식물 세포벽 구성은 조직 유형에 따라 다르며 리그닌, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 및 펙틴을 포함할 수 있습니다. 세포 유형 수준에서 차이를 시각화하기 위해 다양한 염색 기술이 개발되었습니다. 이 논문은 일반적으로 사용되는 세포벽 염색 기술을 편집한 것입니다.
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이 논문에서
요약
초록
Arabidopsis thaliana는 식물의 다양한 세포 과정을 이해하고 조작하는 데 일반적으로 사용되는 모델 유기체이며 2차 세포벽 형성 연구에 광범위하게 사용되었습니다. 2차 세포벽 증착은 1차 세포벽이 놓인 후에 발생하며, 이 과정은 혈관 및 섬유 조직을 형성하는 세포와 같은 특수 세포에 의해 독점적으로 수행됩니다. 대부분의 2차 세포벽은 셀룰로오스(40-50%), 헤미셀룰로오스(25-30%), 리그닌(20-30%)으로 구성되어 있습니다. 2차 세포벽 생합성에 영향을 미치는 여러 돌연변이가 분리되었으며, 해당 돌연변이는 보상 반응에 의해 가려질 수 있기 때문에 해당 돌연변이는 명백한 생화학적 조성 변화 또는 시각적 표현형을 나타내거나 나타내지 않을 수 있습니다. 염색 절차는 역사적으로 세포 기반의 차이를 보여주기 위해 사용되어 왔습니다. 이러한 방법은 전적으로 시각적 분석 수단입니다. 그럼에도 불구하고 신속하고 비판적인 분석에서 이들의 역할은 매우 중요합니다. 콩고 레드(Congo red)와 칼코플루오르 화이트(calcofluor white)는 다당류를 검출하는 데 사용되는 염색이며, 말레(Mäule)와 플로로글루시놀(phloroglucinol)은 리그닌(lignin)의 차이를 확인하는 데 일반적으로 사용되며, 톨루이딘 블루 O(toluidine blue O)는 다당류와 리그닌을 구별하여 염색하는 데 사용됩니다. 겉보기에는 간단해 보이는 절편, 염색 및 이미징 기술은 초보자에게는 어려울 수 있습니다. 이 연구는 A. thaliana 모델을 사용한 시료 전처리를 시작으로 식물의 2차 세포벽에서 세포 및 조직 조직을 관찰하기 위해 쉽게 구현할 수 있는 다양한 염색 방법론의 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.
서론
식물 세포의 벽은 다양한 구성 요소 내에서 정보의 과다 보유 : 리그닌, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 (크 실란, glucuronoxylan, 크 실로 글루칸, 아라비, 혼합 결합 글루칸, 또는 글루코), 펙틴을. 조직 학적 기술 조직 및 세포 수준에서 보조 세포 벽 내의 차이를 연구하는 중요한 시각적 단서를 제공한다. 다양한 조직 학적 방법이 개발되었고, 문헌에서 발견 될 수 있지만, 단순한 시각적 지시 매우 상세한 프로토콜이 드물게 이제까지 가능한 경우 없기 때문에 이러한 기술은 어렵고 시간 소모적 초보자 수있다. 본 연구의 목적은 높은 품질의 이미지를 얻기 위해 조직 학적 염색 기법에 대한 간단한 지침을 제공하는 것이다.
줄기 조직을 구획하는 셀 벽 및 셀의 셰이프 시각화하는 첫 번째 단계이다. 손으로 자른 부분이 저렴하고 준비하는 시간을 줄이고 있지만, vibratome의 사용은 일관성을 제공하며,고품질 이미지를 산출한다. vibratome를 사용하여 선명한 이미지를 생성하는 데 도움이 상당히 간단 나쁜 시료 준비에 의해 야기 될 샘플 간의 부정확 차이 제조 위험을 줄여 동일한 두께, 심지어 섹션을 생성함으로써 더 나은 데이터 품질을 생산한다. 신선한 표본을 해결하기 위해 수지를 사용하여 초보자를위한 도전이 될 수 있으며, 분석을 신....
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프로토콜
1. 임베딩에게 줄기
- 물에 7 % 아가로 오스 용액 (증류수 100 ㎖에 전기 수준의 아가로 오스 7 g)을 확인합니다. 20 분간 고압 증기 멸균 또는 낮은 강도 (1,250 와트 전자의 예를 들면, 10 % 강도)에서 20 분 동안 레인지 작동하여 아가 로스를 녹여.
- 플라스틱 병을 사용하여 줄기 삽입을 위해 만든 금형을 준비합니다.
- 면도날을 사용하여, 2 ㎖ 스크류 캡 microcentrifuge 관 (파트 A)의 원뿔 바닥을 잘라. 주사기 바늘로, 임베드하도록 스템의 직경보다 약간 큰 튜브 캡에 구멍을 천공. 다음으로, 0.6 ML의 microcentrifuge 관 (파트 B)의 아래쪽에서 0.5 cm를 잘라.
- 미리 절단 2 ㎖의 마이크로 원심 분리 튜브에 0.6 ㎖의 마이크로 원심 튜브의 컷오프 0.5 cm 부를 추가. 파라 필름 (그림 1)를 사용하여 두 부분을 밀봉합니다. 주 : 튜브의 하단은 아가로 오스가 고형화 된 후에 매립 샘플의 제거를 용이하게 절단된다. 티그는 모자에 구멍이 줄기는 아가로 오스에 포함되는 경우 줄기가 안정적으로 유지에 도움이됩니다. 형은 아가 로스를 잡고 삽입 할 때 줄기를 똑바로 유지하는 역할을합니다. 아가로 오스가 설정과 줄기가 삽입 ....
