Introduction
식물 세포의 벽은 다양한 구성 요소 내에서 정보의 과다 보유 : 리그닌, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 (크 실란, glucuronoxylan, 크 실로 글루칸, 아라비, 혼합 결합 글루칸, 또는 글루코), 펙틴을. 조직 학적 기술 조직 및 세포 수준에서 보조 세포 벽 내의 차이를 연구하는 중요한 시각적 단서를 제공한다. 다양한 조직 학적 방법이 개발되었고, 문헌에서 발견 될 수 있지만, 단순한 시각적 지시 매우 상세한 프로토콜이 드물게 이제까지 가능한 경우 없기 때문에 이러한 기술은 어렵고 시간 소모적 초보자 수있다. 본 연구의 목적은 높은 품질의 이미지를 얻기 위해 조직 학적 염색 기법에 대한 간단한 지침을 제공하는 것이다.
줄기 조직을 구획하는 셀 벽 및 셀의 셰이프 시각화하는 첫 번째 단계이다. 손으로 자른 부분이 저렴하고 준비하는 시간을 줄이고 있지만, vibratome의 사용은 일관성을 제공하며,고품질 이미지를 산출한다. vibratome를 사용하여 선명한 이미지를 생성하는 데 도움이 상당히 간단 나쁜 시료 준비에 의해 야기 될 샘플 간의 부정확 차이 제조 위험을 줄여 동일한 두께, 심지어 섹션을 생성함으로써 더 나은 데이터 품질을 생산한다. 신선한 표본을 해결하기 위해 수지를 사용하여 초보자를위한 도전이 될 수 있으며, 분석을 신속하게 수행 할 필요가있는 경우에도 여전히 전문가를위한 시간이 오래 걸릴 수 있습니다. 또,이 수지에 포함되었을 때 샘플로 생물학적 활성을 측정하는 것이 불가능해진다. 아가 로스 및 제 금형을 채용 한 간단한 기술은 줄기 조직을 매립 명이이며 또한 부드러운 조직의 절개가 필요한 다른 애플리케이션에 이용 될 수있다. 수지 시험편을 매립에 비해,이 방법은 살아있는 조직을 유지하는 샘플 조작을 감소시키는 이점을 갖는다. vibratome를 통해 조직을 단면은 고정밀 및 homogen를 생성연구의 목적에 따라, 다음 여러 다른 염색 기술과 함께 사용될 수 있으며, OU를 섹션.
리그닌과 다른 방향족 화합물을 시각화하는 가장 간단한 방법은 자외선 (UV) 빛을 사용합니다. UV 빛에 의해 방향족 기반 분자의 여기 오래된 기술이지만, 그것은 여전히 리그닌의 시각화를위한 가장 빠른 방법 중 하나입니다. UV 빛은 다른 방향족 화합물을 자극하기 때문에 그러나, UV 시각화 실제로 리그닌 탐지에 적합하지 않습니다. 1-3 : 리그닌은 주로 세 가지 빌딩 블록, monolignols (coniferyl 알코올, sinapyl 알코올, 및 p-coumaryl 알코올 hydroxycinnamyl 알코올)로 구성되어 있습니다. 플로로 글 루시놀 얼룩 통, 섬유 및 기관의 조직 4에 존재 cinnamaldehydes의 범위에 단서를 제공 할 수 있습니다. 플로로 글 루시놀 일반 cinnamaldehydes의 좋은 지표이며 cinnamaldehydes 및 기타 방향족 화합물을 구별 할 수 있습니다. sinapyl 알코올 단량체를 검출 할 수있다및 마 울레 얼룩의 사용으로 차별화. 톨루이딘 블루 O는 다색 염료이며, 따라서 다른 색 5,6에 칸막이 벽의 다른 요소를 더럽힐 수있는 능력을 갖는다. 톨루이딘 블루 O의 주된 용도는 펙틴 및 리그닌 5,6를 검출하는 것이다. 톨루이딘 블루 O를 사용하는 장점은 세포벽의 많은 요소가 단일 단계로 시각화 할 수 있다는 것이다. 흰색 calcofluor 및 콩고 레드 모두 함께 작동하기 쉽고 셀룰로오스를 시각화 할 수있다. Calcofluor 흰색 얼룩 셀룰로오스, callose 및 기타 비 치환 또는 약하게 치환 된 β-글루칸 6-9, 콩고 붉은 얼룩은 직접 특히 10,11-β (1 → 4) - 글루칸과 셀룰로오스 할 수있는 반면. 본 연구의 목표는 A.에서 높은 품질의 이미지를 얻기 위해 상기 염색 기법의 사용을 위해 단순한 지침을 제공하는 것이다 장대 줄기.
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Protocol
1. 임베딩에게 줄기
- 물에 7 % 아가로 오스 용액 (증류수 100 ㎖에 전기 수준의 아가로 오스 7 g)을 확인합니다. 20 분간 고압 증기 멸균 또는 낮은 강도 (1,250 와트 전자의 예를 들면, 10 % 강도)에서 20 분 동안 레인지 작동하여 아가 로스를 녹여.
- 플라스틱 병을 사용하여 줄기 삽입을 위해 만든 금형을 준비합니다.
- 면도날을 사용하여, 2 ㎖ 스크류 캡 microcentrifuge 관 (파트 A)의 원뿔 바닥을 잘라. 주사기 바늘로, 임베드하도록 스템의 직경보다 약간 큰 튜브 캡에 구멍을 천공. 다음으로, 0.6 ML의 microcentrifuge 관 (파트 B)의 아래쪽에서 0.5 cm를 잘라.
- 미리 절단 2 ㎖의 마이크로 원심 분리 튜브에 0.6 ㎖의 마이크로 원심 튜브의 컷오프 0.5 cm 부를 추가. 파라 필름 (그림 1)를 사용하여 두 부분을 밀봉합니다. 주 : 튜브의 하단은 아가로 오스가 고형화 된 후에 매립 샘플의 제거를 용이하게 절단된다. 티그는 모자에 구멍이 줄기는 아가로 오스에 포함되는 경우 줄기가 안정적으로 유지에 도움이됩니다. 형은 아가 로스를 잡고 삽입 할 때 줄기를 똑바로 유지하는 역할을합니다. 아가로 오스가 설정과 줄기가 삽입 될 때까지 파라 필름은 두 부분, 및 B를 보유 할 것이다.
- 면도날을 사용하여, 관심 영역 (제 줄기 절간의 예 중간)에서 줄기 부분을 절단. 참고 : 이상적으로, 줄기는 단지 탈수에 의해 파괴를 방지하기 위해 삽입하기 전에 차단해야합니다. 대안 적으로, 스템은 일시적 물로 적신 여과지를 함유하는 플레이트에 저장 될 수있다. 이 판은 조직의 탈수 및 변형을 방지하기 위해 삽입 될 준비가 될 때까지 얼음에 배치 할 수 있습니다. 높은 습기없이 30 분 이상 기간에 대한 줄기를 저장하면 줄기가 건조하게됩니다.
