Live-Imaging van mitose in het ontwikkelen van muis embryonale Cortex

Summary

Progenitorceltransplanten mitose is een kritische parameter van neurogenese. Veel van onze kennis van neurale voorlopercellen mitose is gebaseerd op de analyse van vaste weefsel. Live-beeldvorming in de embryonale hersenen plakjes is een veelzijdige techniek om mitose te beoordelen met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie in een gecontroleerde omgeving.

Abstract

Hoewel korte duur, mitose is een complexe en dynamische meerstapsproces fundamenteel belang voor de ontwikkeling van organen zoals de hersenen. In de ontwikkeling van cerebrale cortex, kan abnormale celdeling van neurale voorlopercellen defecten veroorzaken in de hersenen omvang en functie. Daarom is er dringend behoefte aan tools om de mechanismen van neurale voorlopercellen mitose begrijpen. De corticale ontwikkeling bij knaagdieren is een uitstekend model voor het bestuderen van dit proces. Neurale voorlopercellen mitose wordt vaak in vaste hersenen secties onderzocht. Dit protocol zal in detail beschrijven een aanpak voor live-beeldvorming van mitose in ex vivo embryonale hersenen plakjes. We zullen de kritische stappen beschrijven voor deze procedure, waaronder: hersenen extractie, hersenen inbedding, vibratome snijden van de hersenen plakjes, kleuring en kweken van plakjes, en time-lapse imaging. Wij zullen dan laten zien en beschrijf in detail hoe na de overname analyse van mitose te voeren. We zijn onder andere representatieve resultaten frOM deze test met de vitale kleurstof Syto11 transgene muizen (histon H2B-EGFP en Centrin-EGFP) en in utero elektroporatie (mCherry-α-tubuline). We zullen bespreken hoe deze procedure het beste kan worden geoptimaliseerd en hoe het kan worden aangepast voor onderzoek naar genetische regulatie van de mitose. Live-beeldvorming van mitose in de hersenen plakjes is een flexibele benadering van de invloed van leeftijd, anatomie, en genetische verstoring in een gecontroleerde omgeving te beoordelen, en een grote hoeveelheid gegevens met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie te genereren. Vandaar dit protocol zal de bestaande instrumenten voor de analyse van neurale voorlopercellen mitose.

Introduction

De algemene doelstelling van dit protocol is om te beschrijven hoe om live beeldvorming van neurale voorlopercellen mitose presteren in embryonale hersenen plakjes. Met behulp van live beeldvorming van de hersenen plakjes in de cultuur, dit protocol voorziet in een eenvoudige methode om meerdere aspecten van de mitose assay in neurale voorlopercellen in een omgeving die sterk lijkt op een in vivo setting. Het kan worden toegepast op hersenen van mutante dieren en / of hersenen die zijn gemanipuleerd met in utero elektroporatie) ^1-5. Deze techniek is ook ideaal om het effect van farmacologische middelen op mitose neurale precursoren te tes....

Protocol

1. Bereiding van media (fig. 1, stap 1)

1. Slice Cultuur Medium
   1. 25 ml slice kweekmedium is voldoende om 5 glazen bodem gerechten te bereiden met 2 sneetjes per putje.
   2. In een 50 ml conische buis, voeg 250 ul van een 100x N2-oplossing en 500 ui 50x B27 oplossing zonder vitamine A. DMEM/F12 Naar een volume van 22,5 ml.
   3. Filter steriliseren oplossing en vervolgens voeg 1,25 ml hitte geïnactiveerd paard serum en 1,25 ml foetaal bovine serum.
   4. Incubeer oplossing in een waterbad bij 37 ° C gedurende de duur van het preparaat van de segmenten.
   5. Voeg groeifactoren (FGF en EGF, eindconcentratie van 10 ng ....

Results

Het succes van deze test en de observatie van meerdere mitotische cellen tijdens een live-imaging sessie grotendeels afhangen van zowel de integriteit en anatomische niveau van het segment waar overnames worden gemaakt. Zoals hieronder besproken, de anatomische niveau van een segment is een belangrijke factor. Figuur 3A toont rostro-caudale en mediale-laterale locaties waar wij het ​​meest succesvol zijn geweest. Voor meer discussie over dit onderwerp zie Noctor ^26. De integriteit van het sch.......

Discussion

Het grote voordeel van het protocol we hebben beschreven dat het een dynamische temporele resolutie van mitose van neurale voorlopercellen. Gewoonlijk assays mitose visualiseren in de ontwikkelende hersenen worden uitgevoerd met behulp van immunofluorescentie vaste weefselsecties. Maar deze aanpak geeft slechts een momentopname van de mitose op een tijdstip.

Er zijn verschillende stappen die het meest essentieel voor het afbeelden van mitose in hersenenplakken: 1) De hersenen plakjes moet bl.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100X N2	Life technologies	17502048	for culture medium
50X B27 without vitamin A	Life technologies	12587010	for culture medium
DMEM/F12	Life technologies	11320033	for culture medium
Heat-inactivated horse serum	Sigma Aldrich	H1138-500ml	for culture medium
Heat-inactivated calf serum	Sigma Aldrich	F4135-500ML	for culture medium
FGF	R&D Sytems	3139-FB-025	for culture medium
EGF			for culture medium
10X HBSS	Life technologies	14065-056	for the dissection of the embryos
Hepes Free Acid	Sigma Aldrich	H4034	dilute to 1 M (pH 7.4)
2.5 M D-Glucose	Sigma Aldrich	G8769	for the dissection of the embryos
0.9 M NaHCO3	Life technologies	25080-094	for the dissection of the embryos
Low-melting agarose	Fisher	BP165-25	for generating slices
Syto11	Life technologies	S7573	Make 5µl aliquots
3 mg/ml collagen type I	Life technologies	A1048301	for culturing slices
Glass bottom dish	MatTek	P35G-1.5-14-C	for culturing slices
Petri dishes			for dissection of the embryos
Digital thermometer			to measure the temperature of the agarose
Spatula			to transfer brains
Paintbrush			alternative to transfer brains
Vibratome	Leica	VT1000s	for generating slices
Dissecting microscope			dissecting out embryos
Imaging microscope			A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber