Summary
Простой протокол для определения нейтрального содержания жиров водорослевых клеток, используя процедуру Нил красные пятна описывается. Это экономия времени техника предлагает альтернативу традиционным гравиметрических основе липидов протоколов количественного. Она была разработана для конкретного применения мониторинга производительности биотехнологических.
Abstract
Водоросли считаются превосходными кандидатами для возобновляемых источников топлива из-за их природных возможностей хранения липидов. Прочная мониторинг водорослей процессов брожения и скрининга новых богатых нефтью штаммов требуется быстрый и надежный протокол для определения внутриклеточного содержания липидов. Существующие методы полагаться в значительной степени от гравиметрических методов определения содержания масла, методы, разработанные десятилетий назад, что занимает много времени и требует больших объемов образцов. В данной работе, Нил красный, флуоресцентный краситель, который был использован для идентификации присутствия липидов органов в многочисленных видов организмов, включена в простой, быстрой и надежной протокола для измерения нейтрального содержания жиров Auxenochlorella protothecoides, зеленый водоросли. Метод использует этанол, относительно мягкий растворитель, чтобы проницаемыми клеточную мембрану перед окрашиванием и 96 также микро-пластина для увеличения потенциала образца в процессе измерений интенсивности флуоресценции. Это был дизайнред с конкретного применения мониторинга производительности биотехнологических. Ранее высушенные образцы или живые образцы из растущей культуры могут быть использованы в анализе.
Introduction
Благодаря своей способности хранить липидов тела при определенных условиях стресса, водоросли получили большое внимание в последние годы в качестве потенциального источника возобновляемой топливной 1,2. Нейтральные липиды могут составлять более 60% от сухого веса клеток при соответствующих условиях роста 3. Тем не менее, промышленность не есть простой, чистый, быстрый и надежный стандартный протокол для количественного содержания жиров водорослевых клеток для того, чтобы должным образом контролировать работу Биопроцесс, анализа культур, и на экране, новых штаммов.
Гравиметрический метод Блай-Дайер разработан около 50 лет назад, остается одним из наиболее распространенных методов, используемых сегодня 4,5. Хотя эта процедура проста, надежна и легко осуществить, это отнимает много времени, требует больших объемов выборки, и делает использование токсичных растворителей. Это не практично для анализа много образцов из ферментации или скрининг для новых богатых нефтью штаммов. Другие методы бееп разработан, но, как правило, требуют современного оборудования и не были стандартизированы 6.
Альтернатива, которая собрала большое интерес представляет Нил красное пятно. Нил красный, краситель, который флуоресцирует преимущественно в неполярных средах, была использована для идентификации или количественной липидов тела в различных организмов, включая нематод 7, дрожжей 8, бактерий 9 и водорослей 10-19. Первоначальные методы с участием Нила Red были в основном качественными или полуколичественный, сочетая пятно с одной кюветы спектрофотометрии или проточной цитометрии. Кроме того, некоторые классы водорослей, таких как зеленые водоросли имеют толстые клеточные скважин, которые в основном непроницаемым для краски, что ограничивало диапазон технике 10.
Последние улучшения в методе Нил Красной окрашивания сообщалось, что обойти начальные недостатки протокола 10,11. Окрашивание клеток в присутствии CarrИОС растворителе, таком как ДМСО или этаноле 10 10,11 линеаризует взаимосвязь между содержанием масла и абсорбции, что позволяет надежных количественных измерений. Растворитель помогает проницаемыми клеточную мембрану так, что молекулы Нил Красные может пройти. Кроме того, включение спектрофотометра с возможностью считывания микро-пластин обеспечивает высокую пропускную способность протоколы, подходящие для количественного анализа.
