Summary
ナイルレッド染色手順を使用して藻の中性脂質含有量を決定するための簡単なプロトコルが記載されている。この時間節約の技術は、従来の重量ベースの脂質定量化プロトコルに代わるものを提供しています。これは、バイオプロセスの性能を監視する特定の用途のために設計されている。
Abstract
藻類は、彼らの自然な脂質貯蔵能力による再生可能な燃料源のための優れた候補と考えられている。藻類発酵プロセスと新しいオイルが豊富な株をスクリーニングするための堅牢なモニタリングは、細胞内の脂質含有量の測定のための高速かつ信頼性の高いプロトコルが必要です。現在の慣行は、油含有量を決定するために、重量法に大きく、時間がかかり、大量の試料を必要とする数十年前に開発された技術に頼る。本稿では、ナイルレッド、多数のタイプの生物における脂質体の存在を同定するために使用されている蛍光色素は、緑色、Auxenochlorellaのprotothecoidesの中性脂質含量を測定するための、簡単、迅速、かつ信頼性の高いプロトコルに組み込まれている藻類。この方法は、染色前に細胞膜と蛍光強度測定中に試料容量を増加させる96ウェルマイクロプレートを透過性にするために、エタノール、比較的穏やかな溶媒を使用する。それがデザインされているバイオプロセスのパフォーマンスを監視する特定のアプリケーションに編成長している培養物から、以前に乾燥されたサンプルやライブのサンプルをアッセイに使用することができます。
Introduction
による一定のストレス条件下で脂質体を格納するためのそれらの能力のために、藻類は、潜在的な再生可能な燃料源1,2として近年注目を集めている。中性脂質は、適切な成長条件3の下で細胞乾燥重量の60％以上を占めることができます。しかし業界では、適切にバイオプロセスのパフォーマンスを監視するために、藻類の細胞の脂質含有量を定量文化を分析し、新しい株をスクリーニングするために、シンプルなきれいな、迅速で、信頼性の高い標準化されたプロトコルを持っていません。
ブライ·ダイアー重量法は、いくつかの50年前に開発、現在4,5使用される最も一般的な技術の中に残っている。この手順は、単純で信頼性が高く、実施が容易であるが、それは時間がかかり、大量の試料を必要とし、有毒な溶媒を使用する。これは、発酵実行から多くのサンプルを分析したり、新しい油を多く含む株をスクリーニングするための実用的ではありません。他の方法は、bは有するEENを開発するが、通常は先進的な設備を必要とし、6を標準化されていない。
大きな関心を集めている選択肢は、ナイルレッド染色である。ナイルレッド、非極性環境で優先的蛍光を発する染料は、線虫7、8、酵母、細菌9、10-19および藻類を含む様々な生物における脂質体を同定または定量するために使用されている。ナイルレッドを含む初期の技術は、単一キュベット分光光度法、またはフローサイトメトリー染色を組み合わせて、主に定性的または半定量的であった。また、このような緑藻類などの藻類のいくつかのクラスは、技術10の範囲が制限されて染料に大部分が不透過性で厚い細胞井戸を持っている。
ナイルレッド染色法への最近の改善は、プロトコル10,11の初期の欠点をバイパスすることが報告されている。カーの存在下で細胞を染色するIERは、DMSOの10系溶媒またはエタノール10,11は、信頼性の高い定量的な測定を可能にし、油含有量と吸光度との関係を線形化する。溶媒は、ナイルレッド分子が通過できるように、細胞膜を透過性にするのに役立ちます。さらに、マイクロプレート読み取り機能を備えた分光光度計を組み込むこと定量分析に適した高スループットプロトコルを可能にする。
この記事の我々の詳細にエタノール、穏やかな溶媒の存在下でナイルレッドと文化を染色することにより、藻の油含有量を測定するための簡単な方法。最も正確にするために、測定におけるバックグラウンドノイズを考慮し、油含有量を蛍光強度を相関させる標準曲線は、既知油組成物の藻類細胞を用いて現像される。この方法は、以前公開されたプロトコル10,11から採用されている。 96ウェル分光光度計を使用することにより、時間の股関節内のサンプルと同じ量を分析することができるTは、重量法により監視するために何日もかかるでしょう。さらに、所望藻類種の代表的なサンプルを使用して校正することにより、このメソッドを直接解釈可能である比較的正確な測定値を生成します。異なる株およびアプリケーション向けに最適化されたナイルレッドで藻類を染色する方法を概説し、多くのプロトコルが存在する;ここで紹介するプロトコルは、もともとデラHOZまちがいなくらによって開発されました。Auxenochlorellaのprotothecoides、クロレラ·ブルガリス 、 セネデスムスのdimorphus、及びセネデスムス斜ための11を 、それがより多くの種やクラスのための可能性が適しているが。これは、監視、バイオプロセスのパフォーマンスの特定のアプリケーションで設計されており、それが成長している培養物から、以前に乾燥した試料と湿潤試料でも同様に動作します。
