Introduction
La parete cellulare vegetale in possesso di una pletora di informazioni nelle sue varie componenti: la lignina, cellulosa, emicellulosa (silano, glucuronoxylan, xyloglucan, arabinoxilano collegamento misto glucano, o glucomannano), e pectina. Tecniche istologiche forniscono importanti indicazioni visive a studiare le differenze all'interno delle pareti cellulari secondarie a livello organizzativo e cellulari. Varie tecniche istologiche sono stati sviluppati e sono disponibili in letteratura, ma queste tecniche può essere difficile e per principianti richiede tempo perché i protocolli molto dettagliate con semplici istruzioni visive sono quasi mai disponibili. L'obiettivo di questo studio è quello di fornire semplici linee guida per tecniche di colorazione istologiche di ottenere immagini di alta qualità.
Sezionare il tessuto stelo è il primo passo nella visualizzazione delle pareti cellulari e forme cellulari. Anche se le sezioni tagliate a mano sono poco costosi e richiedono meno tempo per preparare, l'uso di un vibratome offre coerenza eproduce immagini di alta qualità. Utilizzando una vibratome permette di produrre una migliore qualità dei dati generando anche sezioni con lo stesso spessore, che aiuta a produrre immagini nitide e riduce significativamente il rischio di produrre differenze inesatti tra campioni che deriverebbe semplicemente da una cattiva preparazione del campione. Utilizzando resine di fissare campioni freschi può essere una sfida per principianti e può essere ancora molto tempo, anche per gli esperti quando l'analisi deve essere fatto in fretta. Inoltre, diventa impossibile misurare qualsiasi attività biologica con il campione quando è stato incorporato in una resina. Una semplice tecnica che impiega uno stampo agarosio e fatta in casa è utile per l'incorporamento tessuti dello stelo, e può anche essere utilizzato in altre applicazioni che richiedono dissezione dei tessuti molli. Rispetto al incorporamento esemplari in resina, questo metodo ha il vantaggio di mantenere i tessuti vivi e riducendo la manipolazione dei campioni. Sezionamento dei tessuti attraverso un vibratome è molto preciso e genera homogensezioni unità organizzative, che, a seconda della porta dello studio, possono poi essere utilizzati con diverse tecniche di colorazione diverse.
I metodi più semplici per visualizzare lignina e altri aromatici impiegano raggi ultravioletti (UV). Eccitazione delle molecole aromatiche basate sulla luce UV è una vecchia tecnica, ma è ancora uno dei metodi più veloci per la visualizzazione di lignina. Tuttavia, la visualizzazione UV in realtà non è l'ideale per il rilevamento della lignina, perché la luce UV ecciterà altri aromatici. La lignina è costituito principalmente da tre blocchi, i monolignols (alcoli hydroxycinnamyl: alcool coniferilico, alcol sinapyl, e alcool p-coumaryl) 1-3. Macchia Phloroglucinol può fornire indizi per la misura di cinnamaldehydes presenti nello xilema, fibre e tessuti tracheali 4. Phloroglucinol è un buon indicatore di cinnamaldehydes generali e può distinguere tra cinnamaldehydes e altri composti aromatici. I monomeri alcol sinapyl possono essere rilevatie differenziato dall'uso di macchia Maule. Blu di toluidina O è un colorante policromatico e quindi ha la capacità di macchiare diversi elementi della parete cellulare in diversi colori 5,6. L'uso primario di blu di toluidina O è rilevare pectina e lignina 5,6. Il vantaggio di usare blu di toluidina O è che molti elementi della parete cellulare possono essere visualizzati in un unico passaggio. Sia calcofluor bianco e congo rosso sono facili da lavorare e può essere utilizzato per visualizzare cellulosa. Macchie bianche calcofluor cellulosa, callosio, e altri β-glucani non sostituiti o debolmente sostituiti 6-9, mentre congo macchie rosse direttamente al β-(1 → 4)-glucani e in particolare alla cellulosa 10,11. L'obiettivo di questo studio è fornire semplici linee guida per l'utilizzo delle tecniche di colorazione di cui sopra per ottenere immagini di alta qualità da A. thaliana steli.
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Protocol
1. Stelo Embedding
- Fare una soluzione di agarosio 7% in acqua (7 g di agarosio-grade in 100 ml di acqua distillata). Sciogliere l'agarosio in autoclave per 20 minuti o nell'apparecchiatura a microonde per 20 minuti a più bassa intensità (ad esempio, intensità 10% di un forno a 1.250 watt).
- Preparate uno stampo casalingo per incorporare i gambi con fiale di plastica.
- Utilizzando una lama di rasoio, tagliare il fondo conico di 2 ml con tappo a vite provetta (Parte A). Con una siringa con ago, forare un foro nel tappo della provetta leggermente maggiore del diametro dello stelo da incorporare. Quindi, tagliare 0,5 centimetri dal fondo di un 0,6 ml provetta (Parte B).
- Aggiungere la porzione di 0,5 centimetri cut-off della provetta 0,6 ml nella provetta ml pretagliati 2 microcentrifuga. Sigillare le due parti usando Parafilm (Figura 1). NOTA: La parte inferiore del tubo è tagliato per facilitare la rimozione del campione incorporata dopo l'agarosio si è solidificato. Tegli foro nel tappo sarà di aiuto nel tenere il gambo fisso quando lo stelo è incorporato in agarosio. Lo stampo servirà a tenere l'agarosio e tenere premuto il dritto gambo quando incorporamento. Parafilm terrà le due parti A e B, finché l'agarosio è impostato e lo stelo è incorporato.
- Utilizzando una lama di rasoio, tagliare una sezione stelo dalla zona di interesse, (ad esempio metà del primo internodo stelo). NOTA: Idealmente, lo stelo deve essere tagliato poco prima di incorporamento per evitare la distruzione da disidratazione. In alternativa, lo stelo può essere memorizzato temporaneamente in una piastra contenente una carta da filtro inumidita con acqua. Questa piastra può essere posizionato in ghiaccio fino a essere incorporato per prevenire la disidratazione dei tessuti e deformazione. Memorizzazione lo stelo per periodi più lunghi di 30 minuti senza elevata umidità farà sì che lo stelo si asciughi.
- Sciogliere l'agarosio nel microonde a bassa intensità. ATTENZIONE: il flacone contenente agarosio potrebbe essere calda. Utilizzare un guanto per prendere la bottiglia. Lasciate che i fusi s agarosiotand a temperatura ambiente (tra 20 ° C e 25 ° C) finché non si raffredda a circa 50 ° C.
- Lentamente pipettare 5 ml di agarosio nello stampo plastica premade per riempire la fiala. NOTA: Accertarsi che non ci siano bolle d'aria negli stampi. Le bolle d'aria possono causare lacune nello stampo agarosio e non coprire completamente il campione stelo, che porterà al taglio irregolare delle sezioni campione.
- Lasciare che il agarosio raffreddare per 30-60 secondi per diventare semisolido. Provare con un piccolo stuzzicadenti, facendo in modo che possa penetrare e stare in piedi, ma non galleggiano nel agarosio. NOTA: Se lo stelo è posto quando l'agarosio è ancora caldo danneggerà il campione shriveling stelo, distruggendo la morfologia cellulare.
- Posizionare il gambo in questa fiala agarosio-riempita. Accertarsi che lo stelo rimane diritta. Posizionare il tappo forato in modo tale che la punta dello stelo è tenuta dal tappo. Non ruotare il tappo a vite. A volte più di uno stelo (di un unico tipo) può essere embedded in un singolo flaconcino; ma in quel caso particolare, non utilizzare il tappo. NOTA: Se il tappo a vite è attivata, lo stelo otterrà contorto.
- Lasciare il flaconcino a temperatura ambiente oa 4 ° C per 10-30 minuti, fino a che solidifica.
- Rimuovere lo stampo scorrendo fuori del tubo. Aprire il Parafilm. Spingere la parte inferiore della parte B dello stampo delicatamente con il pollice per liberare l'agarosio solidificato dalla parte A su un vetrino da microscopio in vetro.
- Tagliare il gambo incorporato agarosio in tre parti approssimativamente uguali di 1,2 cm di lunghezza. Ritagliare la parte dello stelo che non era in agarosio e scartarla.
- Conservare questi pezzi di agarosio con incorporato steli in ermetico 2 provette da microcentrifuga ml in una scatola buio a 4 ° C fino al momento di sezione. In alternativa, conservare le provette a 4 ° C per un massimo di una settimana. NOTA: Lo storage è possibile, ma lo sperimentatore deve essere consapevole che il incorporato steli sono ancora vivi e, a seconda dell'esperimento, Artefatti potrebbero potenzialmente essere introdotti.
2. Stelo Sezioni
- ATTENZIONE: Leggere attentamente il manuale vibratome e seguire tutte le istruzioni di sicurezza.
- Assicurarsi che il disco di preparato sia pulita e completamente asciutta (priva di qualsiasi solido o liquido). Pulire il disco campione con una lama di rasoio per rimuovere eventuali residui di colla da esperimenti precedenti e lavare con acqua. Poi asciugare con un tovagliolo di carta. NOTA: Questo farà sì che l'adesivo funziona bene e si lega al modello di agarosio. Se questo passaggio non viene effettuato correttamente, è possibile che il campione non possono aderire al disco e saranno successivamente causare il campione per cadere il disco durante il sezionamento.
- Utilizzare carta morbida salviette per rimuovere l'umidità dal blocco di agarosio contenente i campioni.
- Mettere una piccola goccia di adesivo tessuto sul disco di preparato. Consecutive l'adesivo per coprire la zona al centro della lastra, con la punta del flacone adesivo. Rapidamente postoil blocco di agarosio in modo che i campioni sono o perpendicolari o in parallelo con la piastra per trasversali o longitudinali sezioni, rispettivamente. Lasciare l'adesivo per fissare il campione al disco di preparato a temperatura ambiente oa 4 ° C per 10-30 min. NOTA: Questo è un passo time-sensitive.
- Fissare il disco di preparato in posizione sul vassoio tampone o depressione. I blocchi / s di agarosio con le sezioni devono essere in parallelo con la lama di rasoio. Riempire la vaschetta tampone con acqua distillata a temperatura ambiente fino a quando i campioni sono completamente sommerse.
- Tagliare una lama di rasoio a metà e poi tagliare le estremità con un paio di forbici robuste in modo che la lama rimane completamente piatta. Fissare la metà della lametta pretaglio sul portalama.
- Impostare l'angolo sul portalama a 84 °, la velocità a 0,90 mm / sec (posizione 8 sul vibratome) e la frequenza di 50 Hz (posizione 5 sul vibratome). Tagliare sezioni di spessore 100 micron. Utilizzare la modalità continua. NOTE: Questo spessore è stato scelto per assicurare che il tessuto può sopportare i vari trattamenti di acido e base utilizzati in alcuni dei protocolli di colorazione. Impostare la finestra per il sezionamento e consentire 15-20 min in modo continuo per vibratome sezione un blocco di agarosio di circa 1,2 cm.
- Raccogliere le sezioni utilizzando una pipetta di plastica usa e getta durante il sezionamento nel cassetto buffer. In alternativa, le sezioni possono essere trasferiti dalla vasca del buffer in un bicchiere di vetro e poi ad una piastra Petri chiaro. Trasferire alcune sezioni di tubi microcentrifuga 2,0 ml. Nota: I campioni sono raccolti da una piastra di Petri, perché è più facile vedere le sezioni su un fondo chiaro, e perché la vasca del buffer può essere innescato per i prossimi campione.
- Le sezioni possono essere memorizzati in un tubo da 50 ml o raccolti e conservati in provette da 1,5 a 2 ml microcentrifuga a 4 ° C per 30 a 60 min. NOTA: Memorizzazione delle sezioni per periodi più lunghi si tradurrà in una scarsa qualità dell'immagine.
3. Microscopio e Camera Setting for Imaging
- Regolare l'illuminazione Koehler sul microscopio. Scegli un obiettivo. Concentrarsi sul campione in primo luogo. Portare l'intensità della luce alla metà o inferiore. Chiudere il diaframma di campo (FD) e l'apertura (AP) o portare al valore più basso possibile in quel particolare obiettivo.
- Maggiore è l'ingrandimento, maggiore sarà l'anello. Usare la manopola di messa a fuoco del condensatore a fuoco l'iride dei campi come acutamente possibile.
- Lentamente portare l'immagine del diaframma di campo (piccolo anello a forma di esagono) al centro utilizzando le manopole del condensatore-centraggio (viti a forma di pin che circondano il condensatore). Aumentare lentamente la membrana (FD) tale che il diaframma di campo raggiunge il bordo. Arrestare l'aumento della FD subito dopo il diaframma di campo ha superato il bordo.
- Lentamente aumentare l'apertura (AP) per regolare il contrasto. Regolare l'intensità della luce, come richiesto. NOTA: illuminazione Koehler deve essere adattata per ogni oggettivo, ogni giorno sperimentale. Prendere nota dei numeri ottenuti dopo aggiustamento per la giornata. Questi numeri saranno riutilizzati ogni volta che obiettivi vengono commutati avanti e indietro per quel particolare giorno.
- Regolare l'apertura, l'intensità, tempo di esposizione, guadagno e filtri come descritto nella Tabella 1. Queste informazioni devono essere utilizzate solo come guida.
- Utilizzare una fotocamera digitale ad alta risoluzione con una grande chip CCD formato interline senza otturatore meccanico per catturare le immagini di fluorescenza; e ad alta risoluzione, telecamera ad alta velocità per immagini in campo chiaro.
- Elaborare le diapositive utilizzando software standard. Caricare il software. Fare clic su "Acquisisci" e "Impostare la fotocamera / scheda", quindi selezionare la telecamera da utilizzare. Fare clic su "OK". Clicca su "Acquisisci" seguito da "scheda Colore." Alla voce "scheda Colore," scegliere "metodo Bayer", seguito da "Average quattro". Aggiungi il guadagno suggerito (rosso, verde, blu) from Tabella 1. Selezionare la scheda "Set salva" e fare clic sulla directory in cui le immagini devono essere memorizzati. Impostare "Tempo di esposizione" dalle suggestioni nella Tabella 1. Impostare "categorizzazione" a "1" e "Live binning" a "1". Focus sulla regione di interesse e quindi fare clic su "Salva dal vivo."
- Immagini di uscita sul software della fotocamera sono in formato "TIF". Analizzare le immagini per istochimica dei tipi cellulari. Utilizzare software standard per usi a valle della presentazione e pubblicazione.
4. Ultraviolet and Bright campo Imaging
- Utilizzare una pipetta 1 ml con il taglio punta della pipetta in modo che le sezioni possono essere pipettati facilmente. Delicatamente sezioni pipetta nella punta e su di un vetrino da microscopio. Coprire le sezioni con un vetrino. Osservare le sezioni sotto la luce UV o di illuminazione in campo chiaro.
5. Phloroglucinol-HCl (Wiesner) colorazione 12
- Sciogliere 0.3 g di floroglucinolo in 10 ml di etanolo assoluto per preparare una soluzione floroglucinolo 3%. Mescolare un volume di HCl concentrato (37 N) a due volumi di 3% floroglucinolo in etanolo; questa soluzione è floroglucinolo-HCl (Ph-HCl) o macchia Wiesner. NOTA: Questa soluzione deve essere effettuato fresco il giorno della colorazione e non può essere immagazzinata, perché la soluzione si degrada nel tempo e la colorazione diventa inefficace. ATTENZIONE: HCl è altamente corrosivo, in modo da utilizzare estrema cautela durante la manipolazione la macchia Ph-HCl.
- Trasferimento sezioni staminali per una provetta 2,0 ml microcentrifuga. Aggiungere 1 ml della soluzione Ph-HCl al tubo contenente sezioni e dirla immediatamente perché l'HCl nella macchia Ph-HCl è altamente corrosivo. Spostare delicatamente il tubo per assicurare che tutte le sezioni sono macchiati. Un'alternativa a questa fase è quello di mantenere il tappo tubo aperto in modo che la soluzione Ph-HCl può pipettare su e giù, preferibilmente senza disturbare il seczioni. NOTA: Fare attenzione a non pipettare sezioni nella punta della pipetta, in quanto ciò potrebbe danneggiare quelle sezioni.
- Utilizzare una pipetta 1 ml con il taglio punta della pipetta in modo tale che le sezioni possono essere pipettati fuori facilmente senza danni. Pipettare delicatamente sezioni in punta e su un vetrino da microscopio. Coprire le sezioni con polizza di copertura. Osservare le sezioni sotto illuminazione in campo chiaro. NOTA: La soluzione Ph-HCl asciuga in 5-10 minuti, provocando un deterioramento dei campioni. Pertanto, la rappresentazione deve essere completata entro tale periodo di tempo.
6. Maule colorazione 13,14
- Sciogliere 0.2 g di permanganato di potassio in 40 ml di acqua distillata per preparare una soluzione di permanganato di potassio 0,5%. Conservare in una bottiglia al buio a temperatura ambiente per un massimo di 7 giorni.
- Preparare una soluzione di HCl 3,7% con l'aggiunta di 1 ml di HCl concentrato (37 N) a 9 ml di acqua distillata (1:10). Preparare una soluzione fresca del 3,7% HCl sulgiorno dell'esperimento. Assicurarsi che la soluzione di riserva 37 N HCl utilizzato non è troppo vecchio. Soluzione di idrossido di ammonio concentrato (14,8 M) deve essere conservato a 4 ° C per evitare la molarità della soluzione satura diminuisca.
- Trasferimento sezioni staminali per una provetta 2,0 ml microcentrifuga. Aggiungere 1 ml della soluzione di permanganato di potassio 0,5% per il tubo contenente sezioni.
- Pipettare la soluzione di permanganato di potassio allo 0,5% su e giù delicatamente, preferibilmente senza disturbare le sezioni. Incubare per 2 minuti e ripetere il pipettaggio. Lasciate che la provetta riposare fino a quando tutte le sezioni stabilirsi. NOTA: Fare attenzione a non pipettare sezioni nella punta della pipetta come le sezioni possono essere danneggiati. Può essere difficile vedere le sezioni staminali come la soluzione è scuro, in modo da mantenere il tubo con le sezioni su provetta rack e permettere loro di accontentarsi di 2 min.
- Usando una pipetta 1 ml, tirare fuori 700 ml di 0,5% soluzione di permanganato di potassio.Aggiungere 700 ml di acqua distillata per sciacquare la soluzione di permanganato di potassio. Ripetere 3-4x o fino a quando la soluzione di acqua rimane limpida.
- Eliminata l'acqua. Aggiungere rapidamente 1 ml di 3% HCl finché il colore marrone scuro viene scaricata dalle sezioni. Ciò può avvenire in 3-5 minuti o può richiedere 2 lavaggi di 5 minuti ciascuno. Pipettare su tutta la soluzione HCl 3% e procedere immediatamente alla fase successiva.
- Aggiungere 1 ml di soluzione di idrossido di ammonio concentrato. Utilizzare una pipetta 1 ml con il taglio punta in modo tale che le sezioni possono essere pipettati fuori facilmente senza danni. Pipettare delicatamente sezioni in punta e su un vetrino da microscopio. Coprire le sezioni con un coprioggetto. Osservare le sezioni sotto illuminazione in campo chiaro. ATTENZIONE: Poiché idrossido di ammonio è estremamente corrosivo, richiede cura e attenzione per evitare di causare la corrosione alla fase del microscopio o lente. NOTA: I fumi di idrossido di ammonio possono nebbia del vetrino, che rende difficile osservare il campione. Quindi essere molto attenti prima di aggiungere il vetrino. La soluzione si asciuga in 5-10 minuti, quindi la rappresentazione deve essere completata entro tale periodo di tempo.
7. Congo Red colorazione 11,15
- Sciogliere 0,5 g di rosso Congo in 100 ml di acqua distillata per preparare una soluzione rosso congo 0,5%.
- Trasferimento sezioni staminali per una provetta 2,0 ml microcentrifuga. Aggiungere 1 ml della soluzione rosso congo 0,5% al tubo. Pipettare delicatamente la soluzione rosso congo 0,5% su e giù senza disturbare le sezioni. NOTA: Fare attenzione a non pipettare sezioni nella punta della pipetta come puo 'danneggiare le sezioni.
- Incubare a temperatura ambiente per 10 min e ripetere il pipettaggio. Seguire con un altro 3 min di incubazione a temperatura ambiente.
- Utilizzare una pipetta 1 ml di tirar fuori 700 ml di 0,5% soluzione di rosso congo. Aggiungere 700 ml di acqua distillata per sciacquare la soluzione rosso congo. Ripetere il lavaggio 3-4x finché la soluzione di lavaggioè chiaro.
- Utilizzare una pipetta 1 ml con il suo taglio punta in modo tale che le sezioni possono essere pipettati fuori facilmente senza danni. Pipettare delicatamente sezioni in punta e su un vetrino da microscopio, e coprire con coprioggetto. Osservare i campioni sul vetrino sotto blu-luce di eccitazione usando un filtro con una banda passante di 560/40. NOTA: Non conservare le sezioni in acqua per molto tempo prima dell'analisi microscopica, come l'acqua lavare la congo rosso in 10-30 min.
8. Calcofluor Bianco colorazione 9
- Sciogliere 0,02 g di sbiancante fluorescente 28 (calcofluor bianco M2R) in 10 ml di acqua distillata per preparare una soluzione madre dello 0,2%. La soluzione allo 0,2% può essere conservata per sei mesi in una bottiglia al buio a 4 ° C. Preparare una soluzione di lavoro di 0,02% diluendo la soluzione stock di 0,2% 10x con acqua distillata.
- Trasferimento sezioni staminali per una provetta 2,0 ml microcentrifuga. Aggiungere alla provetta 1 ml di calcof 0,02%Luor soluzione bianco. Pipettare delicatamente la soluzione bianco 0,02% calcofluor su e giù. NOTA: Fare attenzione a non pipettare sezioni nella punta della pipetta come puo 'danneggiare le sezioni.
- Incubare a temperatura ambiente per 5 min e ripetere il pipettaggio. Incubare la sezione per altri 3 minuti a temperatura ambiente. NOTA: Le sezioni di depositarsi sul fondo della provetta per facilitare l'pipettare la soluzione senza danneggiare le sezioni.
- Utilizzare una pipetta 1 ml di tirar fuori 700 ml di soluzione di bianco 0,02% calcofluor e aggiungere 700 ml di acqua distillata; attendere 5 minuti per sciacquare la soluzione bianco calcofluor. Ripetere il lavaggio 3-4x. Utilizzare una pipetta 1 ml con il taglio punta della pipetta in modo che, come le sezioni possono essere pipettati fuori facilmente senza danni.
- Pipettare delicatamente sezioni in punta e su un vetrino da microscopio e coprire con un vetrino. Osservare le sezioni sotto la luce UV.
9. Toluidina Blue O colorazione 16,17
- Sciogliere 0,02 g di blu di toluidina O in 100 ml di acqua distillata per preparare una soluzione 0,02%. NOTA: La soluzione blu toluidina O può essere conservato per due settimane in una bottiglia scura a temperatura ambiente.
- Trasferimento sezioni staminali per una provetta 2,0 ml microcentrifuga. Aggiungere 1 ml di soluzione di blu di toluidina O 0,02% al tubo. Pipettare delicatamente la soluzione di blu O 0,02% toluidina su e giù. Incubare a temperatura ambiente per 5 min e ripetere il pipettaggio volta. NOTA: Fare attenzione a non pipettare sezioni nella punta della pipetta come puo 'danneggiare le sezioni. Lasciate che la provetta si ferma fino a quando le sezioni stabilirsi. Questo può essere difficile da vedere, come la soluzione è scuro, in modo da mantenere il tubo contenente sezioni di provetta rack e permettere loro di accontentarsi di 2 minuti a temperatura ambiente.
- Utilizzare una pipetta 1 ml di tirar fuori 700 ml di soluzione di blu O 0,02% toluidina. Aggiungere 700 ml di acqua distillata per sciacquare il blu di toluidina O solution. Ripetere 3-4x o fino a quando la soluzione di lavaggio è chiaro. Utilizzare una pipetta 1 ml con il taglio punta della pipetta in modo tale che le sezioni possono essere pipettati fuori facilmente senza danneggiarli.
- Pipettare delicatamente sezioni in punta e su un vetrino da microscopio e coprire con un vetrino. Osservare le sezioni sotto illuminazione in campo chiaro.
- Regolare l'illuminazione Koehler sul microscopio. Scegli un obiettivo. Concentrarsi sul campione in primo luogo. Portare l'intensità della luce alla metà o inferiore. Chiudere il diaframma di campo (FD) e l'apertura (AP) o portare al valore più basso possibile in quel particolare obiettivo.
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Representative Results
Stem Embedding e Sezioni:
L'uso dello stampo plastica casalingo per incorporare gli steli in 7% agarosio rivelata facile e veloce (Figura 1). Le due parti (A e B; la figura 1) del sistema flaconcino incorporato rendono semplice per rilasciare facilmente stelo incorporato in agarosio come l'agarosio non si attacca alle parti fiala che sono inerti, mantenendo il sistema pulito. Le fiale possono essere riutilizzati più volte per anni. La comodità di memorizzare stelo incorporato rende anche più facile i prossimi passi. Al fine di salvare qualche volta, simile incorporato steli possono essere raggruppati (fino a 3) su un singolo piatto sezionamento per il sezionamento.
Osservazione di Aromatics Under UV:
Le sezioni staminali sono state montate in acqua distillata ai vetrini ed osservati sotto luce UV. I composti aromatici, compresa la lignina nelle cellule, possono essere visualizzati dal loro autofluorescenza sotto luce UV. Xylem (Xy) e le fibre interfascicolare (Fi)mostrato autofluorescenza sotto illuminazione UV ma non in midollo (Pi) e corteccia o epidermide (EP) (Figura 2), perché lignina, un polimero aromatico, viene depositato durante secondario biosintesi della parete cellulare. In alcuni casi, quando le piante accumulano notevoli quantità di aromatici nei loro vacuoli (ad esempio, antociani), fluorescenza può essere osservata in cellule corticali (dati non mostrati). Staminali sezioni sono state analizzate sotto 5X, 10X, 20X, 40X e ingrandimento (Figura 2 pannelli A, B, C, e D - E, rispettivamente) per visualizzare meglio parete cellulare distribuzione aromatico attraverso lo stelo.
Osservazione della lignina nelle sezioni staminali colorate con Phloroglucinol e Maule Stains:
La xylem composta da navi e fibre e fibre interfascicolare erano gli unici elementi del fusto che sono stati macchiati dalle macchie lignina (floroglucinolo e il Maule) Utilizzando un tipo selvaggio campione sezione staminali. Macchia Phloroglucinol reagisce con cinnamaldeide gruppi terminali di lignina per dare un colore fucsia 4 rosa o (Figura 3). Come osservato sotto illuminazione UV, una colorazione fucsia si osserva nelle fibre dello xilema e interfascicolare ma è assente nel midollo e corteccia o epidermide (Figura 3). Staminali sezioni sono state analizzate sotto 5X, 10X, 20X, 40X e ingrandimento (Figura 3 pannelli A, B, C, e D - E, rispettivamente) per visualizzare meglio distribuzione macchia floroglucinolo attraverso lo stelo e differenziare i principali tessuti; xilema e fibre interfascicolare; midollo e la corteccia; e dell'epidermide. Solitamente l'intensità del colore è correlata con il livello di lignificazione in maniera qualitativa - tranne quando il mutante o transgenico analizzato è anormalmente arricchiti in unità Cinnamaldeide-derivato (per es cad mutanti) <sup> 14. La macchia Maule è specifico per individuare le unità lignina syringyl in xylem e fibre interfascicolare. Colorazione rossa indica la presenza di unità lignina syringyl negli elementi lignina (Figura 4) 18. Tuttavia, una brillante colorazione rossa si osserva nelle fibre rispetto ai tessuti xilema che suggerisce che le fibre contengono un livello superiore di S lignina che lo xilema è più arricchito in unità G. Come osservato dopo floroglucinolo colorazione, una colorazione rosso si osserva nelle fibre dello xilema e interfascicolare ma è assente nel midollo e corteccia o epidermide (Figura 4). Inoltre correla con la distribuzione lignina osservata sotto UV (Figura 2) e mostra che le unità syringyl sono presenti in ogni tessuto lignificato di questo campione di tronco. Staminali sezioni sono state analizzate sotto 5X, 10X, 20X, 40X e ingrandimento (Figura 2 pannelli A, B, C, eD - E, rispettivamente) per visualizzare meglio la distribuzione macchia Maule in tutto il gambo e differenziare le principali tessuti: fibre xilema e interfascicolare, midollo e corteccia, e dell'epidermide. È importante notare che la quantità e la distribuzione delle unità syringyl tra tessuti lignificati variano con l'età dello stelo e possono essere assenti in un giovane fusto (dati non mostrati).
Osservazione delle sezioni staminali colorate con Calcofluor bianco e rosso Congo Stains:
Macchie bianche calcofluor cellulosa, callosio, e altri β-glucani non sostituito o debolmente sostituiti; considerando che congo macchie rosse direttamente al β-(1 → 4)-glucani e in particolare per la cellulosa. Sezioni staminali colorate con calcofluor bianco sono stati osservati sotto la luce UV 6-9. Sezioni macchiate di rosso Congo stati osservati sotto eccitazione blu-luce utilizzando un filtro con una banda passante di 560/40. Sia calcofluor bianco e rosso Congo macchiato l'epidermide, la corteccia e midollo; thè è perché tutti questi tessuti contengono cellulosa come principale polimero polisaccaridico nelle loro pareti cellulari (Figura 5 e Figura 6, rispettivamente). In contrasto calcofluor bianco, rosso congo polisaccaridi macchiati meglio nello xilema e fibre interfascicolare e sembra meno interessato dalla presenza di lignina (Figura 5 e Figura 6) 10,11. Staminali sezioni sono state analizzate sotto 5X, 10X, 20X, 40X e ingrandimento (pannelli A, B, C, e DE, rispettivamente, delle figure 5 e 6) per visualizzare meglio calcofluor distribuzioni macchia rosso bianco e Congo attraverso lo stelo e la maggiore tessuti (xilema e fibre interfascicolare, midollo e corteccia, ed epidermide).
Osservazione delle sezioni staminali colorate con blu di toluidina O:
Blu di toluidina O è classificato come un colorante policromatico perché reagisce con diversi componenti chimici delle cellule in modo diverso e sono risultati inun campione multicolore (Figura 7). I colori generati possono fornire informazioni sulla natura della cellula e le sue pareti. Blu di toluidina O è un colorante cationico che si lega a carica negativa gruppi 5. Una soluzione acquosa di questo colorante è blu, ma diversi colori vengono generati quando il colorante si lega con diversi gruppi anionici del 6,9 cellula. Ad esempio, un colore viola rosato apparirà quando il colorante reagisce con polisaccaridi carbossilati quali acido pectiche; verde, blu verdastro o blu luminoso con sostanze poliaromatici come lignina e tannini; e violaceo o blu verdastro con acidi nucleici. Blu di toluidina O di staminali sezioni rivelato che le fibre dello xilema e interfascicolare sono lignificati in quanto mostrano una colorazione verde blu o blu (Figura 7, pannello C), che è in accordo con l'UV e le osservazioni colorazione Ph-HCl (figure 2 e 3). In contrasto, il midollo e corteccia e epidermide tessuti mostrano verdastro colorazione blu o blu perché, anche se non sono lignificati, contengono alcuni polimeri pectina nelle loro pareti cellulari. Staminali sezioni sono state analizzate sotto 5X, 10X, 20X, 40X e ingrandimento (Figura 7 pannelli A, B, C, e D - E, rispettivamente) per visualizzare meglio blu toluidina O distribuzione macchia attraverso lo stelo e di differenziare i principali tessuti .
. Figura 1 stampo casalingo per incorporare i gambi Sul lato sinistro.; parte superiore del tappo a vite provetta 2 ml microcentrifuga (parte A) e il fondo dal 0,6 ml provetta (Parte B). Sul lato destro; il Parafilm tenendo le due parti; A e B per formare lo stampo finale.
Figura 2. Fluorescenza UV di A. staminali thaliana sezioni. sezioni trasversali di tipo selvatico A. thaliana stelo fluorescenza sotto luce UV che mostra la presenza di composti aromatici, compresi lignina, solo nelle pareti delle fibre interfascicolare e cellule dello xilema (A - E). Sono indicate le posizioni delle epidermide e corteccia (PE), fibre interfascicolare (FI) midollo (Pi) e xilema (XY). Ingrandimenti: Pannello A: 5X; Panel B: 10X; Panel C: 20X; Pannelli D ed E: 40X. Bar = 100 pm.
Figura 3. Phloroglucinol-HCl colorazione di A. staminali thaliana sezioni. Phloroglucinol-HCl colorazione (colore rosa o fucsia) di un tipo selvatico A. sezione stelo thaliana mostra la normale deposizione lignina nelle pareti delle fibre interfascicolare e cellule dello xilema (A - E). Sono indicate le posizioni delle epidermide e corteccia (PE), fibre interfascicolare (FI) midollo (Pi) e xilema (XY). Ingrandimenti: Pannello A: 5X; Panel B: 10X; Panel C: 20X; Pannelli D ed E: 40X. Bar = 100 pm.
Figura 4. Maule colorazione di A. staminali thaliana sezioni. Maule colorazione (colore rosso) di un tipo selvatico A. thaliana </ Em> sezione staminali mostra la normale deposizione di lignina nelle pareti delle fibre interfascicolare e cellule dello xilema (A - E). Sono indicate le posizioni delle epidermide e corteccia (PE), fibre interfascicolare (FI) midollo (Pi) e xilema (XY). Ingrandimenti: Pannello A: 5X; Panel B: 10X; Panel C: 20X; Pannelli D ed E: 40X. Bar = 100 pm.
Figura 5. Calcofluor colorazione bianco di A. staminali thaliana sezioni. Calcofluor bianco colorazione di una wild type A. sezione gambo thaliana mostra deposizione di cellulosa nelle pareti cellulari delle cellule dell'epidermide, corteccia, midollo, fibre interfascicolare e xilema (A - E). Il positions dell'epidermide e la corteccia (Ep), sono indicati fibre interfascicolare (Fi), midollo (Pi) e xilema (XY). Ingrandimenti: Pannello A: 5X; Panel B: 10X; Panel C: 20X; Pannelli D ed E: 40X. Bar = 100 pm.
Figura 6. Colorazione rosso Congo di A. stelo thaliana sezioni. Congo colorazione rossa di tipo selvaggio A. sezione gambo thaliana mostra deposizione di cellulosa nelle pareti cellulari delle cellule dell'epidermide, corteccia, midollo, fibre interfascicolare e xilema (A - E). Sono indicate le posizioni delle epidermide e corteccia (PE), fibre interfascicolare (FI) midollo (Pi) e xilema (XY). Ingrandimenti: Pannello A: 5X; Panel B Panel C: 20X; Pannelli D ed E: 40X. Bar = 100 pm.
Figura 7. Toluidina blu O colorazione di A. staminali thaliana sezioni. toluidina blu O colorazione di una wild type A. sezione stelo thaliana mostra la normale deposizione lignina nelle pareti delle fibre interfascicolare e cellule dello xilema (A - E). Sono indicate le posizioni delle epidermide e corteccia (PE), fibre interfascicolare (FI) midollo (Pi) e xilema (XY). Ingrandimenti: Pannello A: 5X; Panel B: 10X; Panel C: 20X; Pannelli D ed E: 40X. Bar = 100 pm.
Tabella 1. Microscopio e le impostazioni della fotocamera per l'imaging. Linee guida per l'utilizzo di filtri di fluorescenza e di imaging in campo chiaro. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Sezioni di gambo A. thaliana sono ampiamente utilizzati per studiare l'organizzazione delle cellule nella parete cellulare secondaria e di esaminare qualitativamente le differenze tra wild type e piante transgeniche. Le tecniche comunemente utilizzate per sezionare i campioni sono di taglio diretto a mano; o quando i campioni sono incorporati in agarosio o fissativo, sezionamento può essere fatto con un vibratomo o microtomo. In contrasto con il taglio manuale, gli ultimi due permettono riducendo il rischio di produrre differenze inesatti tra campioni che sarebbero causate semplicemente da una preparazione del campione cattivo causato da differenze di spessore tra campioni e superfici irregolari. Tutti questi metodi hanno i loro pro e contro. Abbiamo scelto l'incorporamento in agarosio, seguita da sezionando utilizzando un vibratome, e ha fatto così per i seguenti motivi: la facilità di incorporamento e il tempo trascorso nell'utilizzo agarosio elimina la necessità di elaborare lavorazione di tessuto fresco. Inoltre, i nostri stampi fatti in casa sono facili ed economici da fare, può contenere the stelo dritto, può essere usato per molti anni, e può aiutare a facile rilascio di esemplari senza fare danni. Il modo migliore per sciogliere alta percentuale di agarosio e ottenere una soluzione omogenea (completa dissoluzione di 7 g di agarosio in 100 ml senza formare granuli grosso) è quello di autoclave o al microonde che alla più bassa intensità. E 'importante tagliare il tessuto gambo fresco, o in alternativa per memorizzare in un piatto posto su ghiaccio contenente un filtro di carta bagnato con acqua per prevenire la disidratazione dei tessuti e deformazione. Memorizzazione lo stelo per periodi più lunghi di 30 minuti senza elevata umidità farà sì che lo stelo si asciughi. La temperatura del agarosio destra prima del gambo è incorporato dovrebbe essere di circa 50 ° C. È indispensabile verificare la presenza di bolle d'aria dopo l'agarosio è stato versato nel flaconcino, perché le bolle d'aria causano lacune nello stampo e conseguentemente il sezionamento sarà irregolare. Le bolle d'aria possono essere rimossi rapidamente ponendo la soluzione sotto vuoto prima colataesso. Lo stelo deve essere posto in agarosio quando è ancora morbido e non più calda di 50 ° C. Il calore può danneggiare il campione shriveling stelo e distruggerà la morfologia cellulare. Se l'agarosio è troppo freddo lo stelo non penetra attraverso l'agarosio e l'incorporamento non sarà possibile. Dopo incorporamento agarosio, campioni staminali possono essere conservati a 4 ° C fino ad una settimana.
L'uso di un vibratome invece di rendimenti a sezionamento mano tagliata con precisione i campioni e una migliore qualità dell'immagine. Tutte le istruzioni di sicurezza devono essere attentamente lette e seguite durante l'utilizzo di un vibratome. È importante assicurare che il disco di preparato sia pulita e asciutta per permettere al tessuto adesivo per tenere il campione fortemente in posizione in modo che non si stacchi durante il sezionamento. Lo spessore dei provini è specificato per sopportare l'acido duro e trattamenti di base durante procedure di colorazione. La lametta usata nel vibratome dovrebbe essere completamente piana per assicurare che la sezione è tagliato evenly. Sezioni richiede circa 20 minuti per campione; al fine di risparmiare tempo, esemplari simili possono essere sezionati in gruppi su un piatto singolo esemplare. Durante sezionamento, le sezioni sono trasferiti dalla vasca del buffer in una piccola capsula di Petri per rendere le sezioni più facile vedere su uno sfondo chiaro e liberare la vasca del buffer per i prossimi campione. Le sezioni possono essere utilizzati immediatamente per le procedure di colorazione a valle o conservati per un uso successivo. Aliquotando sezioni staminali per 2,0 ml provette da microcentrifuga aiuta nella innesco per le procedure di colorazione. Effettuare le regolazioni e le impostazioni corrette sulla fotocamera e del microscopio sono molto critico per il raggiungimento immagini di alta qualità. Regolazione dell'illuminazione Kohler è uno dei passi più importanti nell'uso del microscopio. Le regolazioni di diaframma e l'intensità della luce, come descritto nella sezione Metodi, servono solo come linea guida. Essi possono avere bisogno di essere modificati a seconda della microscopio e telecamera utilizzata. Abbiamo usato un alta risoluzionefotocamera digitale con un chip grande formato interlinea CCD e non otturatore meccanico per l'imaging UV, calcofluor bianco e colorazione rosso Congo; e una fotocamera ad alta risoluzione e colori ad alta velocità per le immagini in campo chiaro Maule, floroglucinolo e blu di toluidina O colorazione. Le immagini sono state analizzate, elaborate e assemblate utilizzando software di imaging standard.
Phloroglucinol è la macchia più comunemente usato per la determinazione della lignina; non è un vero macchia lignina come colora solo Cinnamaldeide gruppi terminali. La macchia floroglucinolo, noto anche come macchia Weisner, produce una caratteristica rosa ciliegio o fucsia nello xilema e fibre interfascicolare cui sono presenti 4 questi gruppi aldeidici. L'intensità del colore rosa varia con il grado di lignificazione. Sebbene sottili differenze sono più difficili da osservare, è facile individuare differenze tra wild type e sezioni staminali mutanti che hanno variazioni nella loro contenuto di lignina 19. E 'anche easy osservare le differenze tra giovani (verso l'apice dello stelo) e più anziani (radice di base) i tessuti, perché i livelli di lignificazione tra tali tessuti vari. Di solito in di tipo selvatico stelo, corteccia e midollo epidermide non contengono cinnamaldehydes (quindi non fatevi colorato) a meno che vi sia lignificazione ectopica 20. Macchia Maule, d'altra parte, è specifico verso unità lignina syringyl e può essere utilizzata per differenziare diversi arricchimenti lignina in unità S o G (ad esempio fibre contro tessuti xilema) 14,18. Il permanganato di potassio e acido cloridrico agire sul nucleo syringyl dell'unità S nella lignina per formare un methoxycatechol e poi a metossi-o-chinone seguente reazione con idrossido di ammonio. La macchia Maule è un buon indicatore per differenziare i mutanti che mancano o sono ampiamente esauriti in unità S di lignina (ad esempio in A. thaliana mutanti F5H e impianti generali gimnosperme), Maule dà giallo-marrone colorazione instead di rosso sia nel xilema e il sclerenchima 21. Per lo stesso motivo, Maule colorazione può essere utilizzata per differenziare angiosperme, che contengono principalmente S lignina da gimnosperme che in genere non l'unità S 18. Poiché l'acido forte e base sono utilizzati, rispettivamente, durante floroglucinolo e procedure di colorazione Maule, alcune misure sperimentali devono essere eseguite con cautela. Sia HCl concentrato e idrossido di ammonio sono corrosivi forti; possono deteriorare il palco microscopio e lente se le diapositive contenenti i campioni colorati Ph-HCl e Maule non vengono gestiti correttamente. Possono anche asciugare rapidamente, entro 5-10 minuti, causando campioni a deteriorarsi, così la rappresentazione deve essere fatto rapidamente. Blu di toluidina O è una macchia policromatica e macchie diverse componenti della parete cellulare in diversi colori in quanto reagisce con diversi componenti chimici di pareti cellulari differente, producendo un campione multicolore. I colori generati possono provide informazioni sulla natura della cella. Blu di toluidina O è anche un colorante cationico che si lega a carica negativa gruppi 5,6. Una soluzione acquosa di questo colorante è blu, ma diversi colori vengono generati quando il colorante si lega con diversi gruppi anionici nella cella. Ad esempio, i colori sono un viola rosato quando il colorante reagisce con polisaccaridi carbossilati quali pectina; verde, blu verdastro o blu luminoso con sostanze aromatiche come la lignina e tannini; e violaceo o blu verdastro con acidi nucleici. La colorazione è facile e può durare per due giorni.
Calcofluor macchie bianche di cellulosa, callosio, e di altri β-glucani non sostituito o debolmente sostituiti 6-9, e in Congo macchie rosse direttamente al β-(1 → 4)-glucani e in particolare alla cellulosa 8,10,11. Calcofluor macchie bianche brillantemente l'epidermide, la corteccia e midollo ma quella brillantezza è notevolmente ridotto in xylem e fibre interfascicolare. Ci sono due pspiegazioni OSSIBILI per la fluorescenza ridotto di bianco calcofluor nei tessuti fortemente lignificate; si attribuisce alla presenza di lignina, che, a sua volta ridurre la capacità di bianco calcofluor diffondere correttamente attraverso i polisaccaridi. Un secondo punti di spiegazione per un quenching parziale della fluorescenza emessa dal calcofluor bianco eccitato sotto UV. In contrasto con calcofluor bianco, colorazione rosso Congo sembra meno interessata dalla presenza di lignina. Potrebbe essere correlato alla differenza di proprietà di fluorescenza tra calcofluor bianco e rosso congo; una capacità migliore diffusione di rosso Congo attraverso i tessuti lignificati che calcofluor bianco; o una leggera differenza di polisaccaridi proprietà leganti 22. È importante notare che le sezioni colorate con rosso Congo non devono essere conservate troppo a lungo prima di imaging, perché Rosso Congo tende ad lavato via con acqua.
Sebbene colorazione istochimica è né quantitativané assolutamente determinante, essa può rivelare attraverso segnali visivi una ricchezza di informazioni sulle caratteristiche importanti come l'integrità dei tessuti o anormale deposizione parete cellulare e lignificazione. Le tecniche di colorazione sopra descritte sono di facile esecuzione e sono applicabili per elementi critici in una parete cellulare, come lignina e cellulosa. Per contro, è necessaria immunofluorescenza usando antisieri specifici e anticorpi monoclonali per il rilevamento dei vari componenti della emicellulosa e pectina. La presente relazione è pensato per servire come primer per principianti nel campo della secondaria colorazione parete cellulare che usano A. thaliana come sistema modello.
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Acknowledgments
Siamo grati a Sabin Russell per l'assistenza editing. Questo lavoro è stato parte del DOE Joint BioEnergy Institute (http://www.jbei.org), sostenuto dal Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti, Office of Science, Ufficio di Ricerca Biologica e Ambientale, attraverso il contratto di DE-AC02-05CH11231 tra il Lawrence Berkeley National Laboratory e il Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | EMD | MERC2125 | CAS Number: 9012-36-6 |
| Phloroglucinol | Sigma | P 3502 | 1,3,5-trihydroxybenzene [CAS Number: 108-73-6] |
| Hydrochloric acid | EMD | HX0603-75 | CAS Number: 7647-01-0 |
| Ammonium hydroxide | EMD | AX1303-6 | CAS Number: 1336-21-6 |
| Toulidine Blue O | Sigma | T3260 | Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS Number 92-31-9] |
| Potassium permanganate | Sigma | 223468 | CAS Number 7722-64-7 |
| Ethanol 190 proof | KOPTEC | V1401 | CAS Number: 64-17-5 |
| Congo Red | Sigma | C6277 | Disodium 3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalene 1-sulphonate) [CAS Number 573-58-0] |
| Fluorescent Brightener 28/ Calcofluor White Stain | Sigma | F3543 | 4,4'-Bis[[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2'-disulphonic acid [CAS Number 4404-43-7] |
| Vibratome | Leica | Leica Vibrating blade microtome VT1000S | http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/ |
| Razor | American Safety razor company | Item # 60-0139-0000 | Stainless Steel Double Edge Blade (Personna Super) |
| Screw Cap Microcentrifuge Tubes (2 ml) | VWR | 16466-044 | |
| Microcentrifuge Tubes (0.6 ml) | Axygen Scientific | MCT-060-C | |
| Mitt | Bel-Art | 380000000 | SCIENCEWARE Hot Hand Protector Mitt |
| Tissue adhesive | Ted Pella Inc | 10033 | Store at 4 °C or 20 °C for 3 months or longer storage |
| Microwave | Panasonic | NN-SD762S | PELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive |
| Camera with CCD chip with no mechanical shutter | Hamamatsu | C4742-95 | |
| High speed color camera | QImaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Camera software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.0.0 | |
| Imagining anaylsis | Adobe | Photoshop CS4 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-067 | 22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Cover glasses are corrosion-resistant and uniformly thick and flat. No. 1 thickness is 0.13 to 0.17 mm. |
| Frosted Micro Slides, 1 mm | VWR | 48312-003 | 75 x 25 mm - 1 mm |
| Parafilm M | Alcan packaging | BRNDPM998 | |
| TX2 Filter cube | Leica | 11513851/11513885 | Filter used for Congo red analysis with a band-pass of 560/40. |
References
- Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).
- Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. Lignin biosynthesis and structure. Plant physiology. 153, 895-905 (2010).
- Humphreys, J. M., Chapple, C. Rewriting the lignin roadmap. Current opinion in plant biology. 5, 224-229 (2002).
- Adler, E. Lignin chemistry—past, present and future. Wood Sci. Technol. 11, 169-218 (1977).
- Brien, T. P., Feder, N., McCully, M. E. Polychromatic Staining of Plant Cell Walls by Toluidine Blue. 59, 368-373 (1964).
- Mori, B., Bellani, L. M. Differential staining for cellulosic and modified plant cell walls. Biotechnic & histochemistry: official publication of the Biological Stain Commission. 71, 71-72 (1996).
- Maeda, H., Ishida, N. Specificity of binding of hexopyranosyl polysaccharides with fluorescent brightener. Journal of biochemistry. 62, 276-278 (1967).
- Wood, P. J. Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides. Carbohydrate Research. 85, 271-287 (1980).
- Hughes, J., McCully, M. E. The use of an optical brightener in the study of plant structure. Stain technology. 50, 319-329 (1975).
- Verbelen, J. P., Kerstens, S. Polarization confocal microscopy and congo red fluorescence: a simple and rapid method to determine the mean cellulose fibril orientation in plants. Journal of microscopy. 198, 101-107 (2000).
- Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. Real-time imaging of cellulose reorientation during cell wall expansion in Arabidopsis roots. Plant physiology. 152, 787-796 (2010).
- Liljegren, S. Phloroglucinol Stain for Lignin. Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
- Nakano, J., Meshitsuka, G., lin, S., Dence, C. The Detection of Lignin Methods in Lignin Chemistry. , Springer-Verlag. Berlin. (1992).
- Sibout, R., et al. CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE-C and -D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem of Arabidopsis. The Plant cell. 17, 2059-2076 (2005).
- Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Applied and environmental microbiology. 43, 777-780 (1982).
- Yeung, E. A beginner's guide to the study of plant structure. Proceedings of the 19th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE. 19, 365-36 (1998).
- Turner, S. R., Somerville, C. R. Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall). The Plant Cell Online. 9, 689-701 (1997).
- Iiyama, K., Pant, R. The mechanism of the Mäule colour reaction. Introduction of methylated syringyl nuclei into softwood lignin. Wood Sci. Technol. 22, 167-175 (1988).
- Yang, F., et al. Engineering secondary cell wall deposition in plants. Plant biotechnology journal. 11, 325-335 (2013).
- Zhong, R., Ripperger, A., Ye, Z. H. Ectopic deposition of lignin in the pith of stems of two Arabidopsis mutants. Plant physiology. 123, 59-70 (2000).
- Chapple, C. C., Vogt, T., Ellis, B. E., Somerville, C. R. An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway. The Plant cell. 4, 1413-1424 (1992).
- Fagard, M., et al. PROCUSTE1 Encodes a Cellulose Synthase Required for Normal Cell Elongation Specifically in Roots and Dark-Grown Hypocotyls of Arabidopsis. The Plant Cell Online. 12, 2409-2423 (2000).
