1X 프로테아제 억제제 칵테일 보충 (산도 6.0) (표 2)에 재현 탁 세포 펠렛. 표적 단백질의 단백질 가수 분해를 최소화하기 위해 산성 완충액을 사용한다.
- 3.1.2에 설명 된대로 초음파 처리하여 세포 현탁액을 방해. 리스를 원심 분리기4 ° C에서 20 분 동안 16,000 XG에서 먹고 뜨는을 유지합니다.
- 이전에 버퍼 B.와 평형을 5 ㎖의 니켈 - NTA 칼럼을 통해 가용성 해물 합격
- 버퍼 B와 세척 컬럼 45 mM의 이미 다졸로 보충하고, 150 mM의 이미 다졸 완충액 B로 보충 된 20 ml의 표적 단백질을 용출.
- C의 경우, 3.2.6 단계로 이동합니다. C-SH3의 LIG 들어 단계에 따른다 부분적 분해 단백질을 제거하기 위해 추가로 이온 교환 정제 단계 3.2.5.3에 3.2.5.1을 수행
- 3.1.7에 설명 된 절차에 따라 <1 mm로 C-SH3 LIG 손해에 염화나트륨의 농도를 줄일 수 있습니다.
- 이전 인산 나트륨 완충액 (50 mM의, 산도 7.0)으로 평형을 5 ㎖의 이온 교환 구슬로 장식 된 아가 로스 매트릭스 칼럼에 목적 단백질을로드합니다.
- 10 mM 트리스 - 염산 pH를 8.0 buffe 함유 용액으로부터 구배를 실행하여 칼럼으로부터 용출 표적 단백질1 M NaCl로 보충 된 동일한 완충액을 함유하는 용액에 R. 도데 실 황산나트륨 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 기초하여 높은 순도의 단백질 용출 및 풀 샘플 중에 샘플을 채취.
- 3.1.7에 설명 된대로, DPBS 버퍼로 정제 된 단백질을 교환 버퍼입니다.
- 정제 된 단백질 (최종 농도 2 ㎜)에 DTT를 추가하고 3.1.8에 설명 된대로 ~ 100 ㎎ / ㎖ 30 kDa의 초 여과 스핀 컬럼을 사용하여 단백질을 집중한다. 나누어지는 및 저장은 -80 ° C까지 사용에서 단백질을 집중했다.
- SH3-GFP의 정화
- 10 젖은 펠렛 ㎖ / g에서 버퍼를 사용을 Resuspend 세포 펠렛.
- 3.1.2에 설명 된 초음파에 의해 펠릿 현탁액을 방해.
- 4 ° C에서 20 분 동안 16,000 XG에서 해물을 원심 분리기 및 뜨는을 수집합니다.
- 이전에 평형을 5 ㎖의 니켈 - NTA 칼럼을 통해 상층 액 (수용성 해물을) 통과버퍼 A.
- 버퍼 30 ㎖로 컬럼을 씻어 45 mM의 이미 다졸 보충. 버퍼 20 ㎖의 150 mM의 이미 다졸을 사용하여 보충 된 정제 된 단백질을 용출.
- 버퍼 3.1.7에 기술 된 것과 유사한 방법을 사용 DPBS 완충액에 정제 된 단백질을 교환하고 단백질을 농축 ~ 150 ㎎ / 3.1.8에서 설명한 바와 같이 30 kDa의 울트라 여과 스핀 컬럼을 사용하여 ML.
- 나누어지는 및 저장은 -80 ° C까지 사용에서 단백질을 정제.
- CUTA을 함유하는 정제 된 샘플의 SDS-PAGE 분석
- 염화나트륨 ~ 1 mm까지의 농도를 줄이기 위해 두 번 증류수에 각각의 정제 된 단백질을 희석. 이 염화나트륨 농도에서 CUTA 량체 단백질의 대부분은 SDS-PAGE 겔에 단량체로서 실행.
- 2X SDS 샘플 버퍼 (0.5 M 트리스 - 염산, 산도 6.8, 글리세롤, 10 % w SDS V / 0.1 % V의 브로 모 페놀 블루, 2 %의 β-머 캅토 에탄올 승 / 20 %), 95 ° C에서 배양과 샘플을 혼합 5 분.
- 샘에게로드PLES 12 % SDS-PAGE 젤 상. 50 분 ~ 200 V의 일정한 전압에서 전기 영동을 수행하십시오.