- 낮은 강도에서 전자 레인지에 아가로 오스를 용융. 주의 : 아가 포함하는 병이 뜨거워 질 수 있습니다. 병을 데리러 미트를 사용합니다. 용융 아가로 오스의에게하자(20 ° C와 25 ° C 사이) 실온에서 TAND은 약 50 ° C로 냉각 될 때까지
- 천천히 병을 채우기 위해 미리 만들어진 플라스틱 금형에 아가로 오스의 5 mL를 피펫. 참고 : 확인 금형에 기포가 없는지 확인하십시오. 기포는 아가로 오스 금형의 격차가 발생하고 완전히 결국 샘플 섹션의 고르지 절단으로 이어질 것입니다 줄기 샘플을 커버하지 않습니다.
- 아가로 오스가 반고체이 될 30 ~ 60 초 동안 식혀 보자. 그것은 침투와 아가로 오스, 떠 서서,하지만 할 수 있는지 확인하고, 작은 이쑤시개로 테스트합니다. 참고 : 아가로 오스는 세포의 형태를 파괴하고, 줄기를 쇠퇴 해하여 샘플을 손상됩니다 뜨거울 때 줄기가 배치됩니다.
- 이 아가로 채워진 유리 병에 줄기를 놓습니다. 줄기가 똑바로 유지 있는지 확인합니다. 스템의 선단이 뚜껑에 의해 유지되어있는 방식으로 천공 된 모자를 배치. 나사에 캡을 설정하지 마십시오. 언젠가 (단일 종류의) 하나의 줄기보다 더 embe이 될 수 있습니다하나의 유리 병에 dded; 그러나 특정한 경우, 캡을 사용하지 않는다. 참고 : 나사에 캡이 설정되어있는 경우, 줄기 트위스트 얻을 것이다.
- 이 응고 될 때까지 10 ~ 30 분 동안 실온에서 4 ° C에서 유리 병을 둡니다.
- 부드럽게 튜브의 밀어 곰팡이를 제거합니다. 파라 필름을 엽니 다. 유리 현미경 슬라이드에 부분에서 응고 아가 로스를 해제 엄지 손가락으로 부드럽게 금형 부품 B의 바닥을 밀어 넣습니다.
- 길이 1.2 cm의 세 가지 거의 동일한 조각으로 아가로 오스 임베디드 줄기를 잘라. 아가로 오스 아니었다 및 폐기 줄기 부분을 잘라.
- 임베디드와 아가로 오스의 이러한 조각을 보관은 밀폐 된 섹션 준비가 될 때까지 4 ° C에서 어두운 상자에 2 ㎖의 마이크로 원심 튜브를 줄기. 또한, 최대 1 주일에 4 ° C에서 튜브를 저장합니다. NOTE : 저장이 가능하지만, 실험자는 매립 줄기 아직 살아 있고, 실험 의존한다는 인식해야, 유물은 잠재적으로 도입 될 수있다.
2. 단면 줄기
- 주의 :주의 깊게 vibratome 설명서를 읽고 모든 안전 지침을 따르십시오.
- 시편 디스크 (임의의 고체 또는 액체 무료) 깨끗하고 완전히 건조해야합니다. 이전의 실험에서 잔여 접착제를 제거하고 물로 씻어 면도날과 표본 디스크를 청소합니다. 그런 다음 종이 타월로 건조. 참고 :이 접착제가 잘 작동하고 아가로 오스 표본에 바인딩되었는지 확인합니다. 이 단계가 제대로 수행되지 않는 경우, 시편이 디스크에 부착되지 않을 수 이상 시험편 단면 처리 중에 디스크 탈락 발생할 가능성이있다.
- 사용 소프트 논문은 표본을 포함하는 아가로 오스 블록의 모든 수분을 제거하기 위해 정리합니다.
- 시편 디스크 조직 접착제의 작은 방울을 배치합니다. 킬 접착제 병의 팁을 사용 플레이트의 중간 영역을 커버하기 위해 접착제 밖으로. 신속 장소아가로 오스 블록 시험편에 수직 또는 각각 횡 또는 종 단면에 대한 플레이트와 병렬로 어느 것을 이렇게. 접착제가 10 ~ 30 분 동안 실온에서 4 ° C에서의 표본 디스크에 샘플을 고정 할 수 있습니다. 참고 :이 시간에 민감한 단계입니다.
- 버퍼 트레이 또는 통에 자리에 표본 디스크를 고정합니다. 섹션이 아가로 오스 블록 / s는 면도날과 평행해야한다. 샘플이 완전히 침수 될 때까지 실온에서 증류수로 버퍼 트레이를 기입하십시오.
- 반 면도날을 잘라 다음 날이 완전히 평평하게 유지되도록 튼튼한 가위로 끝을 잘라. 칼 홀더에 규격에 맞게 자르는 면도날의 절반을 연결합니다.
- 84 °에 칼 홀더의 각도를 설정, 50 Hz에서 (vibratome에 위치 5)에 0.90 / 초 mm (vibratome에 위치 8) 및 주파수 속도. 100 μm의 두께의 섹션을 잘라. 연속 모드를 사용합니다. NOTE :이 두께는 조직 염색 프로토콜의 일부에 사용되는 다양한 산 및 기본 치료를 견딜 수 있음을 보장하기 위해 선택되었다. 절편의 창을 설정하고 부분 약 1.2 cm의 아가로 오스 블록에 vibratome의 연속 모드에서 15 ~ 20 분을 할 수 있습니다.
- 버퍼 트레이에 절편 동안 일회용 플라스틱 피펫을 사용하여 섹션을 수집합니다. 또한, 섹션 유리 비커에 버퍼 트레이에서 전송하고 명확한 페트리 접시에 할 수 있습니다. 2.0 ML의 microcentrifuge 튜브에 몇 가지 섹션을 전송합니다. 주 : 표본은 분명 배경에 절을 참조하기 쉽기 때문에 세균 배양 용 접시에서 수집하고, 버퍼 트레이는 다음 시편 뇌관을 할 수 있기 때문이다.
- 섹션은 30 ~ 60 분 동안 4 ° C에서 50 ML 튜브에 저장하거나 수집 및 1.5 ~ 2 밀리리터의 microcentrifuge 튜브에 저장 될 수 있습니다. 참고 : 더 긴 기간에 대한 부분을 저장하는 것은 좋지 이미지 품질을 제공합니다.
