Summary
Apresentamos a síntese de um hidrogel mediada-intein desdobramento da proteína. Os blocos de construção da presente hidrogel são dois copolímeros de proteínas, cada uma contendo uma subunidade de uma proteína trimérica, que serve como um agente de ligação cruzada e uma metade de um intein dividida. A mistura dos dois copolímeros de proteínas desencadeia uma reacção de splicing trans intein, obtendo-se uma unidade de poliptido que se auto-monta para um hidrogel. Este hidrogel é altamente pH e temperatura estáveis, compatíveis com solventes orgânicos, e facilmente incorpora proteínas globulares funcionais.
Abstract
Apresentamos a síntese de uma proteína de hidrogel altamente estável mediada por um catalisado-intein dividida proteína reacção de splicing trans. Os blocos de construção da presente hidrogel são dois copolímeros em bloco de proteínas, cada uma contendo uma subunidade de uma proteína trimérica, que serve como um agente de ligação cruzada e uma metade de um intein dividida. Uma bobina aleatório altamente hidrofílico é inserida em um dos copolímeros em bloco de retenção de água. A mistura dos dois copolímeros em bloco a proteína desencadeia uma reacção de splicing trans intein, obtendo-se uma unidade de polipeptídeo com agentes de reticulação em ambas as extremidades que rapidamente auto-monta em um hidrogel. Este hidrogel é muito estável tanto em condições ácidas e básicas, a temperaturas até 50 ° C, e em solventes orgânicos. O hidrogel rapidamente reformas após ruptura induzida por cisalhamento. Incorporação de um "encaixe estação peptídeo" para o bloco de construção de hidrogel permite incorporação conveniente de "proteína de ancoragem", marcado proteínas-alvo.O hidrogel é compatível com o meio de crescimento de cultura de tecidos, suporta a difusão de moléculas de 20 kDa, e permite a imobilização de proteínas globulares bioactivos. A aplicação do hidrogel proteína intein-mediada como um biocatalisador compatível com solvente orgânico foi demonstrada por encapsular a enzima peroxidase de rábano silvestre e corroborar a sua actividade.
Introduction
Os hidrogéis feitos inteiramente de proteínas carregam o potencial para avançar significativamente campos tão diversos como a engenharia de tecidos, distribuição de medicamentos e biofabrication 1. Eles oferecem vantagens sobre os hidrogéis de polímero sintético tradicionais, incluindo biocompatibilidade e o potencial para apoiar de forma não invasiva a incorporação de proteínas globulares bioactivos.
Neste trabalho, nós descrevemos o desenvolvimento de um novo hidrogel de proteína formada por meio de uma resposta mediada intein dividida proteína reacção de splicing trans e sua aplicação como suporte de imobilização de proteína (Figura 1). Os blocos de construção para esta hidrogel são dois copolímeros em bloco de proteína, compreendendo cada fragmento o N-ou C-terminal de uma divisão intein (IN e IC) e uma subunidade de uma proteína multimérica reticulador. O DNAE intein de Nostoc punctiforme (NPU) foi usada como o grupo intein 2,3 e uma pequena proteína trimérica (12 kDa) a partir de CUTA Pyrococcus horikoshii </ Em> foi usado como o agente de ligação cruzada de proteínas a 4,5. Diferentes agentes de reticulação são unidas por meio de reacção de splicing trans intein catalisada, levando à formação de uma rede de proteínas altamente reticulado (hidrogel). NPU intein foi escolhido por causa de sua cinética de reação rápida (t 1/2 = 63 seg) e alto rendimento trans-splicing (perto de 80%) 2,3. A proteína CUTA foi escolhido como o agente de ligação cruzada, devido à sua elevada estabilidade. Trímeros CUTA têm uma temperatura de desnaturação de perto de 150 ° C e manter a estrutura quaternária trimérico em soluções contendo tanto como 5 M de cloridrato de guanidina 4,6. Desde subunidade troca entre os diferentes agentes de reticulação é um dos principais contribuintes da superfície hidrogel físico erosão 7, a interação entre subunidade muito forte em Cuta deve desencorajar tais trocas de subunidades, levando a um hidrogel mais estável. Um desses blocos de construção também contém um peptídeo S-fragmento altamente hidrofílico como o meio-bloco para facilitar a águaretenção 8.
A mistura dos dois blocos de construção de hidrogel inicia uma reacção de splicing trans entre a IN e IC intein fragmentos, gerando uma corrente mais polipeptídeo com agentes de ligação cruzada em ambos os terminais. Reticuladores de várias de tais unidades moleculares interagir uns com os outros, formando uma rede de hidrogel altamente reticulado (Figura 1A). Um específico "encaixe estação péptido" (DSP) é incorporado um dos blocos de construção de hidrogel a fim de facilitar a imobilização estável de uma "proteína de ancoragem" (DP) marcado com proteína alvo no hidrogel. O uso de uma divisão intein para mediar a montagem de hidrogel não só fornece flexibilidade adicional para a síntese de proteína de hidrogel, mas também permite alta densidade, carga uniforme da proteína alvo ao longo de todo o hidrogel, tal como as proteínas alvo são carregados antes da formação do hidrogel.
