Summary
Un protocole simple de déterminer la teneur en lipide neutre de cellules d'algues en utilisant une procédure de coloration rouge Nil est décrite. Cette technique de gagner du temps offre une alternative aux protocoles de quantification des lipides traditionnels à base gravimétriques. Il a été conçu pour une application spécifique de la performance des bioprocédés de surveillance.
Abstract
Les algues sont considérés comme d'excellents candidats pour les sources de carburants renouvelables en raison de leurs capacités de stockage des lipides naturels. Un suivi rigoureux des processus de fermentation des algues et le dépistage de nouvelles souches riches en pétrole nécessite un protocole rapide et fiable pour la détermination de la teneur en lipides intracellulaires. Les pratiques actuelles reposent en grande partie sur les méthodes gravimétriques pour déterminer la teneur en huile, techniques développées il ya des décennies qui sont de temps et nécessitent de grands volumes d'échantillons. Dans le présent document, le rouge Nil, un colorant fluorescent qui a été utilisé pour identifier la présence de corps lipidiques dans de nombreux types d'organismes, est incorporé dans un protocole simple, rapide et fiable pour la mesure de la teneur en lipides neutres de protothecoides Auxenochlorella, un vert algue. Le procédé utilise de l'éthanol, un solvant relativement doux, pour perméabiliser la membrane cellulaire avant coloration et un puits de micro-plaques 96 pour augmenter la capacité de l'échantillon pendant les mesures d'intensité de fluorescence. Il a été la conceptioned à la demande spécifique de la performance des bioprocédés de surveillance. Échantillons préalablement séchés ou des échantillons vivants à partir d'une culture en croissance peuvent être utilisées dans le dosage.
Introduction
En raison de leur capacité à stocker corps lipidiques sous certaines conditions de stress, les algues ont reçu beaucoup d'attention ces dernières années comme une source de carburant renouvelable potentiel de 1,2. Lipides neutres peuvent représenter plus de 60% du poids sec de la cellule dans des conditions de croissance appropriées 3. Pourtant, l'industrie n'a pas de protocole simple, propre, rapide, fiable et standardisée pour quantifier la teneur en lipides des cellules d'algues afin de surveiller correctement le rendement des bioprocédés, analyser les cultures, et l'écran de nouvelles souches.
La méthode gravimétrique Bligh-Dyer développé il ya 50 ans reste parmi les techniques les plus couramment utilisés aujourd'hui 4,5. Bien que cette procédure est simple, fiable et facile à mettre en oeuvre, il prend du temps, nécessite de grands volumes d'échantillons, et rend l'utilisation de solvants toxiques. Il n'est pas pratique pour l'analyse de nombreux échantillons à partir d'un essai de fermentation ou de criblage de nouvelles souches riches en huile. D'autres méthodes ont been développé, mais le plus souvent besoin d'équipement de pointe et n'ont pas été normalisés 6.
Une alternative qui a suscité beaucoup d'intérêt est la tache rouge Nil. Nile Red, un colorant qui émet une fluorescence de manière préférentielle dans des milieux non polaires, a été utilisée pour identifier ou quantifier les corps lipidiques dans différents organismes, y compris des nématodes 7, 8 levures, les bactéries et les algues 9, 10-19. Techniques initiales impliquant Nil Rouge étaient essentiellement qualitative ou semi-quantitative, combinant la tache avec une seule cuvette spectrophotométrie ou la cytométrie de flux. En outre, certaines classes d'algues telles que les algues vertes ont des puits de cellules d'épaisseur qui sont essentiellement imperméable au colorant, ce qui limite la portée de la technique 10.
Récentes améliorations apportées à la méthode de coloration rouge Nil ont été signalés qui contournent les lacunes initiales du protocole 10,11. La coloration des cellules en présence d'un carrier solvant tel que le DMSO 10 ou éthanol 10,11 linéarise la relation entre la teneur en huile et l'absorbance, ce qui permet des mesures quantitatives fiables. Le solvant permet de perméabiliser la membrane cellulaire de façon que les molécules Nile Red peuvent passer à travers. En outre, l'incorporation d'un spectrophotomètre avec des capacités de lecture de micro-plaque permet protocoles à haut débit appropriés pour l'analyse quantitative.