영상 3. 현미경 및 카메라 설정
- 현미경 쾰러 조명을 조정합니다. 목표를 선택합니다. 먼저 시편에 초점을 맞 춥니 다. 절반 이하로 빛의 강도를 가져옵니다. 필드 다이아 프램 (FD)와 조리개 (AP)를 닫습니다 또는 특정 목적에 가장 낮은 설정을 가져옵니다.
- 배율이 높을수록 더 큰 링이 될 것입니다. 로 급격히 가능한 필드 홍채 초점을 콘덴서 초점 노브를 사용합니다.
- 천천히 응축기 센터링 노브 (응축기를 둘러싼 핀형 나사)를 사용하여 센터 필드 조리개 (육각 형상의 작은 링)의 이미지를 가져온다. 천천히 필드 홍채 가장자리에 도달하는 격막 (FD)이 같은 증가. 필드 홍채 가장자리를 통과 한 후 바로 FD를 증가 중지합니다.
- 천천히 명암을 조절하는 조리개 (AP)를 증가시킨다. 필요에 따라 빛의 강도를 조절합니다. NOTE : 쾰러 조명마다 O 위해 조정될 필요bjective, 모든 실험 일. 하루 조정 후의 번호를합니다. 이 숫자는 목적이 특정 일에 앞뒤로 전환 할 때마다 다시 사용됩니다.
- 조리개, 강도, 노출 시간, 게인, 표 1에 설명 된대로 필터를 조정합니다.이 정보는 참조 표기하고 있습니다.
- 형광 이미지를 캡처하는 기계적 셔터 대형 인터 라인 CCD 칩과 고해상도 디지털 카메라를 사용하여; 및 명 시야 이미지를위한 고해상도, 고속 카메라.
- 표준 소프트웨어를 사용하여 슬라이드를 처리한다. 소프트웨어를로드합니다. "획득"하고 "카메라 설정 / 보드를,"다음 사용하는 카메라를 선택합니다. "OK"를 클릭하십시오. 다음에 "취득"을 클릭 "색상 탭을 선택합니다."에서 "색상 탭,"선택 "바이엘 방법을"다음 "평균 네."제안 된 이득 (빨강, 녹색, 파랑) 아프로 추가m 표 1. "설정 저장"탭을 선택하고 이미지가 저장 될 디렉토리를 클릭합니다. 표 1의 제안에서 "노출 시간"을 설정합니다. "1"에서 "비닝"을 설정하고 "라이브 비닝 (binning)을"관심 영역에 "1."초점에서 다음을 클릭하십시오 "라이브에 저장합니다."
- 카메라 소프트웨어에 출력 이미지는 "TIF"형식입니다. 세포 유형의 조직 화학에 대한 이미지를 분석한다. 프레 젠 테이션 및 간행물의 다운 스트림 사용에 대한 표준 컴퓨터 소프트웨어를 사용합니다.
4. 자외선과 밝은 - 필드 이미징
- 섹션이 용이 피펫 팅 할 수 있도록 피펫 팁 컷으로 1 ㎖ 피펫을 사용합니다. 부드럽게 피펫 섹션 끝으로하고 현미경 슬라이드에에. 커버 슬립을 가진 부분을 커버. UV 빛이나 밝은 필드 조명 아래 부분을 확인하십시오.
5. 플로로 글 루시놀 -염산 (WIESNER) 염색 (12)
- 3 % 루시놀 용액을 제조 10 ml의 무수 에탄올에 루시놀 0.3 g을 용해. 에탄올 3 % 플로로 글 루시놀의 두 볼륨에 진한 염산 (37 N) 중 하나의 볼륨을 혼합; 이 솔루션은 플로로 글 루시놀 염산 (PH-염산) 또는 WIESNER 얼룩입니다. 참고 :이 솔루션은 솔루션은 시간이 지남에 따라 저하되고 염색이 효과가 될 것입니다 때문에, 염색의 날에 신선한 만든 수 및 저장 할 수 있습니다. 주의 : 염산은 부식성이 높은, 그래서 PH-염산 얼룩을 처리하는 동안 극도의주의를 사용합니다.
- 2.0 ML의 microcentrifuge 튜브에 줄기 부분을 전송합니다. 섹션을 포함하는 튜브에 PH-HCl 용액 1 ㎖를 추가하고 PH-염산 얼룩의 염산은 부식성 때문에 바로 모자. 부드럽게 모든 섹션이 더러운 것을 보장하기 위해 튜브를 이동합니다. 이 단계에 대한 대안은 PH-HCl 용액이 위아래로 피펫 팅 할 수 있도록 바람직하게는 초를 방해하지 않고, 열려있는 관 뚜껑을 유지하는 것입니다tions. 참고 :이 그 부분에 손상을 줄 수 있으므로, 피펫 팁으로 섹션을 피펫하지 않도록주의하십시오.
- 섹션 손상없이 용이하게 피펫 팅 될 수있는 방식으로 피펫 팁 잘라 1 ㎖ 피펫을 사용한다. 부드럽게 끝으로하고 현미경 슬라이드에 섹션을 피펫. 커버 미끄럼 방지 부분을 커버. 명 시야 조명 아래 부분을 확인하십시오. 주 : PH-HCl 용액은 표본의 열화를 일으키는 50-10 분에서 건조. 따라서, 영상은 그 기간 내에 완료되어야한다.
6. 울레 염색 (13, 14)
- 0.5 % 과망간산 칼륨 용액을 제조하기 위해 40 ㎖의 증류수에 과망간산 칼륨 0.2 g을 용해. 칠일의 최대 상온에서 어두운 병에 보관합니다.
- 9 ㎖의 증류수 (1시 10분)에 1 ㎖ 진한 염산 (37 N)을 추가하여 3.7 % HCl 용액을 준비합니다. 에 신선한 3.7 % 염산 용액을 제조실험의 날. 사용되는 37 N 염산 원액이 너무 오래 있지 않은지 확인합니다. 농축 수산화 암모늄 용액 (14.8 M)가 감소하는 포화 용액의 몰 농도를 방지하기 위해 39 ° C에서 저장되어야한다.
- 2.0 ML의 microcentrifuge 튜브에 줄기 부분을 전송합니다. 섹션을 함유하는 튜브에 0.5 % 과망간산 칼륨 용액 1 ㎖를 추가.
- 바람직 부분을 방해하지 않고, 부드럽게 상하 0.5 % 과망간산 칼륨 용액을 피펫. 2 분 동안 품어 피펫 팅을 반복합니다. 모든 섹션이 정착 될 때까지 microcentrifuge 관이 서 보자. 참고 : 섹션이 손상받을 수 있으므로 피펫 팁으로 섹션을 피펫하지 않도록주의하십시오. 이 솔루션은 어두운으로 줄기 부분을 참조, 그래서 테스트 튜브 랙에 섹션에 튜브를 유지하고 2 분 동안 정착 할 수 있도록하기 어려울 수 있습니다.