O hidrogel de proteínas mediada por intein é altamente stable em solução aquosa, com pouco ou nenhuma erosão detectável após 3 meses à temperatura ambiente. A estabilidade é mantida numa vasta gama de valores de pH (6-10) e de temperaturas (4-50 ° C), e o hidrogel é também compatível com solventes orgânicos. Este hidrogel é utilizado para a imobilização das duas proteínas globulares: a proteína fluorescente verde (GFP) e a peroxidase de rábano (HRP). Hidrogel aprisionando a última proteína é usada para executar biocatálise em um solvente orgânico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plasmídeo Construção
NOTA: Todos os genes foram amplificados em reações de PCR padrão usando Phusion High-Fidelity DNA polimerase por especificações do fabricante. Os iniciadores utilizados para a clonagem foram descritas anteriormente 9. Todas as construções estão listadas na Tabela 1.
- Para gerar cuta-NpuN (N, Tabela 1):
- PCR amplificar genes CUTA e NpuN de plasmídeos pET30-cuta-Tip1 10 e KanR-IntRBS-NpuNC CFN-11, respectivamente, utilizando os iniciadores adequados.
- Digerir estes fragmentos com as enzimas de restrição adequadas, e inseri sequencialmente estes fragmentos no vector pET26b entre o promotor T7 e uma marca de 6xHistidine C-terminal para gerar N (Figura 2A).
- Para gerar NpuC-S-cuta (C, Tabela 1):
- PCR amplificar NpuC, Cuta e S fragmentaçãoT [AG 3 (PEG)] 10 a partir do plasmídeo KanR-IntRBS-NpuNC CFN-11, pET30-cuta-Tip1 10 e pQE9 AC 10 PRTA 12, respectivamente, utilizando os iniciadores adequados.
- Digerir estes fragmentos com as enzimas de restrição adequadas, e inseri sequencialmente estes fragmentos no vector pET26b entre o promotor T7 e uma 6xHistidine C-terminal para gerar C (Figura 2B).
- Para gerar NpuC-S-SH3 lig-Cuta (C-SH3 lig, Tabela 1):
- PCR amplificar Cuta usando primers contendo um lig SH3 (PPPALPPKRRR) e um ligante flexível (GGGGS) 2 para gerar fragmento SH3 lig-cuta.
- Substitua o gene Cuta de C com fragmento SH3 lig-cuta.
- Para gerar SH3-GFP (Tabela 1):
- Amplificar o gene a partir do plasmídeo SH3 pJD757 13 usando oiniciadores apropriados.
- Fundir este fragmento com o gene GFP e inseri-la no vector pET26b entre o promotor T7 (Figura 2C) e uma etiqueta de 6xHistidine C-terminal.
2. Protein Expression
- Transformar 50 ul de quimicamente competente de Escherichia coli BL21 (DE3) com o plasmídeo de expressão apropriado.
- Após a transformação, serialmente diluídas estas células, e placa-los em meio Luria-Bertani (LB) / placas de agar contendo 50 ug / ml de canamicina.
- Incubar as placas que contêm células transformadas a 37 ° C durante ~ 15 horas.
- Após a incubação, pegar uma placa que contém 50-100 colônias e ressuspender todas as colônias em 5 ml de caldo LB.
- Transferência de suspensão de 1 L de caldo LB contendo canamicina (50 ug / ml) e as células crescer a 37 ° C com agitação a 250 rpm. Monitorar a absorvância a 600 nm (OD 600). Crescer cultura até OD 600 ~ 0,8.
- Para C e C-SH3 lig, induzir a expressão da proteína por adição de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) para a cultura (1 mM concentração final) e incubar a cultura a 37 ° C durante 4 horas, agitando a 250 rpm.
- Para N e SH3-GFP, arrefecer a cultura a ~ 18 ° C por imersão do frasco de cultura em um banho de água gelada durante ~ 5 min. Induzir a expressão da proteína por adição de IPTG à cultura (concentração final 1 mM) e incuba-se a cultura a 18 ° C durante 14-18 h, agitando a 250 rpm.
- Após expressão de proteína, centrifugar a cultura a 6.000 x g durante 20 min a 4 ° C para recolher o sedimento. Pellet celular armazenar a -80 ° C até à sua utilização.
3. Purificação de Proteínas
- Purificação de N (condições de desnaturação)
- Os sedimentos de células ressuspender em tampão A (Tabela 2) em 10 ml / g de sedimento húmido.
- Immerso e a suspensão da pelota em um banho de gelo-água e romper as células por ultra-sons (10 Amp, com um segundo pulso e 6 seg pausa durante 1 min).
- Centrifuga-se o lisado a 16.000 x g durante 20 min a 4 ° C.
- Desprezar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em tampão de DA (contendo 8 M de ureia) e centrifugar a suspensão a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C.
- Passe o sobrenadante através de uma coluna de 5 ml de ácido Ni-nitrilotriacético (NTA) previamente equilibrada com DA buffer.
- Lavar coluna com 30 ml de tampão DA suplementado com 45 mM de imidazole. Eluir a proteína purificada, utilizando 20 ml de tampão DA suplementado com 150 mM de imidazole.
- Reduzir a concentração de ureia na amostra de proteína para <1 mM, por qualquer um dos métodos a seguir indicados no 3.1.7.1 ou 3.1.7.2:
- Dializar proteína em tampão de DPBS (Tabela 2), a 4 ° C durante a noite utilizando tubos com <20 kDa de corte.