En ce détail article de nous une méthode simple pour mesurer la teneur en huile des cellules algales par coloration cultures avec Nil Rouge en présence d'éthanol, un solvant doux. Afin d'expliquer plus précisément pour le bruit de fond dans les mesures, d'une courbe standard corréler l'intensité de fluorescence à la teneur en huile est développée à l'aide de cellules d'algues composition d'huile connue. La méthode est une adaptation de protocoles précédemment publiés 10,11. En utilisant un spectrophotomètre à 96 puits, on est capable d'analyser la même quantité d'échantillons dans un tha heuresl faudrait jours pour surveiller par des méthodes gravimétriques. En outre, par une calibration en utilisant des échantillons représentatifs de l'espèce algale désiré ce procédé produit des mesures relativement précises qui sont directement interprétables. Il existe de nombreux protocoles décrivant les méthodes de coloration des algues avec Red Nil optimisé pour différentes souches et des applications; le protocole présenté ici a été développé à l'origine par de la Hoz Siegler et al. 11 pour protothecoides Auxenochlorella, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus, et Scenedesmus obliquus, mais il est probable approprié pour de nombreuses autres espèces et les classes. Il a été conçu à la demande spécifique de la performance des bioprocédés de surveillance et il fonctionne aussi bien pour les échantillons préalablement séchés et des échantillons humides à partir d'une culture de plus en plus.
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Protocol
1. Isolation de sec biomasse algale à servir de normes pour fluorescence Lectures
- Supprimer un volume d'échantillon de la culture d'algues croissante qui fournira au moins 200 mg de biomasse sèche, 400-600 mg est préférable.
- Extrait Centrifuger à 4 ° C pendant 10 min à 10 000 x g. Jeter le surnageant et laver le culot avec un volume égal de tampon phosphate formulé pour le même pH que le milieu de croissance.
- Répétez l'étape 1.2 pour un total de 3 étapes de lavage.
- Re-suspendre le culot dans de l'eau déminéralisée et transférer dans un plat préalablement pesé peser. Laissez sécher à 50 ° C pendant 48 heures. NOTE: Le séchage sous vide diminue le temps de séchage et le séchage de la culture à des températures supérieures à 50 ° C peut, par remise en suspension difficile.
- Séché magasins algues cultures à la température ambiante pour une utilisation future.
2. Quantification gravimétrique des lipides neutres par hexane Extraction (Adapté de Bligh et Dyer 4)
- Mesurer environ 50 mg de biomasse d'algues sèches dans un plat peser. REMARQUE: messes allant de 40 à 80 mg peuvent être utilisés sans perte de reproductibilité.
- Transférer la biomasse à un mortier pré-lavé avec de l'hexane. Le cas échéant, laver le plat peser avec une petite quantité (1 ml) d'hexane à l'aide d'une pipette Pasteur afin de transférer totalement la biomasse au mortier. NOTE: L'hexane est une substance hautement volatile et toxique. Il doit être manipulé dans la hotte avec des vêtements de protection appropriés.
- Broyer la biomasse algale pendant 5 minutes à l'aide d'un pilon. Commencez par broyage doux et augmenter progressivement l'intensité. Broyer la biomasse dans une pâte fine et lisse dans la période de 5 min. Si un excès d'hexane est utilisé lors du transfert de la biomasse dans le mortier, il est préférable d'attendre que l'hexane s'évaporer avant le broyage.
- Ajouter quelques ml d'hexane pour le mortier et mélanger la suspension résultante avec le pilon jusqu'à ce qu'elle soit homogénéisée. Assurez-vous que tous les débris cellulaires adhère aux parois de la mortar sont frappé libre et en suspension dans le liquide.
- Transférer le mélange de la masse de l'hexane-cellules dans un tube de centrifugeuse. NOTE: Le tube de centrifugation doit être en verre ou en un polymère approprié compatible avec de l'hexane tel que le Teflon.
- Répéter les étapes 2.4 et 2.5 jusqu'à ce que toute la biomasse a été transféré dans le tube de centrifugation (3-5x).
- Centrifuger l'échantillon à 4 ° C pendant 20 min à 10 000 x g.
- Pipette avec précaution le surnageant dans un métal pré-pesée peser plat. Stocker dans la hotte.
- Effectuer une extraction par l'hexane 2 ème ajout de 3 ml d'hexane à la pastille et vigoureusement au vortex pendant 1 minute.
- Répétez les étapes 2.7 et 2.8. Si nécessaire, exécutez les échantillons pendant 30 min dans la centrifugeuse pendant la seconde extraction pour s'assurer que tous les débris cellulaires s'installe entièrement. Déterminer la masse d'huile extraite par gravimétrie après hexane s'évapore.
3. Fluorometric quantification des lipides neutres Utilisation Nil Rouge (comme Rapported par de la Hoz Siegler et al. 11)
NOTE: Seuls 10 pi d'une suspension d'algues à 5 g / L est nécessaire pour la lecture de fluorescence. En général, l'isolement de la biomasse d'algues sèches de 1,5 ml de bouillon de culture est plus que suffisante. Par ailleurs, l'intensité lumineuse de la lampe dans le spectrophotomètre peut se dégrader au fil du temps. Il est recommandé d'inclure des normes dans chaque expérience pour assurer que les variations de l'instrument n'ajoutent pas d'erreur inutile aux mesures.
- Préparer une solution rouge Nil à une concentration de 10 pg / ml dissous dans de l'éthanol de qualité réactif à l'alcool. Conserver cette solution dans l'obscurité à 4 ° C.
- Préparer une solution à 30% (v / v) d'éthanol dans de l'eau déminéralisée et stocker à 4 ° C.
- Préparer tous les échantillons d'algues à la même concentration de la biomasse (il est recommandé de 5 g / L) et de la même manière que les critères utilisés dans l'évaluation. Pour ce faire, soit par des échantillons de suspension pré-séchés dans la quantité appropriéede tampon phosphate (0,6 g / L de phosphate de potassium dibasique, 1,4 g / L de phosphate de potassium monobasique), ou en ajustant la concentration d'une culture d'algues en croissance à 5 g / L de tampon phosphate après la mesure de la turbidité. REMARQUE: Les mesures effectuées sur des cultures d'algues vivantes auront souvent plus grande erreur qui leur est associé en fonction de la précision de la courbe d'étalonnage de la turbidité. La remise en suspension des échantillons secs peut nécessiter l'utilisation d'un homogénéisateur pour disperser complètement la biomasse.
- Pour chaque échantillon, mélanger 80 ul de la solution d'éthanol à 30%, 10 ul de la solution rouge Nil, et 10 ul de suspension d'algues dans un seul puits d'une plaque à 96 puits. Afin de bien rendre compte de la variabilité de la mesure de fluorescence, effectuer 5 répétitions de chaque échantillon.
- Exécutez une courbe d'étalonnage en deux points aux normes préalablement préparés afin de tenir compte des variations au jour le jour de l'instrument et de la préparation. Préparer les étalons pour la mesure de la fluorescence à l'aide de la sProcédure ame que les échantillons. REMARQUE: En général, deux points est suffisant pour un recalibrage de l'instrument, trois points peuvent être exécutés pour vérifier la linéarité.
- Effectuer les mesures de fluorescence dans un multi-puits lecteur de plaque spectrophotomètre. Les conditions suivantes ont été trouvées pour obtenir les résultats les plus cohérents 11:
- Agiter à 1200 rpm, orbite 3 mm, pour 30 sec.
- Incuber à 40 ° C pendant 10 min.
- Agiter à 1200 rpm, orbite 3 mm, pour 30 sec.
- fluorescence d'enregistrement, l'excitation à 530 nm, émission à 604 nm.
- Convertir les mesures de fluorescence à la teneur en huile en utilisant les résultats des étalons internes.
4. Technique microscopie de fluorescence
REMARQUE: Le protocole de coloration décrit dans l'article 3 est conçu pour l'analyse quantitative, mais il peut aussi être utile de fournir des représentations visuelles des techniques basées taches pour unité centrale d'éducation et d'illustrationrposes. Pour produire des images de l'échantillon fluorescence nécessite un microscope optique avec des sources de transmission et d'éclairage à épifluorescence plus traditionnels. Excitation et d'émission filtres de lumière dans le 530 nm (vert) et 604 nm (rouge) gamme, respectivement, sont nécessaires pour la tache rouge du Nil ainsi que d'une caméra montée au microscope avec un logiciel associé. Les images présentées dans cette étude (figure 1) ont été acquises à l'aide d'un microscope en champ clair équipé d'une caméra et monochrome à l'unité de convertisseur RGB. Le procédé de production du Nil Red images de fluorescence à l'aide de ces outils est décrit ci-dessous:
- Préparer un échantillon de la culture avec la tache rouge Nil conformément à l'article 3 du protocole. REMARQUE: un échantillon de 5 g / L gamme de concentration produit des lames de densité adéquate des cellules sans surpopulation.
- Après avoir terminé l'étape 3.6 du protocole de coloration, préparer une lame de microscope de l'échantillon traité selon les procédures standard de laboratoire.