- 1 ㎖ 피펫을 사용하여, 0.5 % 과망간산 칼륨 용액 700 μL를 그립니다.과망간산 칼륨 용액을 씻어 증류수 700 μl를 추가합니다. 수용액은 분명 유지 될 때까지 3 - 4 배를 반복하거나.
- 물을 폐기하십시오. 깊은 브라운 색상이 섹션에서 방전 될 때까지 빠르게 3 % 염산 1 ㎖를 추가합니다. 이 3 ~ 5 분 이내에 발생할 수 있습니다 또는 5 분 각 2 세척이 필요할 수 있습니다. 모두 3 % HCl 용액을 피펫 바로 다음 단계로 진행합니다.
- 진한 수산화 나트륨 용액 1 ㎖를 추가합니다. 섹션 손상없이 용이하게 피펫 팅 될 수있는 방식으로 첨단 잘라 1 ㎖ 피펫을 사용한다. 부드럽게 끝으로하고 현미경 슬라이드에 섹션을 피펫. coverslip에있는 부분을 커버. 명 시야 조명 아래 부분을 확인하십시오. 주의 : 수산화 암모늄은 매우 부식성이 있기 때문에, 현미경, 렌즈의 무대에 부식을 유발하지 않도록 각별한주의와 관심이 필요합니다. 주 : 수산화 암모늄 매연 어려운 샘플을 관찰하게, 커버 슬립 안개 수. 따라서 커버 슬립을 추가하기 전에 특별히 조심. 이 솔루션은 5 ~ 10 분에 건조, 그래서 영상은 그 기간 내에 완료되어야한다.
7. 콩고 레드 염색 11, 15
- 0.5 % 콩고 레드 용액을 제조하기 위해 100 ml의 증류수 콩고 레드 0.5 g을 용해.
- 2.0 ML의 microcentrifuge 튜브에 줄기 부분을 전송합니다. 튜브에 0.5 % 콩고 레드 시액 1 ㎖를 추가합니다. 조심스럽게 0.5 % 콩고 레드 솔루션을 피펫 아래 부분을 방해하지 않고. 참고 :이 부분에 손상을 줄 수 있으므로 피펫 팁에 섹션을 피펫하지 않도록주의하십시오.
- 실온에서 10 분간 부화 및 피펫 팅을 반복한다. 실온에서 배양 또 다른 3 분에 따릅니다.
- 0.5 % 콩고 레드 솔루션 700 μl를 끌어낼 1 ㎖ 피펫을 사용합니다. 콩고 레드 솔루션을 씻어 증류수 700 μl를 추가합니다. 세정액 때까지 세척 3 배를 반복분명하다.
- 섹션 손상없이 용이하게 피펫 팅 할 수있는 방식으로 그 끝 컷으로 1 ㎖ 피펫을 사용합니다. 부드럽게 끝으로하고 현미경 슬라이드에 섹션을 피펫 및 커버 슬립로 커버. 40분의 560의 통과 대역으로 필터를 사용하여 푸른 빛 여기에서 현미경 슬라이드에 샘플을 관찰한다. 참고 : 물이 10 ~ 30 분에 콩고 레드를 씻어 바와 같이, 이전에 현미경 분석에 오랫동안 물에 섹션을 보관하지 마십시오.
8. Calcofluor 화이트 염색 9
- 0.2 % 주식 솔루션을 준비 증류수 10 ㎖에 (흰색 M2R calcofluor) 형광 증 백제 (28) 0.02 g을 녹이고. 0.2 % 용액은 4 ℃에서 어두운 병에 6 개월 동안 저장 될 수있다 증류수 0.2 % 스톡 용액을 10 배 희석하여 0.02 %의 작동 용액을 준비한다.
- 2.0 ML의 microcentrifuge 튜브에 줄기 부분을 전송합니다. 0.02 %의 calcof의 관 1 ㎖에 추가luor 흰색 솔루션을 제공합니다. 부드럽게 위아래로 0.02 %의 calcofluor 흰색 솔루션을 피펫. 참고 :이 부분에 손상을 줄 수 있으므로 피펫 팁에 섹션을 피펫하지 않도록주의하십시오.
- 실온에서 5 분간 부화 및 피펫 팅을 반복한다. 실온에서 또 다른 3 분의 섹션을 품어. 참고 : 섹션이 쉽게 섹션을 손상시키지 않고 솔루션을 피펫 할 수 있도록 튜브의 바닥에 정착하도록 허용합니다.
- 0.02 %의 calcofluor 흰색 용액 700 μl를 끌어와 증류수 700 μl를 추가하는 1 ㎖ 피펫을 사용하여; 5 분은 calcofluor 흰색 솔루션을 씻어 때까지 기다립니다. 세척 3 - 4 배를 반복합니다. 섹션 손상없이 용이하게 피펫 될 수있는 방법으로의 피펫 팁 컷으로 1 ㎖ 피펫을 사용합니다.
- 부드럽게 끝으로하고 현미경 슬라이드에 섹션을 피펫 커버 슬립로 커버. UV 빛 아래 부분을 확인하십시오.
9. 톨루이딘 블루전자 O 염색 16, 17
- 0.02 % 용액을 제조 100 ml의 증류수에 0.02 g의 톨루이딘 블루 O 녹여. NOTE : 톨루이딘 블루 O 용액을 실온에서 어두운 병에서 이주를 위해 저장 될 수있다.
- 2.0 ML의 microcentrifuge 튜브에 줄기 부분을 전송합니다. 튜브에 0.02 %의 톨루이딘 블루 O 용액 1 ㎖를 추가합니다. 부드럽게 위아래로 0.02 %의 톨루이딘 블루 O 솔루션을 피펫. 그런 다음 5 분 동안 실온에서 배양하고 회 피펫 팅을 반복한다. 참고 :이 부분에 손상을 줄 수 있으므로 피펫 팁에 섹션을 피펫하지 않도록주의하십시오. 섹션이 정착 될 때까지 microcentrifuge 관이 아직도 서 보자. 이 솔루션은 어두운 상태로, 볼, 그래서 테스트 튜브 랙에 대한 섹션을 포함하는 튜브를 유지하고 실온에서 2 분 동안 정착 할 수 있도록하기 어려울 수 있습니다.