- 표준 프로토콜 (그림 1C) 다음 쿠마 화려한 푸른 R250로 염색하여 젤의 단백질을 관찰한다.
4. 하이드로 겔 형성
참고 : 별도로 언급하지 않는 한이 연구에서 만든 샘플 하이드로 겔 각 하이드로 겔 빌딩 블록 1.6 밀리미터가 포함되어 있습니다. 이 단백질의 농도는 부드럽고 안정된 겔을 얻을 수 있습니다. 주의 : 아 지드 화 나트륨 (NaN이 3) 박테리아 오염을 방지하기 위해 V / w 0.5 %의 최종 농도로 하이드로 겔에 첨가된다. NaN의 3은 매우 독성 및 물질 안전 보건 자료 (MSDS)에 표시된 극단주의하여 취급해야합니다.
- 100 μL 샘플 하이드로 겔에서 1.6 ㎜의 최종 농도를 달성하기 위해 필요한 농축 단백질의 각각의 볼륨을 산출한다. 예를 들면 :
N의 농도 :100 ㎎ / ㎖
N의 분자량 26.3 kDa의 (표 1 참조)
원하는 양 : 100 ㎕를 원하는 농도 : 1.6 mM의
- 100 ㎕의 히드로 겔 (1.6 mm)를 만들려면 C를 혼합 (X μL, 볼륨 4.1에 따라 계산) 5 % NaN의 3 (10 μL)로, 100 mM의 DTT (5 μL)와 N (Y μL, 양에 따라 계산 4.1) 2 ㎖ 유리 병 내부.
- 100 μL의 최종 볼륨을 달성하기 위해 유리 병에 (Y) μL - X - (85), 수동 피펫 팁을 사용하여 소용돌이 치는 움직임을 통해 모든 구성 요소를 혼합 DPBS 버퍼를 추가합니다. 참고 :이 솔루션은 혼합시 점성이됩니다.
- 기포를 제거하기 위해 8,000 XG에서 2 분 동안 상기 혼합물을 원심 분리기.
- 방에서 혼합물을 품어테인 트랜스 - 스 플라이 싱 반응이 완성에 도달 할 수 있도록 밤새 온도. 거꾸로 튜브를 돌려 하이드로 겔 형성을 확인합니다. 하이드로 겔이 형성되는 경우에 단백질은 흐르지 않는다.
- 3.4 (그림 1C)에 설명 된대로, 4.2 단계 전에 SDS-PAGE 젤에 4.5 단계 이후에 수집 된 시료 (0.5 ㎕의 각)을 확인하여 테인 트랜스 - 스 플라이 싱의 수익률을 예상하고있다.
5. 도킹 단백질 (DP)와 도킹 스테이션을 통한 GFP의 고정 펩타이드 (DSP)의 상호 작용
- 50 μL의 GFP 기능화 된 하이드로 겔 (1.2 mm)를 만들기 위해 1.7 1:1 몰비 (4.1에 따라 계산, X μL) C-SH3 LIG 손해를 결합 SH3-GFP (Y μL, 4.1에 따라 계산) 밀리리터 microcentrifuge 관 및 실온에서 30 분 동안 혼합물을 배양한다.
- X - - <5 % NaN의 3 (5 μL), 100 mM의 DTT (2.5 μL), (42.5 추가같은 관에 EM> Y) μL의 DPBS. N 및 C-SH3 LIG의 1:1 몰비를 달성하기 위해 N (Y μL, 4.1에 따라 계산)을 추가한다. 소용돌이 운동에 의해 피펫 팁을 사용하여 샘플을 섞는다.
- 2 분 동안 8,000 XG에서 상기 혼합물을 원심 분리에 어두운 혼합물을 실온에서 밤새 배양한다. 배양 중에 SH3-GFP 양식을 캡슐화하는 하이드로 겔.
6. 유기 용매에서 효소 반응에 대한 고정화 발판 1.6 mM의 히드로 겔의 사용
- 모델 효소로 HRP를 사용합니다. DPBS에 HRP (28 ㎎ / ㎖ 또는 0.63 ㎜)의 주식 솔루션을 준비합니다.
- HRP 포획 30 ㎕의 히드로 겔 (1.6 mm)를 만들려면 C 내부 HRP (2 μL), 5 % NaN의 3 (3 μL) 및 DTT (100 mm의 1.5 μL)과 (X μL, 4.1에 따라 계산) 겸용 1.7 ML의 원심 분리기 튜브.