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Protocol
1。乾燥藻類バイオマスの分離は、蛍光読み取りのための基準として使用されるように
- 乾燥バイオマスの少なくとも200ミリグラムを提供する成長藻類培養物からの試料体積を取り外し、400〜600 mgのが好ましい。
- 万X gで10分間4℃で遠心分離サンプル。上澄み液を捨て、増殖培地と同じpHに策定リン酸緩衝液等容量のペレットを洗浄。
- 3回の洗浄工程の全体について、手順1.2。
- 再懸濁脱イオン水でペレットを皿の重量を量る予め秤量しに転送。 48時間50℃で乾燥させます。 NOTE：真空下で乾燥すると、乾燥時間を減少し、50°C以上の温度で培養物を乾燥させて再懸濁が困難になることができる。
- 将来の使用のために室温で保存して乾燥させ、藻類培養。
ヘキサン抽出による中性脂質の2。重量測定定量（ブライとダイアー4より）
- 量る皿に乾燥藻類バイオマスの約50ミリグラムを測定します。 NOTE：40〜80 mgの範囲の質量は、再現性を失うことなく使用することができる。
- ヘキサンで予め洗浄乳鉢にバイオマスを転送します。必要であれば、完全に乳鉢にバイオマスを転送するために、パスツールピペットを用いて少量のヘキサン（1ml）で秤量皿を洗浄する。注：ヘキサン揮発性の高い有毒物質である。それは適切な防護服とドラフト内で処理する必要があります。
- 乳棒を用いて5分間藻類バイオマスを挽く。穏やかな研削で始まり、徐々に強度を増加させる。 5分間で、微細で滑らかなペースト状にバイオマスを挽く。乳鉢にバイオマスを転送する際に、過剰のヘキサンを使用する場合は、ヘキサン、研削前に蒸発するのを待つのが最善である。
- それが均質化されるまで、乳鉢にヘキサン数mlを加え、乳棒で得られたスラリーを混合する。すべての細胞破片がMORの壁に付着していることを確認してくださいタールは、遊離ノックして、液体中に懸濁する。
- 遠心管にヘキサン細胞量混合物を転送します。注：遠心管は、ガラスやテフロンなどヘキサンと互換性の適切なポリマーのいずれかである必要があります。
- すべてのバイオマスが遠心管（3-5X）に転送されるまで繰り返します2.4と2.5を繰り返します。
- 遠心10,000倍gで20分間4℃で試料。
- 慎重に、予め秤量した金属の皿の重さに、上清をピペットで。ドラフト内で保管してください。
- ペレットにヘキサンの3ミリリットルを加えて、1分間激しくボルテックスして2 回目のヘキサン抽出を行う。
- 繰り返します2.7と2.8を繰り返します。必要に応じて、すべての細胞破片が完全に安定することを確認するために第二の抽出の際に遠心分離器で30分間のサンプルを実行します。ヘキサンが完全に蒸発した後に重量測定抽出された油の質量を決定する。
ナイルレッドを使用した中性脂質の3。蛍光定量（Reporとしてテッド·デ·ラ·HOZまちがいなくら 11による）
注：5グラム/ Lの藻類懸濁液のみ10μlの蛍光読み取りのために必要とされる。一般的には、培養液の1.5ミリリットルから乾燥藻バイオマスの分離は十分ではありません。また、分光光度計でのランプの光強度は経時的に分解することができる。これは、機器の変化が測定値に不必要なエラーを追加しないことを保証するためにすべての実験で基準を含めることをお勧めします。
- アルコール試薬グレードのエタノールに溶解した10μgの/ mlの濃度でナイルレッド溶液を調製する。 4℃の暗所でこのソリューションを保存する
- 4℃の脱イオン水およびストア内の30％（v / v）エタノール溶液を調製
