Histochemische kleuring van Arabidopsis thaliana Secundaire celwand Elements

Summary

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

Abstract

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40–50%), hemicellulose (25–30%), and lignin (20–30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas Mäule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Introduction

De celwand fabriek heeft een overvloed aan informatie binnen de verschillende onderdelen: lignine, cellulose, hemicellulose (xylan, glucuronoxylan, xyloglucan, arabinoxylan, gemengde koppeling glucaan, of glucomannaan), en pectine. Histologische technieken bieden belangrijke visuele aanwijzingen in het bestuderen van verschillen binnen de secundaire celwanden op organisatorisch en cellulair niveau. Verschillende histologische technieken werden ontwikkeld en is te vinden in de literatuur, maar deze technieken kan uitdagend en tijdrovend zijn voor beginners omdat zeer gedetailleerde protocollen met eenvoudige visuele instructies zijn zelden of nooit beschikbaar. Het do....

Protocol

1. Stem Embedding

1. Maak een 7% agarose-oplossing in water (7 g elektroforese-grade agarose in 100 ml gedestilleerd water). De agar autoclaaf gedurende 20 minuten of door de magnetron gedurende 20 minuten bij laagste intensiteit (bijvoorbeeld 10% intensiteit van een 1250 watt magnetron).
2. Bereid een zelfgemaakte mal voor het inbedden van de stelen met behulp van plastic flesjes.
   1. Met behulp van een scheermesje, afgesneden van de conische bodem van 2 ml met schroefdop microcentrifugebuis (deel A). Met een injectienaald, prik een gat in de buis dop iets groter dan de diameter van de steel worden ingebed. Vervolgens cut 0,5 cm van de b....

Results

Stem Embedding en Snijden:
Het gebruik van de zelfgemaakte plastic mal insluiten stelen in 7% agarose bleek gemakkelijk (figuur 1). De twee delen (A en B; figuur 1) van de embedded flacon systeem maken het eenvoudig om gemakkelijk de steel ingebed in agarose als de agarose plakt niet aan de flacon onderdelen die inert zijn los, waardoor het systeem schoon. De flesjes kan meerdere keren worden hergebruikt jaar. Het gemak van het opslaan van de ingebedde stam maakt de volgende stap.......

Discussion

A. thaliana stengeldelen worden veel gebruikt om de organisatie van de cellen in de secundaire celwand bestuderen en kwalitatief onderzoek van de verschillen tussen wildtype en transgene planten. De meest gebruikte technieken voor het snijden van de exemplaren zijn directe snijdend; of wanneer monsters zijn ingebed in agarose of fixeermiddel kan snijden worden gedaan met een vibratome of microtoom. In tegenstelling tot de hand snijden, de laatste twee mogelijk maken waardoor de kans op het produceren onnauwkeur.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	EMD	MERC2125	CAS Number: 9012-36-6
Phloroglucinol	Sigma	P 3502	1,3,5-trihydroxybenzene [CAS Number: 108-73-6]
Hydrochloric acid	EMD	HX0603-75	CAS Number: 7647-01-0
Ammonium hydroxide	EMD	AX1303-6	CAS Number: 1336-21-6
Toulidine Blue O	Sigma	T3260	Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS Number 92-31-9]
Potassium permanganate	Sigma	223468	CAS Number 7722-64-7
Ethanol 190 proof	KOPTEC	V1401	CAS Number: 64-17-5
Congo Red	Sigma	C6277	Disodium 3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalene 1-sulphonate) [CAS Number 573-58-0]
Fluorescent Brightener 28/ Calcofluor White Stain	Sigma	F3543	4,4'-Bis[[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2'-disulphonic acid [CAS Number 4404-43-7]
Vibratome	Leica	Leica Vibrating blade microtome VT1000S	http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/
Razor	American Safety razor company	Item # 60-0139-0000	Stainless Steel Double Edge Blade (Personna Super)
Screw Cap Microcentrifuge Tubes (2 ml)	VWR	16466-044
Microcentrifuge Tubes (0.6 ml)	Axygen Scientific	MCT-060-C
Mitt	Bel-Art	380000000	SCIENCEWARE  Hot Hand Protector Mitt
Tissue adhesive	Ted Pella Inc	10033	Store at 4 °C or 20 °C for 3 months or longer storage
Microwave	Panasonic	NN-SD762S	PELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive
Camera with CCD chip with no mechanical shutter	Hamamatsu	C4742-95
High speed color camera	QImaging	MicroPublisher 5.0 RTV
Camera software	Molecular Devices	MetaMorph version 7.7.0.0
Imagining anaylsis	Adobe	Photoshop CS4
Micro Cover Glasses, Square, No. 1	VWR	48366-067	22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Cover glasses are corrosion-resistant and uniformly thick and flat. No. 1 thickness is 0.13 to 0.17 mm.
Frosted Micro Slides, 1 mm	VWR	48312-003	75 x 25 mm - 1 mm
Parafilm M	Alcan packaging	BRNDPM998
TX2 Filter cube	Leica	11513851/11513885	Filter used for Congo red analysis with a band-pass of 560/40.