- 0.02 %의 톨루이딘 블루 O 솔루션 700 μl를 끌어낼 1 ㎖ 피펫을 사용합니다. 톨루이딘 블루 O 졸을 씻어 증류수 700 μl를 추가합니다의 ution. 3 - 4 배를 반복하거나 세척 솔루션까지 분명하다. 섹션들을 손상시키지 않고 용이하게 피펫 팅 될 수있는 방식으로 피펫 팁 잘라 1 ㎖ 피펫을 사용한다.
- 부드럽게 끝으로하고 현미경 슬라이드에 섹션을 피펫 커버 슬립로 커버. 명 시야 조명 아래 부분을 확인하십시오.
- 현미경 쾰러 조명을 조정합니다. 목표를 선택합니다. 먼저 시편에 초점을 맞 춥니 다. 절반 이하로 빛의 강도를 가져옵니다. 필드 다이아 프램 (FD)와 조리개 (AP)를 닫습니다 또는 특정 목적에 가장 낮은 설정을 가져옵니다.
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Representative Results
임베딩 및 단면 줄기 :
포함 할 만든 플라스틱 금형의 사용은 아가로 오스 빠르고 쉽게 (그림 1) 입증 7 %에서 유래한다. 두 부분 (A와 B, 그림 1) 내장 된 유리 병 시스템은 간단한 쉽게 청소 시스템을 유지, 아가로 오스는 불활성 유리 병 부분에 충실하지 않는 한 아가로 오스에 포함 된 줄기를 해제 할 수 있습니다. 작은 유리 병 몇 년 동안 여러 번 재사용 할 수 있습니다. 임베디드 줄기를 저장하는 편의는 다음 단계가 쉬워집니다. 언젠가 임베디드 비슷한을 저장하기 위해 줄기는 단면 처리에 대해 하나의 단면 판에 (최대 3 개) 그룹화 할 수 있습니다.
UV에서 방향족의 관측 :
줄기 부분은 유리 슬라이드에 증류수에 장착 UV 빛으로 관찰되었다. 세포에있는 리그닌을 포함하는 방향족 화합물은, UV 빛에서 자신의 형광도에 의해 시각하실 수 있습니다. 통 (XY)와 interfascicular 섬유 (FI)리그닌, 방향족 고분자, 차 세포벽 생합성 동안에 퇴적되어 있기 때문에, 속 (PI) 및 피질 또는 표피 (EP) (그림 2)에서 UV 조명 아래가 아닌 형광도를 보여 주었다. 식물들이 액포 (예 안토시아닌)에서 방향족 화합물의 상당량을 축적 할 때 어떤 경우에는, 형광 피질 세포 (데이터 미도시)에서 관찰 될 수있다. 줄기 단면은 5X, 10X, 20X 하에서 분석하고, 40X 배율 (도 2 패널 A, B, C, 및 D - 각각 E는) 나은 줄기 걸쳐 세포벽 방향족 분포를 시각화.
플로로 글 루시놀과 마 울레 얼룩 스테인드 줄기 섹션에서 리그닌의 관측 :
선박 및 섬유와 interfascicular 섬유로 구성된 통은 리그닌 얼룩 (플로로 글 루시놀과 마 울레에 의해 염색 줄기의 요소 만했다) 야생형 줄기 단면 샘플을 사용. 플로로 글 루시놀 얼룩 핑크 또는 자홍색 4 색 (그림 3)을 제공하기 위해 리그닌의 신남 엔드 그룹과 반응한다. UV 조명으로 관찰 된 바와 같이, 자홍색 착색이 통하고 interfascicular 섬유에서 관찰하지만 속 피질 또는 표피 (그림 3)의 존재이다. 줄기의 단면은 5 배, 10 배, 20 배에서 분석하고, 40X 배율 (그림 3 패널 A, B, C 및 D - E, 각각) 더 나은 줄기를 통해 플로로 글 루시놀 얼룩 분포를 시각화하고 주요 조직을 구별하는; 통 및 interfascicular 섬유; 속과 껍질; 표피. 보통의 강도는 질적 인 방식으로 lignification의 수준과 상관 - 분석 돌연변이 또는 유전자가 비정상적으로 신남 유도되는 단위 (예를 들어 CAD의 돌연변이)에 충실 할 때를 제외하고 <> 14 저녁을 먹다. 울레 얼룩 통하고 interfascicular 섬유에 syringyl 리그닌 단위를 감지하는 고유합니다. 붉은 채색 리그닌 요소 syringyl 리그닌 단위의 존재 (그림 4) 18을 나타냅니다. 목부는 G 단위보다 충실 반면 섬유 S 리그닌의 높은 수준을 포함하는 것이 제안 목질부 조직에 비해 그러나, 밝은 적색 착색은 섬유에서 관찰된다. 플로로 글 루시놀 염색 후 관찰, 붉은 채색이 통하고 interfascicular 섬유에서 관찰하지만 속 피질 또는 표피 (그림 4)에서 결석입니다. 또한 UV 관찰 리그닌 분포 (그림 2)와 상관 관계 및 syringyl 유닛이 줄기 샘플의 모든 lignified 조직에 존재하는 것을 보여줍니다. 줄기 단면은 5X, 10X, 20X 하에서 분석 및 40X 배율 (도 2 패널 A, B, C, 및 하였다D - E, 각각) 더 나은 줄기에서 울레 얼룩 분포를 시각화하고 주요 조직 분화 : 통 및 interfascicular 섬유 속과 껍질, 그리고 표피를. 그것은 양 lignified 조직 사이 syringyl 단위 분포 줄기의 연령에 따라 변화하고 어린 줄기 (데이터는 도시되지 않음)에 존재하지 않을 수 있다는 것을주의하는 것이 중요하다.
Calcofluor 흰색과 콩고 레드 얼룩 스테인드 줄기의 단면 관찰 :
Calcofluor 흰색 얼룩 셀룰로오스, callose 및 기타 비치 환 또는 약하게 치환 된 β-글루칸; 반면 콩고 붉은 얼룩 직접 β-(1 → 4) - 글루칸, 특히 셀룰로오스에. calcofluor 흰색으로 염색 줄기 부분은 자외선 6-9으로 관찰되었다. 콩고 레드 스테인드 섹션 40분의 560의 통과 대역으로 필터를 사용하여 푸른 빛 여기에서 관찰되었다. 모두 흰색 calcofluor 콩고는 표피, 피질과 속 스테인드 빨강; 일이러한 조직의 모든 세포벽의 주요 다당류 고분자 (그림 5와 그림 6은 각각)로 셀룰로오스를 포함하기 때문에입니다. 대조적으로 통하고 interfascicular 섬유에서 더 나은 흰색, 콩고 레드 스테인드 다당류를 calcofluor하고 덜 리그닌의 존재 (그림 5, 그림 6) 10, 11에 의해 영향을받는 것 같다. 단면이 5 배, 10 배, 20 배에서 분석하고, (6 패널 A, B, C, 및 DE, 각각도 5과) 더 줄기와 주요 가로 질러 흰색과 콩고 붉은 얼룩 분포 calcofluor 40X 배율 시각화 줄기 조직 (통 및 interfascicular 섬유 속과 껍질, 표피).