- Centrífuga proteína purificada em um 30 & #160; kDa ultra-filtração coluna de centrifugação a 2,800 xg, 4 ° C até que o volume é inferior a 1 ml. Adicionar 14 ml de tampão de DPBS à coluna para diluir a amostra de proteína. Repita a centrifugação / diluição passos mais três vezes.
- Após troca de tampão, adicionar o ditiotreitol (DTT) para a proteína purificada (final 2 mM) e concentrado de proteína de ~ 100 mg / ml por centrifugação através de uma ultra-filtração coluna de centrifugação de 30 kDa a 2800 xg, a 4 ° C.
- Alíquota da proteína concentrada e armazenar a -80 ° C até à sua utilização.
- Purificação de C e C-SH3 lig (condição nativa)
- Os sedimentos de células ressuspender em tampão B (pH 6,0) (Tabela 2) suplementado com 1x cocktail inibidor de protease a 10 ml / g de sedimento húmido. Utilize tampão acidico para minimizar a degradação proteolítica da proteína alvo.
- Interromper a suspensão de células por ultra-sons como descrito em 3.1.2. Centrifugar as lisComeram a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C e manter-se o sobrenadante.
- Passar o lisado solúvel por meio de uma de 5 ml de coluna de Ni-NTA, previamente equilibrada com tampão B.
- Lavar a coluna com tampão B complementado com imidazole 45 mM, e elui-se a proteína alvo em 20 ml de tampão B complementado com imidazole 150 mM.
- Para C, pule para o passo 3.2.6. Para C-SH3 lig, realizar uma etapa de purificação de troca iônica adicional para remover proteína parcialmente degradada como dado em passos 3.2.5.1 para 3.2.5.3
- Reduzir a concentração de NaCl no C-SH3 lig a <1 mM, seguindo o procedimento descrito em 3.1.7.
- Carregar a proteína alvo em um permutador de aniões 5 ml de contas de agarose a coluna de matriz, previamente equilibrada com tampão fosfato de sódio (50 mM, pH 7,0).
- Proteína alvo eluem a partir da coluna, executando um gradiente a partir de uma solução contendo 10 mM Tris-HCl pH 8,0 buffer a uma solução contendo o mesmo tampão suplementado com 1 M de NaCl. Retirar amostras durante a eluição da proteína e amostras de piscina com a pureza mais elevada com base em dodecil sulfato de gel de poliacrilamida de sódio (SDS-PAGE).
- Troca de tampão a proteína purificada em tampão de DPBS, como descrito em 3.1.7.
- Adicionar DTT para a proteína purificada (concentração final 2 mM) e concentra-se a proteína a ~ 100 mg / ml, utilizando uma coluna de spin de ultra-filtração de 30 kDa, tal como descrito em 3.1.8. Alíquotas e armazenamento de concentrado de proteína de -80 ° C até à sua utilização.
- Purificação de SH3-GFP
- Os sedimentos de células Ressuspender utilizando tampão A, a 10 ml / g de sedimento húmido.
- Disrupt suspensão pellet por sonicação como descrito no ponto 3.1.2.
- Centrifuga-se o lisado a 16.000 x g durante 20 min a 4 ° C e recolher o sobrenadante.
- Passa-se o sobrenadante (lisado solúvel) por meio de um 5 ml de coluna de Ni-NTA equilibrada previamente comTampão A.
- Lavar coluna com 30 ml de tampão A suplementado com 45 mM de imidazole. Eluir a proteína purificada, utilizando 20 ml de tampão A suplementado com 150 mM de imidazole.
- Troca de tampão a proteína purificada em tampão de DPBS utilizando uma metodologia semelhante ao descrito no 3.1.7 e concentrar a proteína de ~ 150 mg / ml, utilizando uma coluna de spin de ultra-filtração de 30 kDa, tal como descrito em 3.1.8.
- Alíquotas e armazenamento de proteína purificada a -80 ° C até à sua utilização.
- A análise de SDS-PAGE de amostras purificadas contendo CUTA
- Dilui-se cada proteína purificada em água duplamente destilada para reduzir a concentração de NaCl para ~ 1 mM. A esta concentração de NaCl, a maioria das proteínas CUTA trímeros executado como monómeros sobre os géis de SDS-PAGE.
- Misturar as amostras com tampão de amostra 2x SDS (0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 20% de glicerol, 10% w / v de SDS, 0,1% w / v de bromo-fenol azul, 2% β-mercaptoetanol), incubados a 95 ° C durante 5 min.
- Carregue o sampios num gel de SDS-PAGE a 12%. Realizar eletroforese a uma tensão constante de 200 V para ~ 50 min.
- Observar proteína nos géis por coloração com azul brilhante de Coomassie R250 a seguir os protocolos padrão (Figura 1C).
4. Formação Hidrogel
NOTA: os hidrogéis de amostras efectuadas neste estudo contêm 1,6 mM de cada bloco de construção hidrogel salvo indicação em contrário. Esta concentração de proteína produz um hidrogel macia e estável. ATENÇÃO: A azida de sódio (NaN 3) é adicionado ao hidrogel para uma concentração final de 0,5% w / v para evitar a contaminação bacteriana. NaN 3 é altamente tóxico e deve ser manuseado com muito cuidado, como indicado na Ficha de Segurança.