- En commençant par le microscope en transmission, charger la lame préparée dans le microscope, et de localiser les cellules à l'agrandissement souhaité (images présentées dans cet article ont été acquis avec l'objectif 100X).
- Une fois la mise, passer le microscope de transmission en mode d'éclairage à épifluorescence. La source lumineuse doit maintenant être vient directement de la lentille d'objectif (ce qui peut être confirmé par l'observation visuelle de l'espace entre la lame et la lentille d'objectif).
- Insérer un filtre d'excitation verte dans la source de lumière et un filtre d'émission de rouge dans le trajet de lumière d'observation; la fluorescence des cellules colorées devrait maintenant être directement visible à travers l'oculaire.
- Changez le mode de l'observation au microscope de l'oculaire de l'appareil photo monté et utiliser un logiciel de visualisation pour capturer une image des cellules fluorescentes. Selon la sensibilité de la caméra, l'échantillon peut ne pas apparaître d'abord dans la fenêtre d'aperçu (c'est à dire l'écranêtre noir); pour remédier à cela, ajuster le temps et le gain de l'appareil d'exposition à un niveau où les cellules sont visibles. Paramètres spécifiques varient selon les instruments, du matériel et des types de cellules.
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Representative Results
Cellules d'algues représentatives colorées avec le colorant rouge Nil sont illustrés dans la Figure 1. Parties A et B de la figure 1 images d'affichage de A. protothecoides cultivées dans un excès d'azote, conduisant à très faible accumulation de lipides intracellulaires. Dans les parties C et D, des échantillons de A. protothecoides cultivées sous limitation d'azote sont présentés. Sous illumination de transmission, les corps lipidiques de la cellule peuvent être visualisées à l'inspection minutieuse de la figure 1C, où elles apparaissent sous forme de structures circulaires brillantes et constituent la majeure partie du volume de la cellule. Les cellules représentées sur la figure 1A, qui ont été cultivés dans de l'azote en excès, sont l'huile de seulement 5% en poids sec, et ne contiennent pas de niveaux significatifs de corps lipidiques.
Lorsque montré dans les conditions de lumière appropriées, les différences de ces échantillons sont amplifiés. Les cellules de pétrole maigreapparaître comme des anneaux fluorescents avec des organismes sombres (figure 1B), tandis que les cellules riches en pétrole affichent une lueur orange-rouge vif où ils ont accumulé corps lipidiques (figure 1D). Dans la figure 1D, il est plus difficile de voir la faible fluorescence de la membrane cellulaire et d'autres structures cellulaires. Nil Rouge fluorescence en présence de protéines non polaires ainsi que les lipides, ce qui explique pourquoi la membrane cellulaire et d'autres structures cellulaires offrent un niveau de fluorescence de fond pendant les mesures du spectrophotomètre.
Dans les conditions optimisées de l'essai, les courbes d'étalonnage avec les valeurs de R 2 supérieure à 0,980 sont facilement réalisables (Figure 2A). La relation entre la teneur en huile et la fluorescence de la cellule devient non linéaire, si les cellules sont colorées dans une solution dépourvue d'un support de solvant tel que l'éthanol. Les données présentées sur la figure 2B, avec un R 2 de 0,395, étaient 60; obtenu par mise en oeuvre du protocole dans une solution d'éthanol de 0% (de l'eau désionisée pure).
Figure 1. Images de A. protothecoides colorées avec Nil Rouge. Un des exemples pauvre en huile (4,4% la teneur en huile en poids sec) est indiqué sous A) transmis microscopie optique et B) épifluorescence éclairage avec filtre d'excitation vert (510 nm). Les corps lipidiques colorées avec Nil Rouge fluorescent à 604 nm. Un échantillon riche en pétrole (54,7% d'huile en poids sec) est représenté dans C) et D) dans les mêmes conditions transmissibles et lumière épifluorescence que A) et B), respectivement.nk "> Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 2. Courbes d'étalonnage en corrélation la teneur en huile de A. protothecoides à fluorescence. intensité en A), les échantillons ont été préparés selon le protocole décrit. Dans B), les échantillons ont été préparés dans une solution d'éthanol de 0% (eau déminéralisée). Les barres d'erreur verticales représentent l'écart type de cinq répétitions dans le spectrophotomètre. Barres d'erreur horizontales indiquent la déviation standard d'au moins trois répétitions de la quantification gravimétrique de lipides neutres. Cliquez ici pour agrandir l'image.