В этой статье мы подробно простой метод для измерения содержания нефти в клетках водорослей путем окрашивания культур с Нила красный в присутствии этанола, мягким растворителем. Для того, чтобы наиболее точно учитывать фонового шума в измерениях, стандартная кривая корреляции интенсивности флуоресценции для содержания масла разработан с использованием водорослей клетки известного состава нефти. Метод заимствован из ранее опубликованных протоколов 10,11. С помощью спектрофотометра 96-луночный, один способен анализировать такое же количество образцов в час тхат бы занять несколько дней, чтобы следить по гравиметрических методов. Кроме того, при калибровке с использованием репрезентативных образцов желаемого вида водорослей этот метод производит относительно точные измерения, которые непосредственно интерпретировать. Там существует много протоколов с изложением методов окрашивания водоросли с видом на Нил красный, оптимизированный для различных штаммов и приложений; Протокол, представленные здесь был первоначально разработан де ла Ос Siegler др.. 11 для Auxenochlorella protothecoides, хлорелла, Scenedesmus dimorphus и Scenedesmus Obliquus, хотя вполне вероятно, подходит для многих больше видов и классов. Она была разработана с конкретного применения мониторинга производительности биотехнологических и она работает одинаково хорошо для ранее высушенных образцов и влажных образцов из растущего культуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Выделение сухой биомассы водорослей для использования в качестве стандартов для флуоресценции чтений
- Удаление объем пробы из растущей культуры водорослей, который будет обеспечивать, по меньшей мере 200 мг сухой биомассы, 400-600 мг является предпочтительным.
- Центрифуга образца при температуре 4 ° С в течение 10 мин при 10000 х г. Жидкость над осадком сливают и промывают осадок с равным объемом фосфатного буфера, сформулированной в то же, что и рН питательной среды.
- Повторите шаг 1.2 для в общей сложности 3 стадий промывки.
- Повторное приостановить осадок в деионизированной воды и трансфер в предварительно взвешенную весят блюдо. Пусть сухой при 50 ° С в течение 48 часов. Примечание: сушки в вакууме уменьшится время сушки и сушки культуру при температуре выше 50 ° С может сделать ресуспендирования трудно.
- Магазин сушат Культуры водорослей при комнатной температуре для дальнейшего использования.
2. Гравиметрическое Количественное определение нейтральных липидов гексаном Добыча (адаптировано из Блай и Дайер 4)
- Измерьте приблизительно 50 мг сухой биомассы водорослей в весовой блюдо. Примечание: массой от 40-80 мг может быть использована без потери воспроизводимостью.
- Передача биомассы в ступке, предварительно промытого гексаном. При необходимости промывать взвешивания блюдо с небольшим количеством (1 мл) гексана с помощью пипетки Пастера, чтобы полностью передать биомассы в ступке. ПРИМЕЧАНИЕ: гексан является крайне нестабильной и токсичным веществом. Это должны быть обработаны в вытяжной шкаф с надлежащей защитной одежды.
- Измельчить биомассы водорослей в течение 5 мин с помощью пестика. Начните с бережного измельчения и постепенно увеличивать интенсивность. Измельчить биомассы в виде штрафа и однородной массы в течение 5 минут. Если избыток гексан используется при передаче биомассы в ступке, то лучше подождать гексан испариться перед шлифованием.
- Добавить несколько мл гексана в ступке и смешать полученной суспензии с пестиком, пока она не гомогенизируют. Убедитесь, что все остатки клеток прилипают к стенкам мортар выбиваются бесплатно и взвешенных в жидкости.
- Передача массовое смесь гексан-клеток в центрифужную пробирку. Примечание: центрифужные пробирки должны быть либо стекло или полимер подходит совместимы с гексаном, таких как тефлон.
- Повторите шаги 2.4 и 2.5, пока вся биомасса не были переданы в центрифуге трубки (3-5х).
- Центрифуга образца при температуре 4 ° С в течение 20 мин при 10000 х г.
- Тщательно пипетки надосадочную жидкость в предварительно взвешенную металла взвешивания блюдо. Храните в вытяжной шкаф.
- Выполните извлечение 2-й гексан добавлением 3 мл гексана к осадку и энергично вортексе в течение 1 мин.
- Повторите шаги 2.7 и 2.8. При необходимости выполнения образцов в течение 30 мин в центрифуге в течение второй экстракции, чтобы обеспечить все остатки клеток полностью решает. Определите массу нефти, добываемой гравиметрически после гексан высох.
3. Флуорометрический Количественное определение нейтральных липидов Использование Нила красный (как ReporТед по де ла Ос Siegler др.. 11)
ПРИМЕЧАНИЕ: Только 10 мкл в суспензии водорослей на 5 г / л необходим для чтения флуоресценции. Как правило, изоляция сухой биомассы водорослей от 1,5 мл культуральной жидкости более чем достаточно. Кроме того, интенсивность света лампы в спектрофотометра может со временем ухудшаться. Рекомендуется включить стандарты в каждом эксперименте для того, чтобы изменения в приборе не добавлять ненужные ошибки в измерениях.
- Готовят раствор Нил Красное при концентрации 10 мкг / мл, растворенных в спирт реагентной степени чистоты этанола. Храните это решение в темноте при 4 ° С.
- Подготовка 30% (объем / объем) этанола раствор в деионизированной воде и хранить при температуре 4 ° С.
- Подготовка всех образцов водорослей в той же концентрации биомассы (5 г / л рекомендуется) и таким же образом, как стандартами, используемыми в измерении. Сделать это, либо суспендирующими предварительно высушенных образцов в соответствующем количествефосфатного буфера (0,6 г / л двухосновной фосфат калия, 1,4 г / л фосфата одноосновного калия), или регулирования концентрации растущей культуре водорослей до 5 г / л фосфатным буфером после измерения мутности. ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения, проведенные на живых водорослей культур часто имеют большую погрешность, связанную с ними в зависимости от точности калибровки мутности кривой. Ресуспендирования высушенных образцов может потребоваться использование гомогенизатора, чтобы полностью диспергировать биомассу.
- Для каждого образца, смешать 80 мкл 30% раствора этанола, 10 мкл Нил красный раствор, и 10 мкл суспензии водорослей в одном лунку 96-луночного планшета. Для того чтобы правильно учесть изменчивость измерения флуоресценции, выполните 5 повторов каждого образца.
- Запустите калибровочной кривой по двум точкам с стандартов, разработанных ранее для того, чтобы учесть изо дня в день изменений в приборе и подготовки. Подготовка стандартов для измерения флуоресценции с помощью SAme процедура, как образцы. ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило две точки достаточно для калибровки прибора, три очка могут быть запущены, чтобы проверить линейность.
- Выполните измерения флуоресценции в мульти-а планшет-ридер спектрофотометра в. Следующие условия были найдены, чтобы получить наиболее последовательные результаты 11:
- Встряхнуть в 1200 оборотов в минуту, орбита 3 мм, в течение 30 сек.
- Инкубировать при 40 ° С в течение 10 мин.
- Встряхнуть в 1200 оборотов в минуту, орбита 3 мм, в течение 30 сек.
- Запись флуоресценции, возбуждения при 530 нм, эмиссия при 604 нм.
- Преобразование измерения флуоресценции к содержимому нефти с использованием результатов от внутренних стандартов.
4. Флуоресцентной микроскопии Техника
Примечание: Протокол окрашивания описано в разделе 3 предназначен для количественного анализа, но он также может быть полезен для обеспечения визуального представления методов окраски основе по учебно-иллюстративный о.е.rposes. Для получения изображений образца флуоресценции одной требуется оптического микроскопа с традиционными передачи и дополнительное освещение эпифлуоресцентная источников. Возбуждения и эмиссии светофильтры в 530 нм (зеленый) и 604 нм (красный) диапазоне, соответственно, нужны для Нила красное пятно, а также предметное смонтированного камеры с соответствующим программным обеспечением. Изображения, приведенные в этом исследовании (рис. 1) были получены с помощью ярко-поле микроскопа, оборудованного с камерой и Monochrome к RGB конвертер блока. Процедура для получения флуоресцентных изображений Нил Красные использовании этих инструментов приводится ниже:
- Подготовьте образец культуры с Нила красное пятно в соответствии с разделом 3 протокола. ПРИМЕЧАНИЕ: образец в 5 г / л диапазоне концентраций производит слайды адекватной плотности клеток без переполненности.