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결과
임베딩 및 단면 줄기 :
포함 할 만든 플라스틱 금형의 사용은 아가로 오스 빠르고 쉽게 (그림 1) 입증 7 %에서 유래한다. 두 부분 (A와 B, 그림 1) 내장 된 유리 병 시스템은 간단한 쉽게 청소 시스템을 유지, 아가로 오스는 불활성 유리 병 부분에 충실하지 않는 한 아가로 오스에 포함 된 줄기를 해제 할 수 있습니다. 작은 유리 병 몇 년 동안 여러 번 재사용 할 수 있습니다. 임베디드 줄기를 저장하는 편의는 다음 단계가 쉬워집니다. 언젠가 임베디드 비슷한을 저장하기 위해 줄기는 단면 처리에 대해 하나의 단면 판에 (최대 3 개) 그룹화 할 수 있습니다.
UV에서 방향족의 관측 :
줄기 부분은 유리 슬라이드에 증류수에 장착 UV 빛으로 관찰되었다. 세포에있는 리그닌을 포함하는 방향족 화합물은, UV 빛에서 자신의 형광도에 의해 시각하실 수 있습니다. 통 (XY)와 interfasci.......
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토론
A. thaliana의 줄기 부분 널리 이차 세포벽의 세포 조직을 연구하고 질적 야생형 및 트랜스 제닉 식물의 차이를 조사하기 위해 사용된다. 표본을 절편 일반적으로 사용되는 기술은 직접 손으로 절단하다; 표본이 아가로 오스 또는 정착에 포함 된 경우 나, 절편은 vibratome 또는 마이크로톰을 수행 할 수 있습니다. 한편 절단 달리, 마지막 두 단순히 샘플 및 요철 표면 사이의 두께 차이로 인한 잘못된 시료 준비에 의해 야기 될 샘플 간의 차이 부정확 제조 위험을 줄일 수있다. 이러한 방법들은 모두 장단점이 있습니다. 우리는 vibratome를 사용 구획 한 후, 아가 로스에 매립 선택하고, 다음과 같은 이유로 이렇게했다 : 신선한 조직의 정교한 처리의 필요성을 없애 매립 용이성과 시간을 사용하여 아가 로스에 보냈다. 또한, 직접 만든 금형 만들기 쉽고 저렴, 일을 보유 할 수전자 똑바로 줄기, 몇 년 동안 사용할 수 있으며, 혼잡하지 않고 표본을 쉽게 방출하는 데 도움이 될 수 있습니다. 높은 비율의 아.......
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공개 사항
저자는 공개할 재정적 갈등이 없습니다.
감사의 글
우리는 편집에 도움 세이빈 러셀에 감사드립니다. 이 작품은 (http://www.jbei.org) 미국 에너지 부, 과학, 생물 환경 연구의 사무실, 사무실에서 지원하는 DOE BioEnergy 공동 연구소의 일부였다 로렌스 버클리 사이의 계약 DE-AC02-05CH11231 통해 국립 연구소와 미국 에너지 부.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아가로 스 | EMD | MERC2125 | CAS 번호 : 9012-36-6 |
| Phloroglucinol | Sigma | P 3502 | 1,3,5- 트리 하이드 록시 벤젠 [CAS 번호 : 108-73-6] |
| 염산 | EMD | HX0603-75 | CAS 번호 : 7647-01-0 |
| 수산화 암모늄 | EMD | AX1303-6 | CAS 번호 : 1336-21-6 |
| 툴리딘 블루 O | 시그마 | T3260 | 블루틴 클로라이드, 톨로늄 클로라이드 [CAS 번호 92-31-9] |
| 과망간산 칼 | 시그마 | 223468 | CAS 번호 7722-64-7 |
| 에탄올 190 증명 | KOPTEC | V1401 | CAS 번호: 64-17-5 |
| 콩고 레드 | 시그마 | C6277 | 디소듐 3,3'-[[1,1'-비페닐]-4,4'-디일비스(아조)]비스(4-아미노나프탈렌 1-설포네이트) [CAS 번호 573-58-0] |
| 형광 증백제 28/ Calcofluor White Stain | Sigma | F3543 | 4,4'- 비스 [[4- [비스 (2- 하이드 록시 에틸) 아미노] -6- 아닐리 노 -1,3,5- 트리아진 -2- 일] 아미노] 스틸벤 -2,2'- 디 술폰산 [CAS 번호 4404-43-7] |
| Vibratome | Leica | Leica 진동 칼날 마이크로톰 VT1000S | http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/ |
| Razor | American Safety 면도기 회사 | 품목 # 60-0139-0000 | 스테인레스 스틸 더블 에지 블레이드 (Personna Super) |
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| 미트 | Bel-Art | 380000000 | SCIENCEWARE 핫 핸드 프로텍터 미트 |
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| TX2 필터 큐브 | 라이카 | 11513851/11513885 | 560/40 대역 통과로 콩고 적색 분석에 사용됩니다. |
참고문헌
- Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).
- Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. Lignin biosynthesis and structure. Plant physiology. 153, 895-905 (2010).
- Humphreys, J. M., Chapple, C.
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