- N (Y 추가 </ EM> 4.1에 따라 계산 μL) 및 DPBS (23.5 - X - Y) μL. 소용돌이 모션 피펫 팁과 섞는다.
- 2 분 동안 8,000 XG에서 혼합물을 원심 분리하고, 실온에서 밤새 배양한다.
주의 : 다음 활동 분석에 사용되는 섭정은 매우 독성이 있습니다. 해당 물질 안전 보건 자료 (MSDS)에 의해 특정 안전 권고를 사용합니다. - 효소 반응을 위해, n-헵탄 (14)의 N, N-디메틸-p-페닐 렌 디아민 (5.8 ㎜), 페놀 (5.8 ㎜) 및 tert-부틸 하이드 로퍼 옥사이드 (2.9 mm)를 함유하는 반응 칵테일 1 ㎖의 하이드로 겔을 물속. 수동 하이드로 겔과 용매의 접촉 면적을 증가시키기 위해 피펫 팁을 사용하여 겔을 방해.
- 플레이트 리더 (그림 5)에서 546 nm에서 다른 시간에 촬영 한 샘플의 흡광도를 측정하여, HRP 제품, 인도 페놀 형 염료를 감지합니다. </ OL>
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Representative Results
테인 매개 단백질 하이드로 겔 형성을위한 회로도는 그림 1A에 제시되어있다. 하이드로 겔의 빌딩 블록은 단백질 CUTA NpuN-(N) 및-S-NpuC CUTA (C) (도 1a, 표 1)를 공중합. NpuN / C는 Nostoc의 punctiforme (NPU)에서 테인 자연스럽게 분할 DnaE의 N-/C-fragments 있습니다. CUTA는 피로 코커스 호 리코 쉬이 4,5에서 안정적인 삼량 단백질이다. (도 1A 및 1C) : 라이 게이션 생성물 (CUTA-S-CUTA J) - 환원제 DTT의 존재하에 정제 된 N 및 C의 혼합은 제 단백질의 형성을 유도한다. 개별적으로, 하이드로 겔 빌딩 블록 N 및 C는 점성 유체 (도 1b)에 존재한다. N 및 C의 혼합은 하이드로 겔 (15, 16) (도 1b)의 형성을 나타내는 반전 후에 유리 병의 바닥에 유지되어 투명한 반고체 물질을 수득 한8,19.
본 테인 - 매개 단백질 하이드로 겔 (1.6 mM)을 높은 용액 안정성을 나타낸다. 거의 또는 전혀 DPBS 버퍼에 22 ° C의 21 일 후에 가교 하이드로 겔 발판의 손실이, DPBS 버퍼에 출시 된 단백질의 총량은 약간 100 가정 접합 테인 하이드로 겔에서의 이론적 인 양 (초과로 % 테인 트랜스 - 스 플라이 싱의 효율) (그림 3A). 농도계는 하이드로 겔을 형성하는 동안, 트랜스 - 스 플라이 싱 반응 (그림 1C) ~ 80 % 효율적이었다 것으로 나타났다. SDS-PAGE 젤 분석은 최소한이 침식에 가교 하이드로 겔 지지체의 손실을 확인, 트랜스 - 스 플라이 싱 제품의 양의 하이드로 겔의 주변 버퍼 (그림 3B, 밴드 J)의 존재를 추적하는 것으로 나타났다. 하이드로 겔의 주변 버퍼의 주요 단백질의 존재는 테인 잘려 나간다. 침식의 눈에 띄는 징후는 관찰되지 않았다3 개월 이상 (그림 3A 입구) 실온에서 수용액에 잠긴 그대로 하이드로 겔. 하이드로 젤은 37 ° C (그림 3C)에서 모두 산성과 기본 버퍼 (그림 3D)도 매우 안정적이다.