- После выполнения шага 3.6 протокола окрашивания, подготовить микроскопа обрабатываемого образца в соответствии со стандартными лабораторных процедур.
- Начиная с микроскопом в режиме передачи, загрузите подготовленный слайд в микроскоп, и найдите клетки в нужной увеличением (изображения показаны в этой статье были приобретены с целью 100X).
- После фокусировки, переключите микроскоп от передачи в режим освещения эпифлуоресцентной. В качестве источника света должны теперь приходить непосредственно с объектива (это может быть подтверждено визуально наблюдая пространство между горкой и объектива).
- Вставьте зеленый фильтр возбуждения на источник света и красным фильтром твердых в пути на наблюдение света; флуоресценция окрашенных клеток теперь должны быть видны непосредственно через окуляр.
- Переключение режима микроскоп наблюдения от окуляра до смонтированного камеры и использовать программное обеспечение для просмотра, чтобы захватить изображение из флуоресцирующих клеток. В зависимости от чувствительности камеры, образец не может изначально появится в окне предварительного просмотра (т.е. на экране будетбыть черным); чтобы исправить это, регулировать время экспозиции и усиления камеры до уровня, когда видны клетки. Конкретные параметры будут меняться в зависимости от инструментов, оборудования и типов клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представительства клетки водорослей окрашенные Нил Красного красителя изображены на рисунке 1. Части А и В из рис. 1 отображения изображений А. protothecoides выросли в избытке азота, что приводит к очень низким накоплением внутриклеточного окисления липидов. В части С и D, образцов А. protothecoides выращенные под ограничения азота показаны. При освещении передачи, липидные тела клетки могут быть визуализированы с тщательного обследования фиг.1С, где они станут блестящими кольцевых структур и составляют большинство объема ячейки. Клетки, показанные на фиг.1А, которые были выращены в избытке азота, только 5% масла по сухой массе и не содержат значительных уровней липидов органов.
Когда показано при соответствующих условиях освещения, различия в этих образцов увеличивается. Нефтяные обедненной клеткипоявляются в качестве флуоресцентных колец с темных тел (рис. 1б) в то время как богатые нефтью клетки отображения яркий оранжево-красный жар, где они накопили липидов тела (рис. 1D). На фиг 1D, это более трудно увидеть слабый флуоресценцию клеточной мембраны и других клеточных структур. Нил Красный высветится в присутствии неполярных белков, а также липидов, именно поэтому мембрана клетки и другие клеточные структуры обеспечивают фоновый уровень флуоресценции во время измерений спектрофотометра.
Под оптимизированных условиях анализа, калибровочные кривые с R 2 значения большего, чем 0,980 легко достижимо (рис. 2А). Отношение между содержанием масла клеток и флуоресценции становится нелинейной если клетки окрашивали в растворе отсутствует носитель растворителе, таком как этанол. Данные, представленные на рисунке 2B, со R 2 из 0,395, были 60; получены путем проведения протокол в 0% раствора этанола (чистый деионизированной воды).