- Calcular o volume de cada uma das proteínas concentradas necessários para alcançar uma concentração final de 1,6 mM em um hidrogel 100 ul de amostra. Por exemplo:
A concentração de N:100 mg / mL
Peso molecular de N: 26,3 kDa (ver Tabela 1)
Concentração 100 l desejado:: volume desejado de 1,6 mM
- Para tornar um hidrogel 100 ul (1,6 mM), mistura C (x ul, o volume calculado de acordo com 4.1) com 5% de NaN 3 (10 mL), DTT 100 mM (5 mL) e N (y ul, o volume calculado de acordo com a 4,1) dentro de um frasco de vidro de 2 ml.
- Adicionar tampão de DPBS ((85 - x - y) ul) para o frasco de forma a alcançar um volume final de 100 ul, e misturar todos os componentes manualmente através de um movimento rotativo utilizando uma ponta de pipeta. Nota: A solução torna-se muito viscosa ao ser misturado.
- Centrifugar a mistura durante 2 min a 8000 xg para remover as bolhas de ar.
- Incubar a mistura de quartotemperatura durante a noite para permitir que a reacção de splicing trans intein para atingir a conclusão. Confirme formação hidrogel girando tubo de cabeça para baixo. As proteínas não fluirá se um hidrogel é formado.
- Estimar o rendimento intein trans-splicing, verificando amostras (0,5 ul cada) recolhidos antes do passo 4.2 e após a etapa 4.5 em um gel de SDS-PAGE, como descrito no ponto 3.4 (Figura 1C).
5. Imobilização de GFP via proteína de ancoragem (DP) e Docking Station Peptide (DSP) Interação
- Para fazer com que um 50 ul funcionalizada-GFP hidrogel (1,2 mM), combinar C-SH3 de Nata (x ul, calculado de acordo com 4.1) e SH3-GFP (y ul, calculado de acordo com 4.1) em razão molar de 1:1 em um 1,7 ml tubo de microcentrífuga e incubar-se a mistura à temperatura ambiente durante 30 min.
- Adicionam-se 5% de NaN3 (5 mL), DTT 100 mM (2,5 mL), (42,5 - x - <em> y) DPBS ul para o mesmo tubo. Adiciona-se N (y ul, calculado de acordo com a 4.1) para se atingir uma proporção de 1:1 molar de N e C-SH3 lig. Misturar a amostra usando uma ponteira por um movimento giratório.
- Centrifugar a mistura a 8.000 x g durante 2 min e incubar-se a mistura à temperatura ambiente durante a noite no escuro. Um hidrogel encapsulando formas SH3-GFP durante a incubação.
6. Uso de Hidrogel 1,6 mM como um andaime para Imobilização Reação enzimática em solvente orgânico
- Use o HRP como uma enzima modelo. Prepara-se uma solução estoque de HRP (28 mg / ml ou 0,63 mM) em DPBS.
- Para tornar um hidrogel 30 ul (1,6 mM) aprisionamento HRP, combinam C (x ul, calculado de acordo com 4.1) com HRP (2 mL), 5% de NaN 3 (3 mL) e DTT (1,5 mL de 100 mM) no interior de um 1,7 ml tubo de centrifugação.
- Adiciona-se N (y </ Em> il, calculados de acordo com 4.1) e DPBS (23,5 - x - y) mL. Misture com a ponta da pipeta com um movimento giratório.
- Centrifugar a mistura a 8.000 x g durante 2 min e incubar à temperatura ambiente durante a noite.
ATENÇÃO: os regentes utilizados para o ensaio seguinte atividade são altamente tóxicos. Use as recomendações de segurança específicas das respectivas fichas de segurança. - Por reacção enzimática, submergir o hidrogel em 1 ml de cocktail de reacção contendo N, diamina de N-dimetil-p-fenileno (5,8 mM), fenol (5,8 mM) e hidroperóxido de terc-butilo (2,9 mM) em n-heptano 14. Interromper manualmente o gel utilizando uma ponteira para aumentar a área da superfície de contato do hidrogel e do solvente.
- Detectar produto HRP, um corante do tipo indofenol, por medição da absorvância óptica de amostras tomadas a diferentes tempos a 546 nm num leitor de placas (Figura 5). </ Ol>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Um esquema para a formação do hidrogel de proteína intein mediada é apresentado na Figura 1A. Os blocos de construção de hidrogel são os copolímeros de proteína cuta-NpuN (N) e NpuC-S-cuta (C) (Figura 1A, Tabela 1). NpuN / C são os N-/C-fragments do DNAE dividir naturalmente intein de Nostoc punctiforme (NPU). Cuta é uma proteína trimérica estável de Pyrococcus horikoshii 4,5. Mistura de purificada N e C, na presença do agente redutor DTT induz a formação de uma terceira proteína - o produto ligado (J: cuta-S-cuta) (Figuras 1A e 1C). Individualmente, os blocos de construção de hidrogel N e C existem como fluidos viscosos (Figura 1B). A mistura de N e C, produz um material semi-sólido transparente, que é retida na parte inferior de um frasco de vidro após a inversão, indicativo da formação de um hidrogel 15,16 (Figura 1B) 18,19.
