Dopo la sezione spinale, zebrafish adulto ha recupero funzionale da sei settimane post-infortunio. Per usufruire di trasparenza larvale e recupero più veloce, vi presentiamo un metodo per sezionare il midollo spinale larvale. Dopo la resezione, osserviamo il recupero sensoriale che inizia a 2 giorni dopo l'infortunio, e il movimento C-bend per tre giorni post-infortunio.
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Articolo metodologico
Spinal Cord transezione nel larvale Zebrafish
In questo articolo
Sommario
Abstract
Mammiferi sicuro nel recupero sensoriale e motoria seguente lesione del midollo spinale per mancanza di ricrescita assonale sotto del livello della lesione e l'incapacità di reinizializzare neurogenesi spinale. Tuttavia, alcuni Anamni tra cui il zebrafish Danio rerio mostre sia sensoriali e recupero funzionale anche dopo la completa resezione del midollo spinale. Lo zebrafish adulto è un organismo modello stabilito per studiare la rigenerazione dopo la lesione del midollo spinale, con recupero sensoriale e motorio da 6 settimane post-infortunio. Per usufruire di analisi in vivo del processo rigenerativo disponibile in zebrafish larvale trasparente così come strumenti genetici non accessibile nell'adulto, usiamo il zebrafish larvale di studiare la rigenerazione dopo resezione del midollo spinale. Qui mostriamo un metodo per riproducibile e verificabile sezionare il midollo spinale larvale. Dopo la resezione, dai dati risulta recupero sensoriale inizio a due giorni post-infortunio (dpi), with il movimento di C-bend rilevabile da 3 dpi e la ripresa di nuoto libero da 5 dpi. Così proponiamo zebrafish larvale come strumento guidata al zebrafish adulti per lo studio di recupero dopo lesione del midollo spinale.
Introduzione
Grave trauma al midollo spinale umano si traduce spesso in paralisi permanente e perdita di sensibilità al di sotto del livello della lesione, a causa della incapacità di ricrescere assoni o iniziare nuovamente neurogenesi 1,2. In contrasto con i mammiferi, tuttavia, Anamni tra cui salamandre e zebrafish (Danio rerio) mostrano robusta ripresa anche dopo la completa del midollo spinale recisione 3,4.
Lo zebrafish adulto è un modello ben consolidato per studiare il processo di recupero dopo lesione del midollo spinale 5-7. Dopo resezione completa del midollo spinale, ripristino della funzione sensor....
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Protocollo
Zebrafish sono state sollevate e allevati secondo le procedure standard; esperimenti sono stati approvati dalla University of Utah Istituzionale cura degli animali e del Comitato Usa.
1. Preparazione di piatti Chirurgia
- Fai piastre di chirurgia con 60 millimetri Petri e Sylgard 184 Kit di silicone elastomero, seguendo le istruzioni del produttore. Riempire i piatti non più di mezzo pieno e lasciare polimerizzare. Conservare coperto a temperatura ambiente.
2. Preparazione di Micropipette
- Realizzare micropipette da riscaldamento e tirando a parete sottile tubo borosilicato capillare i....
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Risultati
Per ridurre la gravità dei danni ai tessuti circostanti il sito di lesione, la corretta smussatura della micropipetta è critica. Figura 1A mostra una punta smussata correttamente. Utilizzando una punta che è troppo ampia (Figura 1B) tende a provocare incidenti mortali più elevate a causa della maggiore probabilità di intaccare l'aorta dorsale, mentre una punta che è troppo stretto (Figura 1C) tende a colpo d'occhio fuori la pelle piuttosto che il taglio dei tess.......
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Discussione
Quando inizialmente imparare questa tecnica, si consiglia di tentare non più di 50-100 transections in una singola sessione. Dopo aver imparato questa tecnica, siamo in grado di transetto fino a 300 embrioni per ora; Tuttavia, questo livello di velocità richiede pochi mesi di pratica settimanale. Consigliamo inoltre praticare con una linea giornalista e la verifica completa resezione finché l'incidenza di incompleta recisione del midollo spinale è ridotto a meno dell'1%.
Recisione de.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Siamo in debito con l'impianto University of Utah zebrafish per la zootecnia. RID è stato sostenuto da NIH R56NS053897, e LKB era un tirocinante predoctoral supportato dall'iniziativa HHMI Med-Into-Grad.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra di Petri da 60 mm | VWR | 82050-544 | |
| Piastra di Petri da 100 mm | VWR | 89038-968 | |
| PDMS, kit elastomero siliconico Sylgard 184 | Scientific | NC9644388 | |
| tubo capillare in borosilicato: OD 1,00 mm, ID 0,78 mm | Warner Instruments Inc. | 64-0778 | |
| Pinze | Fine Scientific Tools Inc. | 11252-30 | |
| Microscopio di dissezione | Nikon | SMZ6454 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Gentamycin Sulfate | Amresco Inc. | 0304-5G | sciogliere in acqua 10 mg/ml, conservare a -20 gradi C |
| Tricaine | Acros Organics | 118000100 | |
| Applicatore con punta in cotone, legno, 6 pollici | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Siringa da 1 ml | BD | 309625 | |
| ago da 27 G | BD | 305109 | |
| Friggere cibo | Argent Labs | F-ARGE-PTL-CN | negozio a -20 ° C |
| Estrattore per micropipette | Sutter Instrument Co. | Modello P-97 | Scatola Filamento FB330B |
| 20x E2 (1 L); conservare su RT | |||
| 17,5 g NaCl | Fisher Scientific | S671-500 | |
| 0,75 g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| 2,90 g CaCl2· 2H2O | Sigma | C7902-500G | |
| 4,90 g MgSO4· 7H2O | Merck | MX0070-1 | |
| 0.41 g KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| 0.12 g Na2HPO4 | Sigma | S0876-500G | |
| 500x NaCO3 (10 ml); preparare fresco, scartare | |||
| 0,35 g in più di NaCO3 | Sigma | S5761 | |
| 1x E2 (1 L); conservare da RT | |||
| 50 ml 20x E2 | |||
| 2 ml fresco 500x NaCO3 |
Riferimenti
- Houweling, D. A., Bär, P. R., Gispen, W. H., Joosten, E. A. Spinal cord injury: bridging the lesion and the role of neurotrophic factors in repair. Progress in brain research. 117, 455-471 (1998).
- Mikami, Y., et al.
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Ristampe e permessi