Рисунок 1. Изображения А. protothecoides окрашенные Нила красный. нефти худой образца (4,4% содержание масла на сухой вес) показано в разделе А) передается световой микроскопии и Б) эпифлуоресцентная света с зеленым фильтром возбуждения (510 нм). Липидные тела, окрашенные Нила красный флуоресцируют на 604 нм. Богатая нефтью образец (54,7% содержание масла на сухой вес) показана на C) и D) при тех же переданных и условиях эпифлуоресцентная легких как а) и б), соответственно.НК "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 2. Калибровочные кривые, коррелирующие содержание нефтепродуктов А. protothecoides к интенсивность флуоресценции. в), образцы были приготовлены в соответствии с описанным протоколом. В б) образцы были приготовлены в 0% раствора этанола (деионизированной воды). Вертикальные планки погрешностей представляют стандартное отклонение пяти повторов в спектрофотометра. Турники сообщить об ошибке стандартное отклонение по крайней мере, трех повторов с гравиметрической количественной оценки нейтральных липидов. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
| Химический | Компания | Концентрация |
| KH 2 PO 4 | Fisher Scientific | 2,8 г · л -1 |
| К 2 НРО 4 | Fisher Scientific | 1,2 г · л -1 |
| MgSO 4 · 7H 2 O | Fisher Scientific | 1,2 г · л -1 |
| FeSO 4 · 7H 2 O | Fisher Scientific </ TD> | 48 мг · л -1 |
| Н 3 ВО 3 | Fisher Scientific | 11.6 мг · л -1 |
| CaCl 2 · 2H 2 O | Fisher Scientific | 10 мг · л -1 |
| MnCl 2 · 4H 2 O | Fisher Scientific | 7,2 г · л -1 |
| ZnSO 4 · 7H 2 O | Fisher Scientific | 0,88 мг · л -1 |
| CuSO 4 · 5H 2 O | FisЕе научные | 0,32 мг · л -1 |
| Na 2 MoO 4 · 4H 2 O | Fisher Scientific | 0,12 мкг · л -1 |
| гидрохлорид тиамина | Fisher Scientific | 40 мкг · л -1 |
| глюкоза | Fisher Scientific | 30 г · л -1 |
| глицин | Fisher Scientific | 0,2-2,0 г · л -1 |
Культуральную среду рецепт Таблица 1.. Все реагенты были аналитической чистоты.Растворы готовили с использованием деионизированной воды. Концентрация глицина было использовать для управления отношение углерода к азоту в культуре и, следовательно, окончательное содержание масла из морских водорослей. Клетки, начиная от 8,5% до 55% нейтральном содержания липидов по массе (на сухое вещество) были использованы для изготовления стандартной кривой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Водоросли, используемый в стандартной кривой должен быть того же вида культивируют в тех же экспериментальных условиях, как и измеряется. Существенные изменения в составе средств массовой информации, техники выращивания, и протокола окрашивания может повлиять на интенсивность чтения флуоресценции. Экстракции гексаном (описано в разделах 1 и 2) был использован для определения нейтрального содержания липидов образцов, используемых в стандартной кривой. Для точного измерения интенсивности флуоресценции, все образцы должны быть проанализированы при той же концентрации биомассы (5 г / л была использована в данном исследовании). Содержание масла могут быть легко определены по сравнению со стандартной кривой. Для этого протокола, водоросли культивировали в колбах при гетеротрофных условиях (28 ° C, 100 оборотов в минуту) с глюкозой в качестве источника углерода (30 г / л) и глицина в качестве источника азота (0,2-2,0 г / л). Для детального медиа рецепт, см. таблицу 1.
Важным моментом в проведениипротокол условия для сушки влажной биомассы водорослей при подготовке стандартной кривой. Вакуумной печи при 45 ° С рекомендуется. Обычная печь при 45-50 ° С также достаточно тех пор, пока дополнительное время позволило полностью высохнуть образцов (24-48 ч). Температуры выше 50 ° С может привести к биомасса сливаются или образуют непроницаемую корку, которая не легко Ресуспендируют в фосфатный буфер. Ресуспендирование может быть оказана помощь с использованием гомогенизатора. Химические добавки, такие как поверхностно-активные вещества или сильным основанием, следует избегать, поскольку они обычно влияет на считывание флюоресценции. Сушеные культуры могут храниться до 6 месяцев в закрытой таре, не испытывая значительного ухудшения липидов. Обратите внимание, что измерения, выполненные на живых водорослей культур часто имеют большую погрешность, связанную с ними в зависимости от точности калибровки мутности кривой.