Este hidrogel proteína intein-mediada (1,6 mM) exibe uma estabilidade elevada solução. Há pouco ou nenhuma perda de hidrogel reticulado andaime após 21 dias a 22 ° C em tampão de DPBS, como a quantidade total de proteína libertada no tampão de DPBS apenas ligeiramente maior do que a quantidade teórica de splicing intein do hidrogel (assumindo 100 % intein eficiência de splicing trans) (Figura 3A). A densitometria revelou que, durante a formação do hidrogel, reacções de trans-splicing foram ~ 80% eficaz (Figura 1C). A análise em gel de SDS-PAGE mostrou que apenas quantidades vestigiais de produtos de trans-splicing estavam presentes no tampão em torno do hidrogel (Figura 3B, faixa J), o que confirma que a perda de hidrogel reticulado andaime para erosão é mínima. A principal proteína presente no tampão em torno do hidrogel é a emendados fora intein. Não há sinais visíveis de erosão foram observadas emum hidrogel imperturbado submerso em solução aquosa à temperatura ambiente durante mais de 3 meses (Figura 3A) de entrada de ar. O hidrogel é também altamente estável a 37 ° C (Figura 3C) e em ambos os tampões ácidos e básicos (Figura 3D).
Para facilitar a imobilização de proteínas, um par de proteína e o seu ligando péptido foi usado para ancorar proteínas de interesse dentro do andaime hidrogel. Escolhemos as proteínas SH3, uma homologia de Src 3 domínio do CRK proteína adaptador, como a proteína de ancoragem (DP) para a fusão de uma proteína de interesse, e o seu ligando (SH3 lig) como a estação de acoplamento peptídico (DSP) para incorporação cadafalso hidrogel. Este par interacção foi escolhida por causa do tamanho molecular relativamente pequeno (56 aa para SH3 e 11 aa para SH3 lig) e alta afinidade (K d = 0,1 uM) 17,18. SH3 lig foi inserido entre NpuC e Cuta para formar C-SH3 lig(Tabela 1). A proteína de SH3 foi fundida com o N-terminal de uma proteína globular alvo modelo, a proteína fluorescente verde (GFP) para formar SH3-GFP. O processo descrito no protocolo (Secção 5, Figura 4A) produz um hidrogel contendo 1,2 mM de trans-splicing blocos de hidrogel da espinha dorsal e GFP 1,2 mM. O hidrogel contendo GFP exibiu uma estabilidade semelhante ao hidrogel falta de GFP (Figura 4B), com ~ a perda de proteína total de 35% após 21 dias em tampão de DPBS. A maioria das proteínas presentes no tampão de erosão foram os inteins clivados. A taxa de lixiviação de SH3-GFP a partir de um hidrogel que contém a lig SH3 é de ~ 30% após 3 semanas, significativamente menor do que a partir de um hidrogel que falta a lig SH3 (> 70% de perda de proteína no mesmo período de tempo, a Figura 4C). O SH3-GFP imobilizada no hidrogel brilha sob luz UV. Como pode ser visto na Figura 4D, hidrogel contendo o encaixe estação Peptide SH3 lig retém a maior parte da fluorescência da GFP após 3 semanas, enquanto a falta de hidrogel SH3 lig torna-se essencialmente não fluorescente. Espera-se que o uso de uma afinidade DP / par DSP superior pode reduzir ainda mais a taxa de lixiviação da proteína imobilizada.
Neste experimento, a GFP foi utilizado como a proteína alvo, no entanto, qualquer proteína DP-tag pode ser convenientemente imobilizada em hidrogel presente. Assim, o hidrogel proteína intein mediada deve fornecer uma estrutura geral para imobilização de proteínas. A densidade de GFP imobilizado demonstrar neste trabalho é de ~ 33% molar do hidrogel. Uma densidade mais elevada de imobilização pode, potencialmente, ser alcançado quando DSP múltiplos estão incorporadas no bloco de construção de hidrogel.