| Chimique | Entreprise | Concentration |
| KH 2 PO 4 | Fisher Scientific | 2,8 g · L -1 |
| K 2 HPO 4 | Fisher Scientific | 1,2 g · L -1 |
| MgSO 4 · 7H 2 O | Fisher Scientific | 1,2 g · L -1 |
| FeSO4 · 7H 2 O | Fisher Scientific </ Td> | 48 mg · L -1 |
| H 3 BO 3 | Fisher Scientific | 11,6 mg · L -1 |
| CaCl 2 · 2H 2 O | Fisher Scientific | 10 mg · L -1 |
| MnCl 2 · 4H 2 O | Fisher Scientific | 7,2 g · L -1 |
| ZnSO4 · 7H 2 O | Fisher Scientific | 0,88 mg · L -1 |
| CuSO 4 · 5H 2 O | Fissa science | 0,32 mg · L -1 |
| Na 2 MoO 4 · 4H 2 O | Fisher Scientific | 0,12 mg · L -1 |
| chlorhydrate de thiamine | Fisher Scientific | 40 pg · L -1 |
| glucose | Fisher Scientific | 30 g · L -1 |
| glycine | Fisher Scientific | 0,2-2,0 g · L -1 |
Tableau 1. Culture recette des médias. Tous les réactifs sont de qualité analytique.Des solutions ont été préparées en utilisant de l'eau désionisée. La concentration de la glycine a été utilisée pour contrôler le rapport du carbone à l'azote dans la culture et, en conséquence, la teneur en huile finale de l'algue. Cellules allant de 8,5% à 55% neutre teneur en lipides en masse (poids sec) ont été utilisés pour faire de la courbe standard.
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Discussion
Les algues utilisées dans la courbe standard doit être les mêmes espèces cultivées dans les mêmes conditions expérimentales que celles qui sont mesurées. Des changements significatifs dans la composition du milieu, la technique de la culture, et le protocole de coloration peuvent influer sur l'intensité de la lecture de fluorescence. extraction à l'hexane (décrit dans les sections 1 et 2) a été utilisé pour déterminer la teneur en lipide neutre d'échantillons utilisés dans la courbe standard. Pour des mesures précises de l'intensité de fluorescence, les échantillons doivent être analysés à la même concentration de la biomasse (5 g / L a été utilisé dans cette étude). La teneur en huile peut alors être facilement déterminée par comparaison à la courbe d'étalonnage. Pour ce protocole, les algues sont cultivées dans des flacons agités dans des conditions hétérotrophes (28 ° C, 100 rpm) avec du glucose comme source de carbone (30 g / L) et de la glycine en tant que source d'azote (0,2 à 2,0 g / L). Pour une recette plus détaillée de médias, voir le tableau 1.
Une considération importante dans la réalisation de l'protocole est les conditions de séchage de la biomasse algale humide lors de la préparation de la courbe étalon. Un four à vide à 45 ° C est recommandée. Un four conventionnel à 45-50 ° C sera également suffire à condition que plus de temps est laissé sécher complètement les échantillons (24-48 h). Températures supérieures à 50 ° C peuvent provoquer la biomasse à fusionner ou former une croûte impénétrable qui n'a pas facilement remettre en suspension dans un tampon phosphate. La remise en suspension peut être facilité par l'utilisation d'un homogénéisateur. additifs chimiques tels que des tensioactifs ou une base forte doivent être évités car ils influencent généralement la lecture de fluorescence. Cultures sèches peuvent être stockées pendant 6 mois dans un conteneur scellé sans éprouver la dégradation des lipides significative. On notera que les mesures effectuées sur des cultures d'algues vivantes auront souvent plus grande erreur qui leur est associé en fonction de la précision de la courbe d'étalonnage de la turbidité.
Une autre considération est la concentration d'éthanol utilisé pour exécuter le samples dans le lecteur micro-plaque. L'éthanol agit comme un solvant de support, ce qui facilite le transport de molécules Nil rouges dans la cellule. A de faibles concentrations (<30%), la relation entre la teneur en huile et la fluorescence devient non linéaire à cause de la mauvaise diffusion à travers la membrane cellulaire (figure 2B). A des concentrations d'éthanol plus élevés, une meilleure linéarité est obtenue au détriment de la diminution d'intensité de fluorescence (figure 2A). Pour protothecoides Auxenochlorella, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus, et Scenedesmus obliquus, une concentration d'éthanol de 30% a été trouvé pour donner le compromis optimal entre linéarité améliorée et une diminution de l'intensité de fluorescence 11. Il peut être nécessaire d'ajuster la concentration de l'éthanol afin d'optimiser les résultats pour les autres organismes.
