Une simple et rapide Protocole de mesure de lipides neutres dans les cellules algales par fluorescence

Résumé

Un protocole simple de déterminer la teneur en lipide neutre de cellules d'algues en utilisant une procédure de coloration rouge Nil est décrite. Cette technique de gagner du temps offre une alternative aux protocoles de quantification des lipides traditionnels à base gravimétriques. Il a été conçu pour une application spécifique de la performance des bioprocédés de surveillance.

Résumé

Les algues sont considérés comme d'excellents candidats pour les sources de carburants renouvelables en raison de leurs capacités de stockage des lipides naturels. Un suivi rigoureux des processus de fermentation des algues et le dépistage de nouvelles souches riches en pétrole nécessite un protocole rapide et fiable pour la détermination de la teneur en lipides intracellulaires. Les pratiques actuelles reposent en grande partie sur les méthodes gravimétriques pour déterminer la teneur en huile, techniques développées il ya des décennies qui sont de temps et nécessitent de grands volumes d'échantillons. Dans le présent document, le rouge Nil, un colorant fluorescent qui a été utilisé pour identifier la présence de corps lipidiques dans de nombreux types d'organismes, est incorporé dans un protocole simple, rapide et fiable pour la mesure de la teneur en lipides neutres de protothecoides Auxenochlorella, un vert algue. Le procédé utilise de l'éthanol, un solvant relativement doux, pour perméabiliser la membrane cellulaire avant coloration et un puits de micro-plaques 96 pour augmenter la capacité de l'échantillon pendant les mesures d'intensité de fluorescence. Il a été la conceptioned à la demande spécifique de la performance des bioprocédés de surveillance. Échantillons préalablement séchés ou des échantillons vivants à partir d'une culture en croissance peuvent être utilisées dans le dosage.

Introduction

En raison de leur capacité à stocker corps lipidiques sous certaines conditions de stress, les algues ont reçu beaucoup d'attention ces dernières années comme une source de carburant renouvelable potentiel ^{de 1,2.} Lipides neutres peuvent représenter plus de 60% ​​du poids sec de la cellule dans des conditions de croissance appropriées ^3. Pourtant, l'industrie n'a pas de protocole simple, propre, rapide, fiable et standardisée pour quantifier la teneur en lipides des cellules d'algues afin de surveiller correctement le rendement des bioprocédés, analyser les cultures, et l'écran de nouvelles souches.

Protocole

1. Isolation de sec biomasse algale à servir de normes pour fluorescence Lectures

1. Supprimer un volume d'échantillon de la culture d'algues croissante qui fournira au moins 200 mg de biomasse sèche, 400-600 mg est préférable.
2. Extrait Centrifuger à 4 ° C pendant 10 min à 10 000 x g. Jeter le surnageant et laver le culot avec un volume égal de tampon phosphate formulé pour le même pH que le milieu de croissance.
3. Répétez l'étape 1.2 pour un total de 3 étapes de lavage.
4. Re-suspendre le culot dans de l'eau déminéralisée et transférer dans un plat préalablement pesé peser. Laissez sécher à 50 ° C pendant 48 heures. NO....

Résultats

Cellules d'algues représentatives colorées avec le colorant rouge Nil sont illustrés dans la Figure 1. Parties A et B de la figure 1 images d'affichage de A. protothecoides cultivées dans un excès d'azote, conduisant à très faible accumulation de lipides intracellulaires. Dans les parties C et D, des échantillons de A. protothecoides cultivées sous limitation d'azote sont présentés. Sou.......

Discussion

Les algues utilisées dans la courbe standard doit être les mêmes espèces cultivées dans les mêmes conditions expérimentales que celles qui sont mesurées. Des changements significatifs dans la composition du milieu, la technique de la culture, et le protocole de coloration peuvent influer sur l'intensité de la lecture de fluorescence. extraction à l'hexane (décrit dans les sections 1 et 2) a été utilisé pour déterminer la teneur en lipide neutre d'échantillons utilisés dans la courbe standard. Pour des mesure.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Poids
Pipettes jetables de 25 ml	Fisher	13-676-10K
Pipette à bulbe	Fisher	13-681-51
40 ml Tubes à centrifuger en téflon Nalgene	Fisher	05-562-16A	Téflon nécessaire pour l’hexane
Plateaux de pesée (polypropylène)	Fisher	2-202B
Microcentrifugeuse de 1,5 ml tubes	Fisher	05-408-129
Centrifugeuse	Sorvall	RC6plus
Étuve de séchage (Fisher 625D)	Fisher	13-254-2
Flacons de stockage	Fisher	0337-4
Microcentrifugeuse de paillasse (Eppendorf 5415D)	Fisher	05-40-100
Quantification
Mortier en porcelaine (Coorstek)	Fisher	12-961A
Pilon en porcelaine (Coorstek)	Fisher	12-961-5A
40 ml Tubes de centrifugation (FEP)	Fisher	05-562-16A	Peut également utiliser des tubes en verre
Pipettes en verre Pasteur	Fisher	13-678-20C
Plateaux de pesée en aluminium	Fisher	08-732-101
Hexanes	Fisher	H292-4
Quantification fluorométrique de la teneur en
Lecteur de plaques multipuits à fluorescence Thermo	Lab Systems	Fluoroskan Ascent
Logiciel de lecture de fluorescence	Thermo Lab Systems	Ascent Software 2.6
COSTAR 96 Plaque à fond rond	Fisher	06-443-2
Nile Red	Sigma	N3013-100MG
Éthanol (qualité réactif d’alcool)	Fisher	AC65109-0020
Imagerie Cellules
Microscope Leica DMRXA2 (ou équivalent)	Leica	DMRXA2
Lames de microscope	Fisher	12-550-15
Lames de microscope	Fisher	12-541B
Appareil photo	Qimaging	Retiga Ex
Logiciel d’imagerie	Qimaging	QCapture v.1.1.8

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