Protéines consensus dérivé du cerveau, Protocole d'extraction pour l'étude de l'homme et du protéome murin cerveau en utilisant deux 2D-DIGE et Mini 2DE Immunoblotting

Résumé

Un protocole d'extraction de la protéine en utilisant un tampon commun urée / thiourée / SDS pour le tissu cérébral des souris humain et permet indentification de protéines par 2D-DIGE et leur caractérisation ultérieure par un mini 2DE immunoblot. Cette méthode permet un pour obtenir des résultats plus fiables et reproductibles à partir de biopsies humaines et des modèles expérimentaux.

Résumé

Deux dimensions électrophorèse sur gel (2DE) est un outil puissant pour découvrir les modifications du protéome potentiellement liés aux différentes conditions physiologiques ou pathologiques. Fondamentalement, cette technique est basée sur la séparation des protéines en fonction de leur point isoélectrique dans une première étape, et d'autre part en fonction de leur poids moléculaire par SDS sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE). Dans ce rapport, un échantillon protocole de préparation optimisé pour petite quantité de tissus post-mortem et le cerveau de la souris humaine est décrite. Cette méthode permet d'effectuer à la fois un gel électrophorèse bidimensionnelle de différence de fluorescence (2D-DIGE) et d'un mini 2DE immunoblot. La combinaison de ces approches permet de trouver non seulement de nouvelles protéines et / ou des modifications des protéines dans leur expression grâce à sa compatibilité avec détection par spectrométrie de masse, mais aussi un nouvel éclairage sur la validation des marqueurs. Ainsi, mini-2DE couplé à un permis de transfert de Western pour identifier et valider poste-Traductionnelles des protéines, des modifications du catabolisme et fournit une comparaison qualitative entre les différentes conditions et / ou traitements. Ici, nous fournissons une méthode pour étudier les composants d'agrégats de protéines trouvées dans la MA et la démence à corps de Lewy, comme le peptide bêta-amyloïde et l'alpha-synucléine. Notre méthode peut donc être adaptée pour l'analyse du protéome et d'extraire les protéines insolubles à partir des modèles de tissu cérébral des souris et humaines aussi. En parallèle, il peut fournir des informations utiles pour l'étude des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans les maladies neurodégénératives ainsi que des biomarqueurs de nouveaux potentiels et les cibles thérapeutiques.

Introduction

Les troubles mentaux et neurologiques représentent 13% de la charge mondiale de morbidité, de nouveaux défis tels que les mécanismes physiopathologiques, les facteurs de risque et des biomarqueurs avant-coureurs doivent être explorées ^1. Conformément à cet objectif, la protéomique études du cerveau humain deviennent indispensables pour découvrir voies moléculaires impliquées dans des processus tels que la mémoire, le comportement, les émotions et la plasticité neuronale, par exemple, non seulement pour des raisons physiologiques, mais aussi pour des conditions pathologiques. Par conséquent, l'utilisation de modèles animaux et plus particulièrement les ....

Protocole

1. Homogénéisation et extraction de protéines totales de l'homme et de la souris tissu cérébral

1. Cerveau homogénéisation des tissus. Homogénéiser le tissu cérébral de 10% (p / v) dans 8 M d'urée, 2 M thiourée et 1% p / v de tampon SDS (UTS) à l'aide d'un verre de potier (pour les échantillons humains) ou Téflon homogénéisateur (pour les échantillons de souris). Traitement par ultrasons à 60 30 Hz des impulsions avec un générateur d'ultrasons pour l'application de 0,5 sec désintégration totale du tissu ^{13, 14.}
   1. Déterminer la concentration de protéine avec dosage de Bradford, en utilisant la BSA comme standard. Cette....

Résultats

Protéomique sur le tissu cérébral reste difficile car aucun tampon idéal existe pour récupérer 100% de protéines, en particulier associée à la membrane ou des protéines du cytosquelette. La première série d'expériences a été axée sur la recherche d'un tampon de lyse approprié compatible avec les deux approches et qui permet de récupérer un large panel de protéines. Ainsi, trois tampons de lyse ont été analysés afin de déterminer la plus appropriée. Tout d'abord, on a utilisé le tampon de la biologie molécula.......

Discussion

Découvrir les changements d'expression de protéines pathologiques, recherche de biomarqueurs et la modulation des voies possibles pour cibles pharmacologiques sont parmi les objectifs des neuroprotéomique approches ^30. Au milieu des nouveaux outils, le domaine 2DE ajoute une expectative prometteur. Néanmoins, un consensus devrait être atteint afin de minimiser la variabilité et augmenter la reproductibilité dans les expériences. Conformément à cette idée un protocole normalisé pour effectuer 2D-DIGE

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 Nmo	GE Healtcare	25-8010-65
Immobiline DryStrip	GE Healtcare		Référence en fonction de l’intervalle/taille du pH
Tampon IPG, pH X-X	GE Healtcare		Référence en fonction de l’intervalle de pH souhaité
AMBERLITE IRN-150L RÉSINE À LIT MIXTE 1  ;	GE Healtcare	551797N DRYSTRIP
COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l	GE Healtcare	17-1335-01
KIT BOÎTE IPG 1 * 1 KIT	GE Healtcare	28-9334-92	Boîte en plastique pour faire la réhydratation passive  ;
MILLEX GS Filtre	Millipore	SLGS033SB
Criterion XT Gels préfabriqués 13,3 x 8,7 cm (L x L)	Bio-Rad		Référence en fonction du MW à séparer
IPGphor III Unité de mise au point isoélectrique	GE Healtcare	11-0033-64
Ettan DALTsix Large Système d’électrophorèse	GE Healtcare	80-6485-08
OneTouch 2D Gel SpotPicker 1,5 mm	Gel Company	P2D1.5