톨루이딘 블루 O로 염색 줄기의 단면 관찰 :
그것은 다른 화학 다른 세포의 구성 요소와 결과에 반응하기 때문에 톨루이딘 블루 O는 다색 염료로 분류멀티 컬러 시편 (그림 7). 생성 된 색은 셀 및 그것의 벽의 활동에 대한 정보를 제공 할 수있다. 톨루이딘 블루 O 부정적인 5 그룹을 청구하는 결합하는 양이온 성 염료이다. 이 염료 수용액 청색이지만, 염료 셀 6,9 다른 음이온 성 그룹과 결합 할 때 상이한 색이 생성된다. 염료는 펙틴 산 등의 카르 다당류와 반응 할 때 예를 들어, 분홍빛이 도는 보라색 색상이 나타납니다; 녹색, 녹색 청색 또는 리그닌 및 탄닌 등의 폴리 방향족 물질과 밝은 파란색; 와 보라색 또는 핵산과 녹색 파랑. 줄기 단면의 톨루이딘 블루 O는 목부와 interfascicular 섬유가 UV와 PH-염산 염색 관찰 (그림 2와 일치하는 녹색 청색 또는 착색 (그림 7, 패널 C)를 보여 이후 lignified 및 것으로 나타났다 3). 대조적으로, 속 및 그들은 lignified되지 않더라도, 그들의 세포 벽의 일부 펙틴 중합체를 포함하기 때문에 피질과 표피 조직은 녹색 청색 또는 착색을 보여줍니다. 줄기 단면은 5X, 10X, 20X 하에서 분석하고, 40X 배율 (도 7 패널 A, B, C, 및 D - E, 각각)는 더 나은 줄기 걸쳐 톨루이딘 블루 O 얼룩 분포를 시각화하고있는 주요 조직 차별화 .
.. 왼쪽에 줄기를 포함 그림 1 집에서 만든 금형; 2 ㎖ 스크류 캡 microcentrifuge 관 (파트 A)와 0.6 ML microcentrifuge 관 (파트 B)에서 하단의 상단. 오른쪽에; 두 부분을 잡고 파라 필름; 최종 주형을 형성하는 단계와 B.
A. 그림 2. UV 형광 장대 줄기 단면. 야생형 A.의 횡단면 만 interfascicular 섬유와 목부 세포 (- E)의 벽에 리그닌 등의 방향족 화합물의 존재를 나타내는 자외선 형광에서 장대 줄기. 표피와 피질 (EP), interfascicular 섬유 (FI), 속 (PI)와 통 (XY)의 위치가 표시됩니다. 배율 : 패널 A : 배, 패널 B : 10X, 패널 C : 20X, 패널 D와 E : 40X. 바 = 100 μm의.
그림 3. A.의 플로로 글 루시놀 염산 염색 장대 줄기 단면. 야생 A 형의 플로로 글 루시놀 염산 염색 (핑크 또는 자홍색 컬러) interfascicular 섬유 및 목부 세포 (- E)의 벽에 정상 리그닌 증착을 보여주는 장대 줄기 부분. 표피와 피질 (EP), interfascicular 섬유 (FI), 속 (PI)와 통 (XY)의 위치가 표시됩니다. 배율 : 패널 A : 배, 패널 B : 10X, 패널 C : 20X, 패널 D와 E : 40X. 바 = 100 μm의.
그림 4. A.의 울레 염색 장대 줄기 단면. 야생 A 형의 울레 염색 (붉은 색) 장대 </ EM> interfascicular 섬유 및 목부 세포 (A - E)의 벽에 정상 리그닌 증착을 보여주는 줄기 부분. 표피와 피질 (EP), interfascicular 섬유 (FI), 속 (PI)와 통 (XY)의 위치가 표시됩니다. 배율 : 패널 A : 배, 패널 B : 10X, 패널 C : 20X, 패널 D와 E : 40X. 바 = 100 μm의.
그림 5. A.의 Calcofluor 흰색 염색 야생 A 형의 장대 줄기 단면. Calcofluor 흰색 염색 표피, 외피, 속, interfascicular 섬유 및 목부 (- E A)의 세포의 세포벽에서 셀룰로오스 증착 보여주는 장대 줄기 부. positi의표피와 피질 (EP)의 기능은, interfascicular 섬유 (FI), 속 (PI)와 통 (XY)가 표시됩니다. 배율 : 패널 A : 배, 패널 B : 10X, 패널 C : 20X, 패널 D와 E : 40X. 바 = 100 μm의.
그림 6. A. 콩고 레드 염색 야생 A 형의 장대 줄기 단면. 콩고 레드 염색 표피, 외피, 속, interfascicular 섬유 및 목부 (- E A)의 세포의 세포벽에서 셀룰로오스 증착 보여주는 장대 줄기 부. 표피와 피질 (EP), interfascicular 섬유 (FI), 속 (PI)와 통 (XY)의 위치가 표시됩니다. 배율 : 패널 A : 배, 패널 B 패널 C : 20X, 패널 D와 E : 40X. 바 = 100 μm의.
A. 그림 7. 톨루이딘 블루 O 염색 야생 A 형의 장대 줄기 단면. 톨루이딘 블루 O 염색 interfascicular 섬유 및 목부 세포 (- E)의 벽에 정상 리그닌 증착을 보여주는 장대 줄기 부분. 표피와 피질 (EP), interfascicular 섬유 (FI), 속 (PI)와 통 (XY)의 위치가 표시됩니다. 배율 : 패널 A : 배, 패널 B : 10X, 패널 C : 20X, 패널 D와 E : 40X. 바 = 100 μm의.