단백질 고정화를 용이하게하기 위해, 단백질 쌍과 펩티드 리간드는 하이드로 겔 지지체에 관심 단백질을 고정하기 위해 사용되었다. 우리는 SH3 단백질, 어댑터 단백질 CRK에서 Src에 상동 3 도메인, 설립을위한 도킹 스테이션 펩타이드 (DSP)와 같은 관심의 단백질과 리간드 (SH3 LIG 손해)에 융합 도킹 단백질 (DP) 등으로 선택했다 하이드로 겔의 골격. 이러한 상호 작용 쌍 때문에 상대적으로 작은 분자 크기 (SH3 56 AA와 SH3 LIG 손해 11 AA)과 높은 친화력 (K의 D = 0.1 μM) (17, 18)으로 선택되었다. SH3 LIG 손해는 C-SH3 LIG 손해를 형성하기 위해 NpuC 및 CUTA 사이에 삽입 된(표 1). SH3 단백질 SH3-GFP를 형성하는 모델 타겟 구형 단백질, 녹색 형광 단백질 (GFP)의 N-말단에 융합시켰다. 프로토콜 (제 5,도 4a)에 설명 된 프로세스는 1.2 ㎜ 트랜스 - 스 플라이 싱 된 하이드로 겔 골격 빌딩 블록 및 1.2 ㎜ GFP를 함유하는 하이드로 겔을 수득 하였다. GFP 함유 하이드로 겔 DPBS 버퍼 21 일 후에 35 %의 총 단백질 손실 ~와 GFP (그림 4B)을 부족한 하이드로 겔과 비슷한 안정성을 보였다. 침식 버퍼에 존재하는 단백질의 대부분은 쪼개진 inteins되었습니다. SH3 LIG 손해를 포함하는 하이드로 겔에서 SH3-GFP의 침출 율은 30 % 3 주 후 ~ (시간, 그림 4C의 같은 기간에> 70 %의 단백질 손실) SH3 LIG 손해 부족 하이드로 겔에서보다 훨씬 작습니다. 하이드로 겔의 고정 SH3-GFP가 자외선 아래에서 빛을 낸다. 도 4d, 도킹 스테이션 pepti 함유 하이드로 겔에서 볼 수 있듯이SH3 LIG 손해 부족한 하이드로 겔은 기본적으로 비 형광됩니다 동안 드 SH3 LIG 손해 3 주 후에 GFP의 형광의 대부분을 유지합니다. 그것은 높은 친화력 DP / DSP 쌍의 사용은 더욱 고정화 단백질의 침출 속도를 감소시킬 것으로 기대된다.
이 실험에서, GFP가 표적 단백질로서 사용 하였다; 그러나, DP-태그 된 단백질이 편리 하이드로 겔에 고정화 될 수있다. 따라서, 인 테인 - 매개 단백질 히드로 겔은 단백질 고정화 일반적인 발판을 제공한다. 고정 GFP의 밀도는이 작품에서 보여하면 ~ 하이드로 겔의 33 몰 %이다. 다중 DSP는 하이드로 겔 빌딩 블록에 통합 될 때 높은 고정화 밀도를 잠재적으로 달성 할 수있다.
다음으로, HRP의 효소는 유기 용매에 생물 촉매를 지원하는 능력을 입증하기 위해 단백질 하이드로 겔에 혼입 하였다. 효소 활성의 산화 적 커플 링을 모니터링하여 측정했다
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그림 1. 테인 매개 단백질 하이드로 겔. 말단 모두에서 가교제 단백질과 단백질 연장 쇄 (J)의 형성을 트리거 트랜스 - 스 플라이 싱 반응을 테인의 (A) 회로도. 테인 - 매개 단백질 결찰시 체류 J 단백질 비공유 체인 연결하고, 가교제로부터 단백질, 하이드로 겔 특성을 갖는 고도로 가교 된 단백질 네트워크의 형성을 유도한다. NpuN / C : N-/C-fragment 테인. (B)로 정제하여, N 및 C의 혼합 고도로 가교 하이드로 겔 네트워크 (1.6 mM의 J)의 형성에 이르게 (8.3 % V / w). 이전과 혼합 한 후 정제 된 N 및 C 빌딩 블록 (C) SDS-PAGE 분석. "N + C"는 1.6 mM의 히드로 겔에서 직접 촬영 한 샘플에 해당합니다. "*"인 테인 C-말단 절단 SI는 것이며드 반응 생성물. 각 밴드의 강도는 "양 하나"소프트웨어 "추적 모듈을 사용하여 정량 하였다. 밴드의 세기는 몰 당량. 트랜스 - 스 플라이 싱의 효율 (~ 80 %) 동일한 차선 제품 J 및 미 반응 N / C의 양으로부터 계산 하였다를 구하는 단백질 분자량으로 나누어졌다. 