Choisir les longueurs d'onde d'excitation et d'émission appropriés pour la lecture de la fluorescence dans les échantillons d'algues est cruciale pour ensure seulement les lipides neutres sont incluses dans la mesure. Nile Red intensité de fluorescence varie à différentes longueurs d'onde dépendant de la polarité de l'environnement 11,13. Pour A. protothecoides, le pic d'émission pour les lipides neutres est observée à 590 nm; un pic secondaire représentant lipides polaires peut être observée à 645 nm 11. Par conséquent, des mesures d'intensité de fluorescence décrites dans cette procédure ont été effectuées en utilisant un filtre d'excitation de 530 nm, avec la moitié de la largeur de bande = 10 nm, et un filtre d'émission de 604 nm, avec la moitié de la largeur de bande = 10 nm. Choix d'excitation et d'émission de longueur d'onde doit être vérifiée pour chaque souche d'algues testées.
Depuis Nile Red va émettre de la fluorescence dans un environnement non polaire, les structures cellulaires en plus des corps lipidiques seront détectés par le spectrophotomètre (voir figure 1B). Ce fait, en combinaison avec l'hétérogénéité inhérente de la biomasse cellulaire, conduit à une relation non linéaire entrela biomasse cellulaire et la fluorescence 11. Ce problème est résolu en s'assurant que tous les échantillons sont préparés à un poids sec constant (5 g / L recommandé). A des concentrations diluées le signal devient faible et ses tendances sont difficiles à distinguer. En outre, le signal de fluorescence peut être bruyant en raison de variations de cellule à cellule et des suspensions de particules dans la presse. En conséquence, 5 répétitions de chaque échantillon est recommandé pour des résultats fiables 11.
Certains protocoles utilisent une norme de pétrole tels que la trioléine pour calibrer la mesure 10,20,21. Bien que cette technique a été signalé avec succès pour certaines espèces d'algues telles que Bacillariophyceae et Dinophyceae, il est moins adapté pour les algues à parois épaisses telles que Chlorella en raison des limitations de diffusion à travers la membrane cellulaire. En outre, l'ajout de trioléine peut perturber la distribution des molécules Nil rouge entre la norme et les corps lipidiques, conduisant to estimations inexactes de la teneur en huile. En utilisant des échantillons d'algues de la teneur en huile connue sous le nom de normes évite ces défaillances potentielles et représente une fluorescence de fond causé par les conditions de la biomasse et de croissance.
Le protocole présenté dans cette étude fournit une méthode simple, pas cher et rapide de quantification des lipides neutres dans des échantillons d'algues. En utilisant une plaque multi-puits, des débits d'échantillonnage élevées sont obtenues avec des gains de temps par rapport aux autres protocoles de coloration. En outre, les conditions de l'essai ont été optimisés pour obtenir des tendances linéaires et reproductibles.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le Conseil de recherches en sciences naturelles et de fournir un soutien financier à ce projet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dry Weight | |||
| 25 ml disposable pipettes | Fisher | 13-676-10K | |
| Pipette Bulb | Fisher | 13-681-51 | |
| 40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes | Fisher | 05-562-16A | Teflon needed for hexane |
| Weigh Dishes (polypropylene) | Fisher | 2-202B | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Centrifuge | Sorvall | RC6plus | |
| Drying Oven (Fisher 625D) | Fisher | 13-254-2 | |
| Storage vials | Fisher | 0337-4 | |
| Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D) | Fisher | 05-40-100 | |
| Gravimetric Quantification | |||
| Porcelain Mortar (Coorstek) | Fisher | 12-961A | |
| Porcelain Pestle (Coorstek) | Fisher | 12-961-5A | |
| 40 ml Centrifugation tubes (FEP) | Fisher | 05-562-16A | Could also use glass tubes |
| Pasteur glass pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Aluminum weigh dishes | Fisher | 08-732-101 | |
| Hexanes | Fisher | H292-4 | |
| Fluorometric quantification of oil content | |||
| Fluorescence multi-well plate reader | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
| Fluorescence reader software | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
| COSTAR 96 well plate with round bottom | Fisher | 06-443-2 | |
| Nile Red | Sigma | N3013-100MG | |
| Ethanol (alcohol reagent grade) | Fisher | AC65109-0020 | |
| Imaging Fluorescent cells | |||
| Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope | Leica | DMRXA2 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Microscope cover slips | Fisher | 12-541B | |
| Camera | Qimaging | Retiga Ex | |
| Imaging software | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |
References
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