Em seguida, a enzima HRP foi incorporada no hidrogel proteína para demonstrar a sua capacidade para suportar biocatálise em solventes orgânicos. A actividade enzimática foi medida através da monitorização da ligação oxidativa de
_upload/51202/51202fig1.jpg "/>
Figura 1. Hidrogel proteína intein-mediada. (A) Esquema de reacção intein trans-splicing, que provoca a formação de uma cadeia de proteína estendida (J) com proteínas do agente reticulante em ambos os terminais. Proteínas do agente reticulante de várias cadeias de proteína J associado de forma não covalente e, após a ligação de proteínas mediada por intein, induzir a formação de uma rede de proteínas altamente reticulada com propriedades de hidrogel. NpuN / C: intein N-/C-fragment. (B) A mistura de purificada N e C (8,3% w / v), conduz à formação de uma rede de hidrogel altamente reticulado (1,6 mM J). Análise (C) de SDS-PAGE de N e C blocos purificados antes e depois da mistura. "N + C" corresponde a uma amostra retirada diretamente de um hidrogel de 1,6 mM. "*" Indica uma clivagem intein si C-terminalproduto da reacção de. Intensidade de cada banda foi quantificada usando o 'módulo traço no "Quantidade One" software. Intensidade da banda foi dividida pelo peso molecular de proteínas para obter o equivalente molar de eficiência. Trans-splicing (~ 80%) foi calculado a partir da quantidade de produto que não reagiu a J e N / C na mesma pista. Reproduzido com permissão do Journal of American Chemical Society. (Doi: 10.1021/ja401075s) Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 2. Mapas plasmidicos de construções de proteína. (A) cuta-NpuN, (B) NpuC-S-cuta e (C) SH3-GFP (<strong> Tabela 1) foram clonados em pET26b vetor sob o controle do promotor T7. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 3. Estabilidade de hidrogéis proteína intein mediadas em DPBS. (A) perfil de erosão de um hidrogel de 1,6 mM a 22 ° C. A linha a tracejado representa a massa teórica de os inteins clivados. A entrada mostra um hidrogel não perturbada em DPBS após 3 meses à temperatura ambiente. (B) A análise de SDS-PAGE do tampão circundante do hidrogel. Todas as amostras do tampão, em que o hidrogel foi imerso em (A) foram reunidas (total de 7,5 ml) e concentrou-se 75 vezes por meio de ultrafiltração, através de 10 kDuma membrana antes do carregamento gel J:. intein produto trans-emendados N:.. que não reagiu cuta-NpuN NpuN: emendados fora fragmento N-intein. C que não reagiu e emendados para NpuC não estão visíveis no gel, devido à pequena quantidade e tamanho pequeno (4 kDa), respectivamente. O asterisco indica a bandas não identificados. (C) o perfil da erosão de hidrogel incubados a diferentes temperaturas. (D) o perfil Erosão de hidrogéis incubadas em dois pHs diferentes. Reproduzido com permissão do Journal of American Chemical Society. (Doi: 10.1021/ja401075s) Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 4. Intein-hidrogel mediada suporta a imobilização de proteínas globulares funcionais. (A) Esquema de imobilização de proteínas utilizando GFP como um modelo de proteína globular. O edifício hidrogel bloco contendo DSP é primeiro misturado com proteína alvo DP-fundido para carregamento proteína alvo para o bloco de construção. A complementar intein edifício hidrogel de bloco contendo fragmento é adicionado à mistura dando origem a um hidrogel com GFP imobilizado. (B) perfil de erosão de proteína total de hidrogel contendo razão molar de 1:1 de SH3-GFP. A linha pontilhada representa a massa teórica dos inteins emendados fora. As barras de erro representam o desvio padrão de duas experiências independentes. (C) lixiviação perfil de SH3-GFP a partir de hidrogel com e sem o DSP. (D) Imagens da GFP contendo hidrogéis sob exposição aos raios UV imediatamente após a formação do hidrogel e depois de 21 dias. Reproduzido com permissão do Journal of American Chemical Society (doi:. 10.1021/ja401075s) Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 5. A peroxidase de rábano (HRP)-encapsulada hidrogel proteína intein-desencadeada facilita a reacção HRP-catalisada em solvente orgânico de n-heptano. (A) reacção modelo catalisada por HRP em solventes orgânicos. (B) fotografia de hidrogéis contendo HRP encapsulado depois de ter sido interrompido em pequenos fragmentos e incubados em um cocktail de reacção durante 10 min e 30 min (à esquerda) e experiência de controlo com a mesma quantidade de HRP nonimmobilized em tampão de DPBS (direita). (C) A formação de produto foi monitorizada por absorvância a 546 nm. Adaptado com permissão de Journal of Ameripode Chemical Society. (doi: 10.1021/ja401075s) Clique aqui para ver imagem ampliada.
Tabela 1. Construções de proteínas usados neste estudo.
| Nome curto | Sequência de Proteína | MW (kDa) |
| Cuta-NpuN (N) | Cuta-EAC-(GGGGS) 2-AS-NpuN-HHHHHH | 26,3 |
| NpuC-S-Cuta (C) | NpuC-CFNKLYRDPMG-[(AG) 3 PEG] 10 -ARMPYV-C utA- HHHHHH | 26.1 |
| NpuC-S-SH3 lig - Cuta (C-SH3 lig) | NpuC-CFNKLYRDPMG-[(AG) 3 PEG] 10 -ARMPYVGS- PPPALPPKRRR-(GGGGS) 2-AS-cuta-HHHHHH | 28,3 |
| SH3-GFP | SH3-KL-(GGGGS) 2-AS-GFP-HHHHHH | 34,5 |
Reproduzido com permissão do Journal of American Chemical Society (doi: 10.1021/ja401075s).
Tabela 2. Composições de buffer.
| Tampão A | 500 mM de NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 |
| Tampão DA | 500 mM de NaCl, 8 M de ureia, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 |
| Tampão B | NaCl 500 mM, NaPOi 50 mM, pH 6,0 |
| DPBS | Dulbecco PBS, NaCl 137,9 mM, KCl 2,7 mM, 1,5 mM, KH 2 PO 4, 8,1 mM de Na 2 HPO 4, pH 7,4 |
Reproduzido com permissão do Journal of American Chemical Society (doi: 10.1021/ja401075s).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neste trabalho, nós demonstramos a síntese de uma proteína de hidrogel intein mediada altamente estável. O uso de uma divisão permite intein o hidrogel ser condicionalmente formada em resposta à mistura de dois componentes em fase líquida. Especificamente, a divisão intein covalentemente liga dois blocos em fase líquida através de uma reação de trans-splicing, produzindo uma unidade polipeptídeo ladeado por reticulação unidades que, por sua vez auto monta em um hidrogel. A formação induzida por mistura do hidrogel contorna as dificuldades técnicas para a síntese de hidrogeles da proteína de componente único em que o entupimento mediada por gel de colunas de purificação cromatográficos podem ocorrer. Além disso, as formas de hidrogel, em condições fisiológicas, sem a necessidade de quaisquer indutores químicos estranhos e / ou disparadores físicas.