미국 화학 학회의 저널의 허가를 받아 재 인쇄했습니다. (간접 : 10.1021/ja401075s) 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 단백질 구조의 플라스미드지도. (A) CUTA-NpuN, (B) NpuC-S-CUTA와 (C) SH3-GFP (<강한> 표 1) T7 프로모터의 제어하에 pET26b 벡터에 클로닝 하였다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 22 ℃에서 1.6 mM의 히드로 겔의 DPBS에서 테인 매개 단백질 하이드로 겔의 안정성. (A) 부식 프로필 점선은 절단 inteins의 이론적 질량을 나타냅니다. 입구는 실온에서 3 개월 DPBS에 방해받지 하이드로 겔을 보여줍니다. 하이드로 겔의 주변 버퍼 (B) SDS-PAGE 분석. 하이드로 겔 (A)에 침지시킨 버퍼의 모든 샘플 (총 7.5 ㎖)을 모으고 10 kD의 통하여 한외 통해 75 배 농축시켰다이전 젤로드에 막 J :. 테인 트랜스 - 스 플라이 싱 제품 N :.. 반응 CUTA-NpuN NpuN : N-테인 조각을 접합. 미 반응 C 및 NpuC을 접합은 각각 소량 때문에 작은 크기 (4 kDa의)에 젤에 표시되지 않습니다. 별표는 알 수없는 대역을 의미한다. 서로 다른 온도에서 배양 하이드로 겔 (C) 부식 프로필. 두 개의 서로 다른 pH 값에서 배양 하이드로 겔의 (D) 부식 프로필. 미국 화학 학회 저널의 허가를 받아 재 인쇄했습니다. (간접 : 10.1021/ja401075s) 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 테인 -매개 하이드로 겔은 기능성 구형 단백질의 고정화를 지원합니다. 모델 구상 단백질로 GFP를 사용하여 단백질의 고정화 (A) 도식. DSP - 함유 하이드로 겔 빌딩 블록은 제 빌딩 블록 상 표적 단백질 로딩 DP - 융합 된 목적 단백질과 혼합된다. 단편 - 함유 하이드로 겔 빌딩 블록 인 테인 상보 고정화 GFP 함께 하이드로 겔을 수득 된 혼합물에 첨가된다. SH3-GFP 1:1 몰비를 포함하는 하이드로 젤의 (B) 총 단백질 침식 프로필. 점선은 밖으로 접합 inteins의 이론적 질량을 나타냅니다. 오차 막대는 두 독립적 인 실험의 표준 편차를 나타낸다. 과 및 DSP없이 하이드로 겔에서 SH3-GFP의 (C) 용출 프로파일. 바로 하이드로 겔 형성 한 후 21 일 이후에 자외선 노출에 따라 하이드로 젤을 포함하는 GFP의 (D) 이미지. 미국 화학 학회 저널의 허가 (간접 재판:. 10.1021/ja401075s) 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 고추 냉이 퍼 옥시 데이즈 (HRP)가 갇힌 테인 트리거 단백질 하이드로 겔은 유기 용매 n-헵탄에 HRP-촉매 반응을 촉진한다. 유기 용매에 HRP에 의해 촉매 (A) 모델 반응. (B) 작은 조각으로 파쇄하고 10 분 ~ 30 분 (왼쪽)와 DPBS 완충액에서 nonimmobilized HRP의 동일한 양 (오른쪽)와 대조 실험을 위해 반응 칵테일 배양 후에 캡슐화 HRP를 함유하는 하이드로 겔의 사진. (C) 제품 형성은 546 nm에서 흡광도에 의해 모니터링 하였다. 아메리의 저널의 허가를 적응화학 학회 있습니다. (간접 : 10.1021/ja401075s)는 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1. 본 연구에서 사용 된 단백질의 구조.
| 짧은 이름 | 단백질 서열 | MW (kDa의) |
| CUTA-NpuN (N) | CUTA-EAC-(GGGGS) 2-AS-NpuN-HHHHHH | 26.3 |
| NpuC-S-CUTA (C) | NpuC-CFNKLYRDPMG - [(AG) 3 PEG] 10 -ARMPYV-C 우타 - HHHHHH | 26.1 |
| NpuC-S-SH3 LIG 손해 - CUTA (C-SH3 LIG 손해) | NpuC-CFNKLYRDPMG - [(AG) 3 PEG] 10 -ARMPYVGS- PPPALPPKRRR - (GGGGS) 2-AS-CUTA-HHHHHH | 28.3 |
| SH3-GFP | SH3-KL-(GGGGS) 2-AS-GFP-HHHHHH | 34.5 |
(: 10.1021/ja401075s 간접) 미국 화학 학회 저널의 허가를 받아 재 인쇄했습니다.