Другим аспектом является концентрация этанола используется для запуска SAMPле в считывающее устройство микро-пластины. Этанол действует как растворитель-носитель, облегчая транспорт Нил красных молекул в клетку. При низких концентрациях (<30%) взаимосвязь между содержанием масла и флуоресценции становится нелинейным из-за плохой диффузии через клеточную мембрану (рис. 2В). При более высоких концентрациях этанола, улучшена линейность получается за счет снизилась интенсивность флуоресценции (рис. 2а). Для Auxenochlorella protothecoides, хлорелла, Scenedesmus dimorphus и Scenedesmus косая, концентрация этанола в размере 30% был найден, чтобы дать Оптимальное соотношение между улучшает линейность и снижение интенсивности флуоресценции 11. Это может быть необходимо, чтобы отрегулировать концентрацию этанола, чтобы оптимизировать результаты для других организмов.
Выбор надлежащего возбуждения и испускания длины волн для чтения флуоресценцию в водорослевых образцов имеет решающее значение для ensuповторно только нейтральные липиды, включены в измерении. Интенсивность Нил красной флуоресценции будет варьироваться на разных длинах волн в зависимости от полярности среды 11,13. Для А. protothecoides, пик выбросов для нейтральных липидов наблюдается при 590 нм; вторичный пик, представляющий более полярные липиды могут наблюдаться при 645 нм 11. Следовательно, измерения интенсивности флуоресценции, изложенные в этой процедуре были проведены с использованием фильтра возбуждения в 530 нм с половиной полосы пропускания = 10 нм, и фильтром твердых в 604 нм с половины полосы пропускания = 10 нм. Выбор возбуждения и длины волны излучения должна быть уточнена для каждого водорослей штамма испытания.
Поскольку Нил Red будет флуоресцировать в любом неполярной среде, сотовые структуры в дополнение к липидных тел будет обнаружен с помощью спектрофотометра (см. рисунок 1b). Этот факт в сочетании с присущей неоднородности клеточной биомассы, приводит к нелинейной связи междуклеток биомассы и флуоресценции 11. Эта задача решается путем обеспечения все образцы получают при постоянной сухого веса (5 г / л рекомендуется). В разбавленных концентрациях сигнал становится слабым и тенденции ее трудно отличить. Кроме того, сигнал флуоресценции может быть шумным из-за клетки к клетке вариаций и суспензий частиц в средствах массовой информации. Следовательно, 5 повторов каждого образца рекомендуются для надежных результатов 11.
Некоторые протоколы используют стандарт масла, такие как триолеин для калибровки измерения 10,20,21. Хотя этот метод сообщается с успехом для некоторых видов водорослей, таких как Bacillariophyceae и Dinophyceae, меньше подходит для толстостенных водорослей, таких как хлореллы из-за ограничений диффузии через клеточную мембрану. Кроме того, добавление триолеина может нарушить распределение Нил Красные молекул между стандартом и липидов органов, ведущих туплотнительные неточные оценки содержания масла. Использование водорослей образцы с известным содержанием масла в качестве стандартов позволяет избежать этих потенциальных недостатков и учесть любое фоновой флуоресценции, вызванной биомассы и условий роста.
Протокол, представленные в данном исследовании обеспечивает простой, дешевый и быстрый метод количественной нейтральные липиды в водорослевых образцов. С помощью нескольких лунками с, высокой пропускной образца достигаются при значительной экономии времени по сравнению с другими протоколами окрашивания. Кроме того, условия анализа были оптимизированы, чтобы получить воспроизводимые линейные тенденции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить естественных и технических наук исследовательский совет Канады за предоставление финансовой поддержки для этого проекта.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dry Weight | |||
| 25 ml disposable pipettes | Fisher | 13-676-10K | |
| Pipette Bulb | Fisher | 13-681-51 | |
| 40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes | Fisher | 05-562-16A | Teflon needed for hexane |
| Weigh Dishes (polypropylene) | Fisher | 2-202B | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Centrifuge | Sorvall | RC6plus | |
| Drying Oven (Fisher 625D) | Fisher | 13-254-2 | |
| Storage vials | Fisher | 0337-4 | |
| Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D) | Fisher | 05-40-100 | |
| Gravimetric Quantification | |||
| Porcelain Mortar (Coorstek) | Fisher | 12-961A | |
| Porcelain Pestle (Coorstek) | Fisher | 12-961-5A | |
| 40 ml Centrifugation tubes (FEP) | Fisher | 05-562-16A | Could also use glass tubes |
| Pasteur glass pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Aluminum weigh dishes | Fisher | 08-732-101 | |
| Hexanes | Fisher | H292-4 | |
| Fluorometric quantification of oil content | |||
| Fluorescence multi-well plate reader | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
| Fluorescence reader software | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
| COSTAR 96 well plate with round bottom | Fisher | 06-443-2 | |
| Nile Red | Sigma | N3013-100MG | |
| Ethanol (alcohol reagent grade) | Fisher | AC65109-0020 | |
| Imaging Fluorescent cells | |||
| Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope | Leica | DMRXA2 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Microscope cover slips | Fisher | 12-541B | |
| Camera | Qimaging | Retiga Ex | |
| Imaging software | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |
References
- Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnol. Adv. 25, 294-306 (2007).