O hidrogel mediada por intein mantém a alta estabilidade em tampões de ambos ácidos e básicos, e à temperatura fisiológica. Os hidrogéis podem formar with tão pouco quanto 0,8 mM de cada um dos blocos de construção individual (dados não mostrados), mas mais elevadas concentrações de proteína (~ 1,6 mM) hidrogéis de rendimento com uma melhor estabilidade mecânica. Elevada estabilidade do hidrogel é atribuído à utilização de 1) uma proteína trimérica muito estável, CUTA, como um agente de ligação cruzada, e 2) intein para juntar diferentes agentes de ligação cruzada covalente. A análise densitométrica dos geles de SDS-PAGE mostraram que aproximadamente 80% das proteínas de entrada foram submetidos com êxito a separação reacção de splicing trans intein-catalisada.
Para a formação do hidrogel, os blocos de construção individuais são primeiro concentradas a ~ 100 mg / ml. Um agente redutor, tal como DTT, necessita de estar presente durante o passo de concentração de proteína para evitar a formação de ligações dissulfureto intermoleculares. Na ausência de agente de redução, bloco de construção de hidrogel indivíduo concentrado pode, por vezes, formar o material de hidrogel semelhante. No entanto, este material semelhante a gel dissolve-se rapidamente quando imerso em um tampão e / ou na presençade agente redutor.
Para obter um hidrogel com o máximo de estabilidade, é importante para garantir que a proporção molar dos dois blocos de construção de hidrogel é de 1:1. Qualquer bloco de construção em excesso não será reticulado e pode afetar as propriedades mecânicas do hidrogel. Proteína concentrada tem de ser distribuído por alíquotas e armazenado individualmente para minimizar a ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.
Também demonstramos a utilização de hidrogel mediado pela proteína-intein como um biocatalisador compatível com solvente orgânico. Especificamente, foi observado que incorporam hidrogéis a enzima HRP foram imersos em n-heptano contendo o substrato e a conversão bem sucedida do substrato em produto. O hidrogel proteína serve como um andaime eficaz para biocatálise em solvente orgânico provavelmente devido à protecção contra a desnaturação biológica mediada por solvente oferecido pelo ambiente altamente hidratado do hidrogel.
Uma das limitações da thé a tecnologia de imobilização de enzimas é a necessidade de se fundir a proteína alvo com um péptido de ancoragem (DP). Esta modificação pode afetar a atividade e solubilidade de algumas proteínas-alvo e, portanto, requerem otimização de caso-a-caso das construções de proteína DP-marcados. Além disso, uma pequena quantidade de proteínas marcadas lixiviado para fora da estação de acoplamento peptídico (DSP) que contém hidrogel após 1 semana. A estabilidade da proteína imobilizada é afectada pela afinidade do par de DSP / DP. Para obter uma melhor eficiência de imobilização, será necessária uma afinidade DSP / DP par mais alto. Finalmente, este exposições hidrogel relativamente fraca propriedade mecânica devido ao baixo módulo de armazenamento platô (100-200 kPa) 9. O módulo de armazenamento patamar é influenciado pelas estruturas de tanto o agente de reticulação e o meio da quadra 19. No hidrogel de corrente, uma proteína trímero foi usado como o agente de reticulação. A utilização de proteínas crosslinker com um estado multimérico superior pode potencialmente aumentar o planalto hidrogel ruaOrage módulo e sua propriedade mecânica.