표 2. 버퍼 작곡.
| 버퍼 | 500 밀리미터의 NaCl, 10 MM 트리스 - 염산, pH를 8.0 |
| 버퍼 DA | 500 mM의 NaCl을, 8 M 우레아, 10 MM 트리스 - 염산, pH를 8.0 |
| 버퍼 B | 500 밀리미터의 NaCl, 50 mM의 NaPOi, pH를 6.0 |
| DPBS | 둘 베코의 PBS, 137.9 밀리미터의 NaCl, 2.7 밀리미터의 KCl, 1.5 mM의 KH 2 PO 4, 8.1 밀리미터 나 2 HPO 4, 산도 7.4 |
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Discussion
이 작품에서 우리는 매우 안정적인 테인 매개 단백질 하이드로 겔의 합성을 보여 주었다. 분할의 사용은 테인 조건부이 액상 성분의 혼합에 대응하여 형성되는 히드로 겔을 가능하게한다. 구체적으로는, 분할 테인 공유 차례로 자기 하이드로 겔로 조립하는 것이 단위 가교 어귀 폴리펩티드 유닛을 수득 트랜스 - 스 플라이 싱 반응을 통해이 액상 빌딩 블록을 연결한다. 하이드로 겔의 혼합에 의한 형성은 크로마토 그래피 정제 열 젤 - 매개 막힘이 발생할 수있는 단일 성분의 단백질 하이드로 겔의 합성에 기술적 인 문제를 무시합니다. 또한, 불필요한 화학적 유도제 및 / 또는 물리적 트리거 없이도 생리적 조건 하에서 하이드로 폼.
테인 매개 하이드로 겔은 높은 산성과 염기성, 양쪽 모두의 버퍼의 안정성 및 생리적 온도를 유지합니다. 히드로 겔 무선을 형성 할 수있다더 나은 기계적 안정성 번째는 각각의 빌딩 블록 0.8 MM (데이터가 표시되지 않음) 등의 작은, 그러나 더 높은 단백질 농도 (~ 1.6 ㎜) 수익률 하이드로 겔. 하이드로 겔의 높은 안정성은 가교 결합제로서 (1)의 사용) 매우 안정 삼량 단백질 CUTA에 기인하고, 2) 인 테인 공유 적으로 다른 가교제 가입. SDS-PAGE 겔의 농도계 분석 입력 단백질의 80 %가 성공적으로 분할 테인-촉매 트랜스 - 스 플라이 싱 반응을 시행 ~ 것으로 나타났다.
하이드로 겔 형성을 위해, 개별적인 빌딩 블록이 우선 ~ 100 ㎎ / ㎖로 농축된다. 예컨대 DTT 같은 환원제는 분자간 이황화 결합의 형성을 방지하기 위해 단백질 농축 단계 동안 존재할 필요가있다. 환원제의 부재하에, 농축 개별 하이드로 빌딩 블록은 때때로 하이드로 겔 상물을 형성 할 수있다. 완충액 및 / 또는 존재하에 침지 그러나,이 겔 상물은 빠르게 해소의 환원제.
최대 안정성 하이드로 겔을 얻기 위해서는, 하이드로 겔이 빌딩 블록의 몰비가 1:1되도록하는 것이 중요하다. 어떤 과잉 빌딩 블록은 가교되지 않고 겔의 기계적 특성에 영향을 미칠 수있다. 농축 단백질 분취 반복 동결 - 해동 사이클을 최소화하기 위해 개별적으로 저장 될 필요가있다.
또한, 유기 용제 대응의 생체 촉매로서 테인 - 매개 단백질 하이드로 겔의 사용을 보여 주었다. 구체적으로, HRP는 제품 기판의 기판 성공적인 전환을 포함하는 n-헵탄에 침지 효소를 도입 한 하이드로 겔이 관찰되었다. 단백질 하이드로 겔 인해 하이드로 겔의 높은 수화 환경에 의해 제공되는 유기 용매 매개 변성의 보호 가능성이 유기 용매에있는 생물 촉매에 대한 효과적인 발판 역할을합니다.