- 同じバイオマス濃度全く藻類のサンプルを準備します（5グラム/ Lをお勧めします）と測定で使用される規格と同様に。適切な量のいずれかで中断予備乾燥したサンプルでこれを行うリン酸緩衝液（0.6グラム/ Lのリン酸カリウム二塩基、1.4グラム/ Lのリン酸二水素カリウム）、または濁度を測定した後、リン酸緩衝液では5g / Lまで成長藻類培養物の濃度を調整する。注：ライブ藻類培養物に対して実行される測定は、多くの場合、濁度検量線の精度によって、それらに関連する大きな誤差を持つことになります。乾燥サンプルを再懸濁する完全にバイオマスを分散させるホモジナイザの使用を必要とし得る。
- 各サンプルについて、96ウェルプレートの単一のウェル中の30％エタノール溶液80μL、ナイルレッド溶液10μl、および藻類懸濁液10μlを混ぜて。適切に蛍光測定のばらつきを考慮するために、各試料の5回の反復を実行する。
- 楽器と準備中の日々の変動を考慮するために、以前に調製した標準との2点較正曲線を実行します。秒を用いた蛍光測定のための標準を調製サンプルとしてAME手順。注：一般的に2つの点が、機器の再校正のために十分である、3点が直線性を検証するために実行することができます。
- マルチウェルプレートリーダー分光光度計で蛍光測定を行う。以下の条件が最も安定した結果11が得られることが分かった。
- 30秒間、1,200 rpmで、軌道3ミリメートルで振る。
- 10分間40℃でインキュベートする。
- 30秒間、1,200 rpmで、軌道3ミリメートルで振る。
- レコード蛍光、530nmでの励起、604 nmでの発光。
- 蛍光測定は、内部標準からの結果を使用して、油含有量へ変換する。
4。蛍光顕微鏡法
NOTE：項3に記載の染色プロトコルは、定量分析のために設計され、それはまた、教育、例示puのための染色に基づいた技術の視覚表現を提供するのに有用であり得るrposes。サンプルの蛍光1の画像を生成するためには、従来の伝送および追加の落射蛍光照明光源と光学顕微鏡を必要とします。 530ナノメートル（緑）、604ナノメートル（赤）の範囲内の励起および発光光フィルターは、それぞれ、ナイルレッド染色だけでなく、関連するソフトウェアを有する顕微鏡に取り付けられたカメラのために必要とされる。この研究（ 図1）に示す画像は、RGB変換部にモノクロカメラとを備えた明視野顕微鏡を用いて取得した。これらのツールを使用してナイルレッド蛍光画像を生成するための手順を以下に概説する。
- プロトコルのセクション3に係るナイルレッド染色で培養試料を準備します。 NOTE：5g / Lの濃度範囲の試料が過密することなく、適切な細胞密度のスライドを生成する。
- 染色プロトコールのステップ3.6を完了した後、標準的な実験手順に従って処理された試料の顕微鏡スライドを準備する。
- 透過モードで顕微鏡を皮切りに、顕微鏡にプレパラートをロードし、（この記事に示されている画像は、100Xの目的で取得された）所望の倍率で細胞を探します。
- 集中すると、落射蛍光照明モードへの送信から顕微鏡を切り替える。光源は、現在の対物レンズ（このスライドと対物レンズとの間の空間を観察することによって視覚的に確認することができる）から直接来るべきである。
- 観察光路に、光源と、赤色発光フィルタに緑色励起フィルターを挿入する;染色された細胞の蛍光は、今接眼レンズを介して直接表示されるはずです。
- 車載カメラに接眼から顕微鏡観察モードを切り替えて蛍光を発する細胞の画像をキャプチャするために閲覧ソフトウェアを使用しています。カメラの感度に応じて、サンプルが最初に（ つまり画面の意志プレビューウィンドウに表示されない場合があります）黒;これを改善するために、細胞が見えるレベルまで露出時間やカメラのゲインを調整します。具体的な設定は、機器·設備、および細胞型によって変化するであろう。
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Representative Results
ナイルレッド染料で染色した代表的な藻体を図1に示されている。A. 図1の表示画像のパーツA及びB protothecoidesは非常に低い細胞内脂質の蓄積につながる、過剰窒素中で増殖させた。部品CとD、Aのサンプルにおける窒素制限下で増殖させprotothecoidesが示されている。透過照明の下では、細胞の脂質体は、それらが光沢のある円形の構造として表示され、細胞容積の大部分を構成し、図1C、注意深く検査して視覚化することができる。過剰の窒素中で増殖させた図1Aに示す細胞は、乾燥重量で5％の油であり、脂質体の有意なレベルを含んでいない。
適切な光条件下で示す場合には、これらのサンプルの差が拡大される。油の少ない細胞石油が豊富な細胞は、彼らが脂質体（ 図1D）を蓄積してきた鮮やかな橙赤色の輝きを表示しながら、暗い体（ 図1B）を有する蛍光リングとして表示されます。 図1Dには、細胞膜および他の細胞構造のかすかな蛍光を表示することがより困難である。ナイルレッドは、細胞膜および他の細胞構造は、分光光度計の測定中に蛍光のバックグラウンドレベルを提供する理由である、非極性タンパク質の存在、ならびに脂質中に蛍光を発する。
アッセイの最適化された条件下で、0.980よりも大きいR 2値と検量線（ 図2A）は、容易に達成可能である。細胞は、エタノールなどの溶媒担体を欠く溶液で染色されている場合、セル油含有量と蛍光との関係が非線形になる。 0.395のR 2を有する図2Bに示されたデータは、であった 60、0％エタノール溶液（純粋な脱イオン水）中のプロトコルを実施することにより得られる。
図1。Aの画像ナイルレッドで染色protothecoides。油の少ないサンプル（乾燥重量で4.4％の油含有）Aの下に表示されている）、透過光顕微鏡およびB）、緑色励起フィルター（510 nm）を持つエピ蛍光照明。ナイルレッドで染色された脂質体は、604 nmで蛍光を発する。油に富む試料（乾燥重量で54.7％オイル含有）は、それぞれ、同一の送信され、落射光Aなどの条件）及びB）の下でC）およびD）に示されている。NK」>拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図2 A.の油含有量を相関させる較正曲線protothecoides蛍光強度にする。A）において、試料は、記載されるプロトコルに従って調製した。 B）において、サンプルは、0％エタノール溶液（脱イオン水）中で調製した。垂直のエラーバーは、分光光度計で5回の反復の標準偏差を表す。水平エラーバーは、中性脂質の重量測定定量化から少なくとも3回の反復の標準偏差を報告します。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
| ケミカル | 会社 | 濃度 |
| KH 2 PO 4 | フィッシャー·サイエンティフィック | 2.8グラム·L -1 |
| K 2 HPO 4 | フィッシャー·サイエンティフィック | 1.2グラム·L -1 |
| 硫酸マグネシウム·7H 2 O | フィッシャー·サイエンティフィック | 1.2グラム·L -1 |
| のFeSO 4·7H 2 O | フィッシャー·サイエンティフィック</ TD> | 48ミリグラム·L -1 |
| H 3 BO 3 | フィッシャー·サイエンティフィック | 11.6ミリグラム·L -1 |
| のCaCl 2·2H 2 O | フィッシャー·サイエンティフィック | 10ミリグラム·L -1 |
| のMnCl 2·4H 2 O | フィッシャー·サイエンティフィック | 7.2グラム·L -1 |
| のZnSO 4·7H 2 O | フィッシャー·サイエンティフィック | 0.88ミリグラム·L -1 |
| のCuSO 4·5H 2 O | FIS彼女の科学 | 0.32ミリグラム·L -1 |
| のNa 2のMoO 4·4H 2 O | フィッシャー·サイエンティフィック | 0.12μgの·L -1 |
| チアミン塩酸塩 | フィッシャー·サイエンティフィック | 40μgの·L -1 |
| グルコース | フィッシャー·サイエンティフィック | 30グラム·L -1 |
| グリシン | フィッシャー·サイエンティフィック | 0.2〜2.0グラム·L -1 |
表1培養培地レシピ。全ての試薬 は分析グレードであった。溶液は、脱イオン水を用いて調製した。グリシン濃度は、培養中の窒素比および藻類の結果として、最終的な油含有量の炭素を制御するために使用した。 8.5％の質量（乾燥ベース）55質量％の中性脂質含有量の範囲の細胞を、標準曲線を作製するために使用した。
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Discussion
標準曲線に使用される藻類は測定されているものと同じ実験条件下で栽培し、同じ種でなければなりません。有意な培地組成の変化、栽培技術、および染色プロトコルが蛍光読み取りの強度に影響を与えることができる。 （セクション1および2に記載されている）ヘキサン抽出は、標準曲線に使用した試料の中性脂質含量を測定した。正確な蛍光強度測定のために、すべてのサンプルが同じバイオマス濃度（5g / Lのは、この研究で使用した）で分析しなければならない。油含有量は、次に簡単に標準曲線と比較することによって決定することができる。このプロトコルについては、藻類は、窒素源（0.2〜2.0グラム/ L）等の炭素源（30グラム/ L）及びグリシンなどのグルコースを含む従属栄養条件（28℃、100rpmで）の下で振盪フラスコ中で培養した。詳細なメディアのレシピについては、 表1を参照してください。
実施する際の重要な考慮事項プロトコルは、標準曲線を調製する際にウェット藻類バイオマスを乾燥するための条件である。 45℃の真空オーブンを推奨します。 45〜50℃で、従来のオーブンもあれば、追加の時間が完全にサンプル（24〜48時間）乾燥させるよう十分である。 50℃以上の温度がバイオマスが融合し、または容易にリン酸緩衝液に再懸濁しない不可解な地殻を形成する可能性があります。再懸濁は、ホモジナイザーを用いて支援してもよい。これらは通常、蛍光読み取りに影響を与えるような界面活性剤や強塩基などの化学添加物は避けるべきである。乾燥した培養物は、有意な脂質分解を経験することなく密閉容器内の6ヶ月まで保存することができる。ライブ藻類培養物に対して実行される測定は、多くの場合、濁度検量線の精度によって、それらに関連する大きな誤差を持っていることに注意してください。
別の考慮事項は、SAMPを実行するために使用されるエタノール濃度であるレマイクロプレートリーダーである。エタノールは、細胞内にナイルレッド分子の輸送を容易に、キャリア溶媒として機能します。低濃度（<30％）の油含有量と蛍光との間の関係は、細胞膜（ 図2B）を横切っ乏しい拡散に非線形になる。改善された線形性が低下し、蛍光強度（ 図2A）を犠牲にして得られるより高いエタノール濃度で。Auxenochlorellaのprotothecoides、クロレラ·ブルガリス 、 セネデスムスdimorphus、及びセネデスムス斜については、30％のエタノール濃度は、最適なトレードオフを与えることが見出された改善された線形性との間の蛍光強度11を減少させた。これは、他の生物についての結果を最適化するために、エタノール濃度を調整する必要があり得る。
藻類の試料で蛍光を読み取るための適切な励起および発光波長を選択することがensuに不可欠である唯一の中性脂質再測定に含まれています。ナイルレッドの蛍光強度は、環境11,13の極性に依存して異なる波長で変化するであろう。 A用protothecoides、中性脂質のための発光ピークは590nmで観察される。より多くの極性脂質を代表する二次ピークが645 nmの11で観察することができます。従って、この手順で概説した蛍光強度の測定は、半値幅= 10nmので、ハーフバンド幅= 10nmであり、604 nm放射フィルターを用いて、530 nm励起フィルターを使用して行った。励起および発光波長の選択は、試験したすべての藻類の株について確認する必要があります。
ナイルレッドは、任意の非極性環境中で蛍光を発するので、脂質体に加えて、細胞構造（ 図1B参照 ）分光光度計によって検出される。この事実は、細胞バイオマスの固有の不均一性と組み合わせて、の間の非線形な関係をもたらす細胞バイオマスおよび蛍光11。この問題は、すべてのサンプルが一定の乾燥重量（5g / Lの推奨）で用意して確保することによって解決される。希薄な濃度で信号がかすかになり、その傾向は区別しにくい。さらに、蛍光シグナルは、培地中の細胞から細胞への変形および粒子懸濁液にノイジーであることができる。その結果、各試料の5回の反復は、信頼性の高い結果11をお勧めします。
いくつかのプロトコルは、このような測定10,20,21を校正するトリオレインなどのオイル規格を使用しています。この技術は、例えば、 珪藻等の藻類及び渦鞭のある種の成功が報告されているが、それは、細胞膜を通過する拡散の制限のようなクロレラのような厚肉の藻類にはあまり適していない。さらに、トリオレインを添加すると、Tをリードする、標準および脂質体間のナイルレッド分子の分布を乱すこと油含有量の不正確な推定O。標準として知られている油分藻類のサンプルを使用すると、これらの潜在的な不足を回避し、バイオマスと成長条件によって生じるバックグラウンド蛍光を占めています。