영상 표 1. 현미경과 카메라 설정. 형광 필터와 시야의 영상 작업을위한 지침. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
A. thaliana의 줄기 부분 널리 이차 세포벽의 세포 조직을 연구하고 질적 야생형 및 트랜스 제닉 식물의 차이를 조사하기 위해 사용된다. 표본을 절편 일반적으로 사용되는 기술은 직접 손으로 절단하다; 표본이 아가로 오스 또는 정착에 포함 된 경우 나, 절편은 vibratome 또는 마이크로톰을 수행 할 수 있습니다. 한편 절단 달리, 마지막 두 단순히 샘플 및 요철 표면 사이의 두께 차이로 인한 잘못된 시료 준비에 의해 야기 될 샘플 간의 차이 부정확 제조 위험을 줄일 수있다. 이러한 방법들은 모두 장단점이 있습니다. 우리는 vibratome를 사용 구획 한 후, 아가 로스에 매립 선택하고, 다음과 같은 이유로 이렇게했다 : 신선한 조직의 정교한 처리의 필요성을 없애 매립 용이성과 시간을 사용하여 아가 로스에 보냈다. 또한, 직접 만든 금형 만들기 쉽고 저렴, 일을 보유 할 수전자 똑바로 줄기, 몇 년 동안 사용할 수 있으며, 혼잡하지 않고 표본을 쉽게 방출하는 데 도움이 될 수 있습니다. 높은 비율의 아가 로스를 녹여 균일 한 솔루션을 얻을 수있는 가장 좋은 방법은 (땅딸막 한 과립을 형성하지 않고 100 ㎖의 아가로 오스 7 g을 완전 용해)을 압력솥하거나 낮은 강도로 그것을 전자 레인지입니다. 신선 줄기 조직을 절단, 또는 대안 티슈 탈수 및 변형을 방지하기 위해 물에 적신 여과지를 함유하는 얼음에 배치 접시에 보관하는 것이 중요하다. 높은 습기없이 30 분 이상 기간에 대한 줄기를 저장하면 줄기가 건조하게됩니다. 줄기가 포함되기 직전에 아가로 오스의 온도는 약 50 ° C.해야 기포가 금형에 간극을 야기하고, 결과적으로 단면이 요철 것 때문에, 아가로 오스가 바이알에 주입 된 후에, 기포의 존재를 확인하는 것이 중요하다. 기포가 쏟아져 전에 진공 하에서 용액을 배치하여 신속하게 제거 할 수있다그. 여전히 부드러운 아니라 따뜻한 50 ° C. 때 줄기는 아가로 오스에 배치해야 열은 줄기 쇠퇴 해하여 샘플을 손상하고 세포의 형태를 파괴 할 것이다. 아가로 오스가 너무 차가 우면 줄기는 아가로 오스를 통해 침투되지 않고 매립은 할 수 없습니다. 아가로 오스 매립 한 후, 줄기 샘플은 1 주일까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
대신 손으로 구획 수율의 vibratome의 사용은 정확하게 표본과 더 나은 이미지 품질을 잘라. 모든 안전 지침을주의 깊게 읽고 vibratome를 사용하는 동안 따라야한다. 이것은 시편 디스크가 구획 동안 떨어지지 않도록 조직 접착제가 제자리에 강하게 시험편을 보유 할 수 있도록 깨끗하고 건조하는 것이 중요하다. 시편의 두께는 염색 과정에서 거친 산 및 기본 치료를 견딜 수 있도록 지정합니다. vibratome에 사용되는 면도날이 섹션은 EV를 절단하도록 완전히 평평해야합니다enly. 단면은 샘플 당 약 20 분 소요; 시간을 절약하기 위해, 유사한 시험편 단일 시료 접시에 그룹으로 절개 할 수있다. 절편 동안 섹션은 분명 배경에 볼 수있는 부분을 더 쉽게하기 위해, 다음 표본에 대한 버퍼 트레이를 해방 작은 페트리 접시에 버퍼 트레이에서 전송됩니다. 섹션 바로 하류 염색 절차에 사용하거나 나중에 사용하기 위해 저장할 수 있습니다. 2.0 ML의 microcentrifuge 튜브에 줄기 부분을 분취하여 염색 절차 프라이밍에 도움이됩니다. 카메라와 현미경에 대한 정확한 조정과 설정을하는 것은 높은 품질의 이미지를 달성하기위한 매우 중요합니다. 쾰러 조명을 조정하면 현미경의 사용에 가장 중요한 단계 중 하나이다. 방법 섹션의 설명에 따라 조리개와 빛의 강도에 대한 조정은, 지침으로서 만 의미가있다. 그들은 사용되는 현미경과 카메라에 따라 수정해야 할 수도 있습니다. 우리는 고해상도를 사용대형 인터 라인 CCD 칩과 기계적 셔터 UV 이미징, calcofluor 흰색, 콩고 레드 염색과 디지털 카메라; 및 울레 루시놀 및 톨루이딘 블루 O 염색의 명 시야 이미지를위한 고해상도, 고속 칼라 카메라. 이미지는 분석 처리 및 표준 이미징 소프트웨어를 사용하여 조립 하였다.
플로로 글 루시놀 리그닌 판정을 위해 가장 일반적으로 사용되는 얼룩이고; 그것은 단지 신남 알데하이드 최종 그룹을 얼룩으로 진정한 리그닌 얼룩 없습니다. 또한 Weisner 얼룩로 알려진 플로로 글 루시놀 얼룩, 목질부 이러한 알데히드 그룹이 4 존재 interfascicular 섬유의 특성 체리 핑크 또는 자홍색 색상을 얻을 수 있습니다. 핑크 색상의 강도는 lignification의 정도에 따라 달라집니다. 미묘한 차이는 관찰하기 어렵 있지만, 그것은 야생의 종류와 자신의 리그닌 함량 19의 변화가 돌연변이 줄기 부분 사이의 차이를 발견하기 쉽습니다. 또한 EAS이며이러한 조직 간의 lignification 수준이 다르기 때문에, (줄기 정점을 향해) 젊은 세 이상 (기본 줄기) 조직 간의 차이를 관찰 할 수 y를 입력합니다. 보통 야생형 줄기에, 표피 피질과 속 자궁외 lignification (20)가없는 (따라서 착색되지 않는다) cinnamaldehydes가 포함되어 있지 않습니다. 울레 스며, 반면에, syringyl 리그닌 유닛 향해 다르며 S 또는 G 단위 다른 리그닌 enrichments (목질부 조직 대 섬유 등) (14, 18)를 구별하기 위해 사용될 수있다. methoxycatechol을 형성 한 다음 수산화 암모늄과 반응 다음과 같은-O-메 톡시가 퀴논을하는 리그닌의 S 부의 syringyl 핵에 과망간산 칼륨 및 염산 법. 울레 얼룩가 부족하거나 광범위하게 (A. 장대 f5h 돌연변이 및 일반 gymnosperm 공장에서 예)를 리그닌의 S 단위로 고갈 돌연변이를 차별화하기위한 좋은 지표입니다, 마 울레 노란색 - 갈색 착색 이달에게 제공통 및 후벽 (21) 모두에서 빨간색의 EAD. 동일한 이유로, 울레 염색은 주로 통상적 S 부 (18)가 부족 겉씨 S로부터 리그닌을 함유하는, 피자 식물을 구별하는데 사용될 수있다. 강산과 염기는 각각 플로로 글 루시놀 및 울레 염색 과정에서 사용되기 때문에, 약간의 실험 단계를주의하여 수행 될 필요가있다. 농축 염산 및 수산화 암모늄은 모두 강한 부식성이다; PH-염산과 마 울레 스테인드 샘플을 포함하는 슬라이드가 제대로 처리되지 않을 경우 그들은 현미경 무대와 렌즈를 악화 할 수있다. 또한 표본이 저하하는 원인이, 5 ~ 10 분 이내에 신속하게 건조 할 수 있으므로 영상은 빠르게 수행 할 수 있습니다. 톨루이딘 블루 O는 다색 스며이며 그것은 멀티 시험편을 제조 다르게 세포벽의 다른 화학적 성분과 반응하여 다른 색의 셀 벽의 다른 구성 요소 얼룩. 생성 된 색상이 제공하기 할 수 있습니다셀의 성격에 전자 정보. 톨루이딘 블루 O는 부정적인 그룹이 5,6 청구하는 결합하는 양이온 성 염료이다. 이 염료 수용액 청색이지만, 염료가 상이한 셀에 음이온 성기와 결합 될 때 다른 색이 생성된다. 염료는 펙틴 등의 카복실 다당류와 반응 할 때 예를 들어, 색상은 분홍빛 보라색이다; 녹색, 녹색 청색 또는 리그닌 및 탄닌과 같은 방향족 물질과 밝은 파란색; 와 보라색 또는 핵산과 녹색 파랑. 얼룩이 쉽게 이틀 동안 지속 할 수있다.