Em resumo, descrevemos a síntese e caracterização de um novo hidrogel de proteína que condicionalmente forma mediante a mistura de dois blocos de construção de proteínas em fase líquida, contendo cada um uma metade de uma divisão intein. Hidrogéis proteína intein mediadas por representar um novo material promissor, com aplicações potenciais em reações enzimáticas sintéticos, síntese orgânica, administração de medicamentos injetáveis, e engenharia de tecidos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não existem interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer o Dr. David Tirrell (Caltech), pelo seu dom tipo de plasmídeo pQE9 AC 10 ATRP 12, o Dr. Tom Muir (Universidade de Princeton), pelo seu dom tipo de plasmídeo KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, Dr. Takehisa Matsuda (Kanazawa Institute of Technology, Hakusan, Ishikawa, Japão), pelo seu dom tipo de plasmídeo pET30-cuta-Tip1 10, e Dr. Jay Keasling D. (UC Berkley) pelo seu dom tipo de plasmídeo pJD757 13 . Este trabalho foi apoiado em parte pela National Science Foundation CARREIRA, EUA Força Aérea YIP e Norman Hackman Programa Advanced Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase |
New England BioLabs | M0530S |
|
| Competent Escherichia coli BL21 (DE3) |
New England BioLabs | C2527I |
|
| Luria Bertani |
VWR | 90003-350 |
|
| Bacto Agar Media |
VWR | ||
Kanamycin sulfate |
VWR | ||
| IPTG |
VWR | EM-5820 |
|
| Imidazole |
VWR | EM-5720 |
|
| Urea |
VWR | EM-9510 |
|
| Dithiothreitol (DTT) |
Fisher | BP172-5 |
|
| Protease Inhibitor cocktail |
Roche Applied Science | 11836153001 |
|
| DPBS |
VWR | 82020-066 |
|
| Brilliant Blue R |
Acros Organics | A0297990 |
|
| Sodium Azide |
Fisher | AC190380050 |
Caution, highly toxic |
| Horseradish peroxidase |
Sigma | P8125-5KU |
|
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine |
Fisher | AC408460250 |
Caution, highly toxic |
| phenol |
Fisher | AC149340500 |
Caution, highly toxic |
tert-butyl hydroperoxide |
Fisher | AC180340050 |
Caution, highly toxic |
| n-heptane |
Acros Organics | 120340010 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shaker/Incubator |
Fisher Scientific | Max Q 6000 |
|
| Centrifuge |
Sorvall | RC 6 |
|
| Sonicator |
QSonica | Misonix 200 |
|
| Ultrafiltration Tubes |
Amicon Ultra | UFC903024 |
|
| Ni Sepharose High Performance HisTrap column |
GE Healthcare Life Sciences | 17-5248-01 |
|
| HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column |
GE Healthcare Life Sciences | 17-5156-01 |
|
| Plate reader |
Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM |
References
- Banta, S., Wheeldon, I. R., Blenner, M. Protein Engineering in the Development of Functional Hydrogels. Ann. Rev. Biomed. Eng. 12, 167-186 (2010).
- Iwai, H., Zuger, S., Jin, J., Tam, P. H. Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostoc punctiforme. FEBS Lett. 580, 1853-1858 (2006).
- Zettler, J., Schutz, V., Mootz, H. D. The naturally split Npu DnaE intein exhibits an extraordinarily high rate in the protein trans-splicing reaction. FEBS Lett. 583, 909-914 (2009).
- Tanaka, Y., et al. Structural implications for heavy metal-induced reversible assembly and aggregation of a protein: the case of Pyrococcus horikoshii CutA. FEBS Lett. 556, 167-174 (2004).
- Sawano, M., et al. Thermodynamic basis for the stabilities of three CutA1s from Pyrococcus horikoshii,Thermus thermophilus, and Oryza sativa, with unusually high denaturation temperatures. Biochemistry. 47, 721-730 (2008).
- Tanaka, T., et al. Hyper-thermostability of CutA1 protein, with a denaturation temperature of nearly 150 degrees C. FEBS Lett. 580, 4224-4230 (2006).
- Shen, W., Zhang, K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Tuning the erosion rate of artificial protein hydrogels through control of network topology. Nat. Mater. 5, 153-158 (2006).
- McGrath, K. P., Fournier, M. J., Mason, T. L., Tirrell, D. A. Genetically directed syntheses of new polymeric materials. Expression of artificial genes encoding proteins with repeating -(AlaGly)3ProGluGly- elements. J. Am. Chem. Soc. 114, 727-733 (1992).
- Ramirez, M., Guan, D., Ugaz, V., Chen, Z. Intein-triggered artificial protein hydrogels that support the immobilization of bioactive proteins. J. Am. Chem. Soc. 135, 5290-5293 (2013).
- Ito, F., et al. Reversible hydrogel formation driven by protein-peptide-specific interaction and chondrocyte entrapment. Biomaterials. 31, 58-66 (2010).
- Lockless, S. W., Muir, T. W. Traceless protein splicing utilizing evolved split inteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10999-11004 (2009).
- Shen, W., Lammertink, R. G. H., Sakata, J. K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Assembly of an artificial protein hydrogel through leucine zipper aggregation and disulfide bond formation. Macromolecules. 38, 3909-3916 (2005).
- Dueber, J. E., et al. Synthetic protein scaffolds provide modular control over metabolic flux. Nat. Biotechnol. 27, (2009).
- Bruns, N., Tiller, J. C. Amphiphilic network as nanoreactor for enzymes in organic solvents. Nano Lett. 5, 45-48 (2005).
- Das, D., et al. Water gelation of an amino acid-based amphiphile. Chem. Eur. J. 12, 5068-5074 (2006).
- Cao, Y., Li, H. Engineering tandem modular protein based reversible hydrogels. Chem. Commun. , 4144-4146 (2008).
- Wu, X., et al. Structural basis for the specific interaction of lysine-containing proline-rich peptides with the N-terminal SH3 domain of c-Crk. Structure. 3, 215-226 (1995).
- Nguyen, J. T., Turck, C. W., Cohen, F. E., Zuckermann, R. N., Lim, W. A. Exploiting the basis of proline recognition by SH3 and WW domains: Design of n-substituted inhibitors. Science. 282, 2088-2092 (1998).
- Olsen, B. D., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Yielding Behavior in Injectable Hydrogels from Telechelic Proteins. Macromolecules. 43, 9094-9099 (2010).