本研究で提示プロトコルは、藻類のサンプル中の中性脂質を定量化する、単純な、安価で迅速な方法を提供します。マルチウェルプレートを用いることにより、高い試料スループットは、他の染色プロトコル上で大幅な時間の節約で達成される。また、アッセイの条件が再現可能な線形トレンドを得るために最適化されている。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
著者らは、このプロジェクトのための財政支援を提供するための自然科学とカナダの工学研究評議会に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dry Weight | |||
| 25 ml disposable pipettes | Fisher | 13-676-10K | |
| Pipette Bulb | Fisher | 13-681-51 | |
| 40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes | Fisher | 05-562-16A | Teflon needed for hexane |
| Weigh Dishes (polypropylene) | Fisher | 2-202B | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Centrifuge | Sorvall | RC6plus | |
| Drying Oven (Fisher 625D) | Fisher | 13-254-2 | |
| Storage vials | Fisher | 0337-4 | |
| Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D) | Fisher | 05-40-100 | |
| Gravimetric Quantification | |||
| Porcelain Mortar (Coorstek) | Fisher | 12-961A | |
| Porcelain Pestle (Coorstek) | Fisher | 12-961-5A | |
| 40 ml Centrifugation tubes (FEP) | Fisher | 05-562-16A | Could also use glass tubes |
| Pasteur glass pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Aluminum weigh dishes | Fisher | 08-732-101 | |
| Hexanes | Fisher | H292-4 | |
| Fluorometric quantification of oil content | |||
| Fluorescence multi-well plate reader | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
| Fluorescence reader software | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
| COSTAR 96 well plate with round bottom | Fisher | 06-443-2 | |
| Nile Red | Sigma | N3013-100MG | |
| Ethanol (alcohol reagent grade) | Fisher | AC65109-0020 | |
| Imaging Fluorescent cells | |||
| Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope | Leica | DMRXA2 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Microscope cover slips | Fisher | 12-541B | |
| Camera | Qimaging | Retiga Ex | |
| Imaging software | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |
References
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