Calcofluor 흰색 얼룩 셀룰로오스, callose 및 기타 비치 환 또는 약하게 치환 된 β-글루칸 6-9, 콩고 붉은 얼룩은 직접 (1 → 4) - 글루칸-β하고, 특히 8,10,11 셀룰로오스 할 수 있습니다. 흰색 얼룩 Calcofluor 훌륭하게 표피, 피질과 속하지만은 그 빛이 크게 목부와 interfascicular 섬유로 감소된다. 두 가지 P있다크게 lignified 조직에서 calcofluor 흰색의 감소 된 형광을위한 ossible 설명; 하나는, 차례로 다당류를 적절히 확산 calcofluor 화이트의 능력을 감소시킬 수있는, 리그닌의 존재로 특성. UV에서 흥분 흰색 calcofluor에 의해 방출되는 형광의 부분 담금질에 두 번째 설명을 가리 킵니다. 반면에 빨간 염색을 콩고, 흰색 calcofluor에 덜 리그닌의 존재에 의해 영향을받는 것 같다. 그것은 붉은 calcofluor 흰색과 콩고 사이의 형광 특성의 차이에 관련이있을 수 있습니다; 콩고의 더 나은 확산 기능은 calcofluor 흰색보다 lignified 조직을 통해 붉은 색; 또는 폴리 사카 라이드 바인딩 속성 (22) 약간의 차이. 빨간색 콩고하면 물에 씻겨 얻을하는 경향이 있기 때문에, 붉은 콩고와 스테인드 섹션 이미징 전에 너무 오래 저장해야한다는 점을 명심해야한다.
조직 화학적 염색은 양적도 있지만도 절대적으로 결정적인, 그것은 시각 신호를 통해 이러한 조직이나 비정상적인 세포 벽 증착 및 lignification의 무결성과 같은 중요한 특성에 대한 풍부한 정보를 공개 할 수 있습니다. 상술 얼룩 기술은 수행하기 쉽고 리그닌과 셀룰로오스 등의 식물 세포벽의 중요한 요소에 대해 적용 가능하다. 대조적으로, 특정 항혈청 및 모노클로 날 항체를 이용하여 면역 형광은 헤미셀룰로오스 및 펙틴의 다양한 구성 요소의 검출을 위해 필요하다. 이 보고서는 A.를 사용하는 이차 전지 벽 염색의 분야에서 초보자를위한 입문서 역할을하기위한 것입니다 자신의 모델 시스템으로 장대.
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Acknowledgments
우리는 편집에 도움 세이빈 러셀에 감사드립니다. 이 작품은 (http://www.jbei.org) 미국 에너지 부, 과학, 생물 환경 연구의 사무실, 사무실에서 지원하는 DOE BioEnergy 공동 연구소의 일부였다 로렌스 버클리 사이의 계약 DE-AC02-05CH11231 통해 국립 연구소와 미국 에너지 부.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | EMD | MERC2125 | CAS Number: 9012-36-6 |
| Phloroglucinol | Sigma | P 3502 | 1,3,5-trihydroxybenzene [CAS Number: 108-73-6] |
| Hydrochloric acid | EMD | HX0603-75 | CAS Number: 7647-01-0 |
| Ammonium hydroxide | EMD | AX1303-6 | CAS Number: 1336-21-6 |
| Toulidine Blue O | Sigma | T3260 | Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS Number 92-31-9] |
| Potassium permanganate | Sigma | 223468 | CAS Number 7722-64-7 |
| Ethanol 190 proof | KOPTEC | V1401 | CAS Number: 64-17-5 |
| Congo Red | Sigma | C6277 | Disodium 3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalene 1-sulphonate) [CAS Number 573-58-0] |
| Fluorescent Brightener 28/ Calcofluor White Stain | Sigma | F3543 | 4,4'-Bis[[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2'-disulphonic acid [CAS Number 4404-43-7] |
| Vibratome | Leica | Leica Vibrating blade microtome VT1000S | http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/ |
| Razor | American Safety razor company | Item # 60-0139-0000 | Stainless Steel Double Edge Blade (Personna Super) |
| Screw Cap Microcentrifuge Tubes (2 ml) | VWR | 16466-044 | |
| Microcentrifuge Tubes (0.6 ml) | Axygen Scientific | MCT-060-C | |
| Mitt | Bel-Art | 380000000 | SCIENCEWARE Hot Hand Protector Mitt |
| Tissue adhesive | Ted Pella Inc | 10033 | Store at 4 °C or 20 °C for 3 months or longer storage |
| Microwave | Panasonic | NN-SD762S | PELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive |
| Camera with CCD chip with no mechanical shutter | Hamamatsu | C4742-95 | |
| High speed color camera | QImaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Camera software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.0.0 | |
| Imagining anaylsis | Adobe | Photoshop CS4 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-067 | 22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Cover glasses are corrosion-resistant and uniformly thick and flat. No. 1 thickness is 0.13 to 0.17 mm. |
| Frosted Micro Slides, 1 mm | VWR | 48312-003 | 75 x 25 mm - 1 mm |
| Parafilm M | Alcan packaging | BRNDPM998 | |
| TX2 Filter cube | Leica | 11513851/11513885 | Filter used for Congo red analysis with a band-pass of 560/40. |
References
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