번째의 한계 중 하나는효소 고정화 기술은 도킹 펩티드 (DP)와 목적 단백질을 융합하는 필요성이다. 이 수정은 어떤 표적 단백질의 활성 및 용해도에 영향을 미치고, 따라서 DP - 태그 단백질 구조의 사례 별 최적화가 필요할 수 있습니다. 또, 태그 된 단백질의 소량 도킹 스테이션 펩티드 (DSP) 함유 일주 후에 하이드로 겔을 밖으로 침출. 고정화 된 단백질의 안정성은 DSP / DP 쌍의 친화력에 의해 영향을 받는다. 더 고정화 효율을 달성하기 위해 높은 친화력 DSP / DP 쌍은 필요할 것이다. 마지막으로, 낮은 고원의 저장 탄성률 (100 ~ 200 kPa의)에 의한이 하이드로 겔 전시 상대적으로 약한 기계적 성질 9. 고원 저장 탄성률은 가교제 및 중간 블록 (19) 양쪽의 구조에 의해 영향을 받는다. 현재 하이드로 겔에서는 트리머 단백질을 가교제로서 사용 하였다. 높은 다중 체 상태와 가교제 단백질의 사용은 잠재적으로 하이드로 겔 고원 성을 증가시킬 수있다ORAGE 계수 및 기계적 속성입니다.
요약하면, 우리는 조건부이 액상 단백질 빌딩 블록, 인 테인 분할의 절반을 포함하는 각각의 혼합시 형성 새로운 단백질 겔의 합성 및 특성을보고한다. 테인 매개 단백질 하이드로 겔 합성 효소 반응, 유기 합성, 주 사용 약물 전달 및 조직 공학의 잠재적 인 응용 프로그램과 함께 유망한 새로운 소재를 나타냅니다.
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Disclosures
더 경쟁하는 금융 이익은 존재하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 플라스미드 KanR-IntRBS-NpuNC - CFN (11)의 자신의 종류의 선물을 플라스미드의 자신의 유일한 선물 pQE9 AC 10 ATRP 12, 박사 톰 뮤어 (프린스턴 대학) 박사 데이비드 Tirrell (칼텍)을 인정하고 싶습니다 플라스미드의 자신의 유일한 선물 pJD757 13 플라스미드 pET30-CUTA-TIP1 10, 박사 제이 D. Keasling (UC 버클리)의 자신의 종류의 선물 박사 다케 히사 마츠다 (기술, 하쿠산, 이시카와 현, 일본의 가나자와 연구원) . 이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 경력, 미국 공군 YIP 노르만 핫쿠 고급 연구 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase |
New England BioLabs | M0530S |
|
| Competent Escherichia coli BL21 (DE3) |
New England BioLabs | C2527I |
|
| Luria Bertani |
VWR | 90003-350 |
|
| Bacto Agar Media |
VWR | ||
Kanamycin sulfate |
VWR | ||
| IPTG |
VWR | EM-5820 |
|
| Imidazole |
VWR | EM-5720 |
|
| Urea |
VWR | EM-9510 |
|
| Dithiothreitol (DTT) |
Fisher | BP172-5 |
|
| Protease Inhibitor cocktail |
Roche Applied Science | 11836153001 |
|
| DPBS |
VWR | 82020-066 |
|
| Brilliant Blue R |
Acros Organics | A0297990 |
|
| Sodium Azide |
Fisher | AC190380050 |
Caution, highly toxic |
| Horseradish peroxidase |
Sigma | P8125-5KU |
|
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine |
Fisher | AC408460250 |
Caution, highly toxic |
| phenol |
Fisher | AC149340500 |
Caution, highly toxic |
tert-butyl hydroperoxide |
Fisher | AC180340050 |
Caution, highly toxic |
| n-heptane |
Acros Organics | 120340010 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shaker/Incubator |
Fisher Scientific | Max Q 6000 |
|
| Centrifuge |
Sorvall | RC 6 |
|
| Sonicator |
QSonica | Misonix 200 |
|
| Ultrafiltration Tubes |
Amicon Ultra | UFC903024 |
|
| Ni Sepharose High Performance HisTrap column |
GE Healthcare Life Sciences | 17-5248-01 |
|
| HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column |
GE Healthcare Life Sciences | 17-5156-01 |
|
| Plate reader |
Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM |
References
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