- National Algal Biofuels Technology Roadmap. Energy Efficiency & Renewable Energy. U.S. Department of Energy, Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, Biomass Program. , Available from: http://www1.eere.energy.gov/bioenergy/pdfs/algal_biofuels_roadmap.pdf (2010).
- de la Hoz Siegler, H., et al. Optimization of microalgal productivity using an adaptive, non-linear model based strategy. Bioresour. Technol. 104, 537-546 (2012).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Hara, A., Radin, N. S. Lipid extraction of tissues with a low-toxicity solvent. Anal. Biochem. 90, 420-426 (1978).
- Han, Y., et al. Review of methods used for microalgal lipid-content analysis. Energ. Procedia. 12, 944-950 (2011).
- Pino, E. C., et al. Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (73), (2013).
- Sitepu, I. R., et al. An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species. J. Microbiol. Meth. 91, 321-328 (2012).
- Izard, J., Limberger, R. J. Rapid screening method for quantitation of bacterial cell lipids from whole cells. J. Microbiol. Meth. 55, 411-418 (2003).
- Chen, W., et al. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. J. Microbiol. Meth. 77, 41-47 (2009).
- de la Hoz Siegler, H., et al. Improving the reliability of fluorescence-based neutral lipid content measurements in microalgal cultures. Algal Res. 1, 176-184 (2012).
- de la Jara, A., et al. Flow cytometric determination of lipid content in a marine dinoflagellate, Crypthecodinium cohnii. J. Appl. Phycol. 15, 433-438 (2003).
- Elsey, D., et al. Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids. J. Microbiol. Meth. 68, 639-642 (2007).
- Feng, G. -D., et al. Evaluation of FT-IR and Nile Red methods for microalgal lipid characterization and biomass composition determination. Bioresour. Technol. 128, 107-112 (2013).
- Guzmán, H., et al. Estimate by means of flow cytometry of variation in composition of fatty acids from Tetraselmis suecica in response to culture conditions. Aquacult. Int. 18, 189-199 (2010).
- Huang, G. -H., et al. Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence. Biomass Bioenerg. 33, 1386-1392 (2009).
- Lee, S., et al. Rapid method for the determination of lipid from the green alga Botryococcus braunii. Biotechnol. Tech. 12, 553-556 (1998).
- Montero, M., et al. Isolation of high-lipid content strains of the marine microalga Tetraselmis suecica for biodiesel production by flow cytometry and single-cell sorting. J. Appl. Phycol. 23, 1053-1057 (2011).
- Vigeolas, H., et al. Isolation and partial characterization of mutants with elevated lipid content in Chlorella sorokiniana and Scenedesmus obliquus. J. Biotechnol. 162, 3-12 (2012).
- Bertozzini, E., et al. Application of the standard addition method for the absolute quantification of neutral lipids in microalgae using Nile red. J. Microbiol. Meth. 87, 17-23 (2011).
- Kou, Z., et al. Fluorescent measurement of lipid content in the model organism Chlamydomonas reinhardtii. J. Appl. Phycol. , 1-9 (2013).
