Aanpassing van semiautomated doorgeven Tumor Cell (CTC) Testen voor Klinisch en preklinisch onderzoek naar toepassingen

Summary

Circulerende tumorcellen (CTC's) zijn prognostische in verschillende uitgezaaide tumoren. Dit manuscript beschrijft de gouden standaard CellSearch systeem (CSS) CTC opsomming platform en hoogtepunten gemeenschappelijke misclassificatie fouten. Daarnaast worden twee aangepast protocollen beschreven gebruiker gedefinieerde marker karakterisering van CTCs en CTC opsomming in preklinische muismodellen van metastase met deze technologie.

Abstract

De meerderheid van kanker-gerelateerde sterfgevallen na de ontwikkeling van gemetastaseerde ziekte. Deze zeer letale ziektestadium wordt geassocieerd met de aanwezigheid van circulerende tumorcellen (CTCs). Deze zeldzame cellen aangetoond van klinisch belang metastatische borst-, prostaat-en colorectale kankers. De huidige gouden standaard in klinische CTC opsporen en kwantificeren is de FDA goedgekeurd CellSearch systeem (CSS). Dit handschrift worden de standaard protocol gebruikt door dit platform en twee aanvullende protocollen aangepast dat de gedetailleerde proces door de gebruiker gedefinieerde marker optimalisatie voor eiwit karakterisering van CTCs patiënt en een vergelijkbaar protocol voor CTC registratie in zeer lage hoeveelheden bloed te beschrijven, middels standaard CSS reagentia, voor het bestuderen van in vivo preklinische muismodellen van metastase. Daarnaast verschillen in CTC kwaliteit tussen gezonde donor bloed waaraan cellen uit weefselkweek versus patiënt bloed samples worden gemarkeerd. Tot slot, diverse veelgebruikte discrepant items die kunnen leiden tot CTC misclassificatie fouten worden geschetst. Tezamen zullen deze protocollen een nuttige bron voor gebruikers van dit platform geïnteresseerd in preklinisch en klinisch onderzoek met betrekking tot metastase en CTC.

Introduction

In 2013 wordt geschat dat 580.350 mensen sterven aan kanker en 1.660.290 nieuwe gevallen van deze ziekte in de Verenigde Staten alleen ¹ worden gediagnosticeerd. De meerderheid van deze sterfgevallen na ontwikkeling van metastatische ziekte ^2. Het huidige gebrek aan effectieve therapieën bij de behandeling van metastasen en een beperkt begrip van de metastatische cascade maakt dit stadium van de ziekte zeer dodelijk. De aanwezigheid van circulerende tumorcellen (CTCs) in de bloedbaan is aangetoond dat correleert met metastasen ^3. Deze cellen zijn uiterst zeldzaam en hun detectie is een indicatie van de totale overleving bij uitgezaaid....

Protocol

Alle menselijke studies in dit manuscript beschreven werden onder protocollen door Western University Human Research Ethics Board goedgekeurd uitgevoerd. Alle dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van de Canadese Raad over Animal Care, onder protocollen door de Western University dierproeven subcomite goedgekeurd.

1. Standaard CTC opsomming van patiënt Bloed monsters met behulp van de CSS

1. Menselijk bloed Monstername en voorbereiding voor verwerking op de voorbereiding Instrument

1. Met behulp van standaard aseptische technieken flebotomie opneming minste 8,0 ml humaan bloed i....

Results

Standaard CTC opsomming Assay

De gevoeligheid en specificiteit van de CSS is goed gedocumenteerd in de literatuur. Echter, om gelijkwaardige CTC herstel valideren, spiked (1000 LNCaP menselijke prostaatkankercellen) en verrijkte menselijke bloedmonsters van gezonde vrijwillige donoren werden verwerkt op de CSS met behulp van de standaard CSSCTC protocol. Zoals verwacht, verrijkte monsters waren vrij van CTC, 0,00 ± 0,00%, en CTC herstel werd aangetoond 86,9 ± 4,71% te zijn voor verrijkte monste.......

Discussion

Ondanks de ontwikkeling van vele nieuwe CTC technologieën sinds de invoering van de CSS in 2004, deze techniek is nog steeds de enige klinisch goedgekeurde technologie op de markt van vandaag en daarom wordt beschouwd als de huidige gouden standaard voor CTC opsporen en kwantificeren. Dit manuscript heeft aangetoond dat, hoewel de CSS heeft strenge normen voor de kwaliteitscontrole kan worden onderworpen aan interpretatiebias en dat CTC identificatie in monsters van patiënten is veel verschillend van identificatie in ve.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA
Anti-human CD44-FITC	BD Pharmigen	555478
Anti-human CD44-PE	BD Pharmigen	555479
Anti-human HLA-Alexa Fluor 488	BioLegend	311415
Anti-mouse CD45-APC	eBioscience	17-0451-82
Bond Primary Antibody Diluent	Leica	AR9352
CellSave Preservative Tubes	Veridex	952820 (20 pack) 79100005 (100 pack)
CellSearch CTC Control Kit	Veridex	7900003
CellSearch CTC Kit	Veridex	7900001
CellSearch CXC Control Kit	Veridex	7900018RUO
CellSearch CXC Kit	Veridex	7900017RUO
Instrument Buffer	Veridex	7901003
Streck Cell Preservative (aka CytoChex)	Streck	213350
1 ml Syringe
10 ml Serological pipette
1,000 µl Pipette
1,000 µl Pipette tips
12 mm x 75 mm Flow tubes
200 µl Gel loading tips
200 µl Pipette
22 G Needle
5 3/4 in Disposible Pasteur pipet	VWR	14672-200
5 ml Serological pipette
Automated pipettor
Capillary Blood Collection Tube (EDTA)	BD Microtainer	365974
CellSearch Analyzer II	Veridex	9555	Includes magnests and verification cartirdges
CellSearch AutoPrep System	Veridex	9541
Centrifuge
MagCellect Magnet	R&D Systems	MAG997
Small Latex Bulb	VWR	82024-550
Vortex