Murin de transplantation cardiaque hétérotopique Technique

Summary

Le manuscrit décrit les étapes nécessaires pour effectuer la transplantation cardiaque hétérotopique chez la souris.

Abstract

Il est maintenant plus de quarante ans que cette technique a d'abord été rapporté par Corry, Wynn et Russell. Même s'il a fallu quelques années pour d'autres laboratoires pour devenir compétent dans et utilisent cette technique, il est maintenant largement utilisé par de nombreux laboratoires dans le monde. Un raffinement significative à la technique originale a été développée et a rapporté en 2001 par Niimi. Décrits ici sont les techniques qui ont évolué pendant plus d'une décennie dans les mains de trois chirurgiens (Plenter, Grazia, Pietra) dans notre centre. Ces techniques sont maintenant transmis à la jeune génération de chirurgiens et de chercheurs.

Basé en grande partie sur l'expérience Niimi, les procédures ont évolué dans les détails les plus fins détails - que nous nous efforcerons de rapporter ici d'une manière telle que d'autres peuvent être en mesure d'utiliser ce modèle très utile. Comme Niimi, nous avons constaté qu'une aide vidéo à l'apprentissage est une ressource inestimable pour les débutants.

Introduction

À une époque où il est possible d'effectuer des reins, des poumons, du foie et de pancréas chez la souris, la pierre angulaire de la transplantation d'organes de base et la recherche en immunologie depuis 1973 ^1-4 reste le modèle de transplantation cardiaque hétérotopique chez la souris. Dans les années qui ont suivi plusieurs articles ont été publiés en détail les améliorations / améliorations ^{de 5,6} à cette procédure.

Comme un modèle de transplantation organe solide principalement vascularisé cette procédure est à nulle autre pareille. Une fois maîtrisé cette procédure se prête à la recherche sur allogéniques rejet réponses ^7, le développement de vasculopathies chroniques ⁸ et les mécanismes de l'ischémie reperfusion ^9.

Les clés de l'apprentissage avec succès cette procédure sont comme toute autre chirurgie, de la patience de la part de l'instructeur et le stagiaire et l'attention au détail. Au début du procédé, le nouveau chirurgien va trouver que they va passer de nombreuses heures sur chaque greffe. Avec l'expérience, les temps chirurgicaux, et donc l'ischémie, va considérablement réduire. Prêter attention aux détails de chaque étape sera tôt ou tard mener à la réussite.

Alors que l'instructeur peut faire de leur mieux pour transmettre, et à anticiper, toutes les chutes possibles de la fosse que l'on peut rencontrer au cours de ces chirurgies, le stagiaire «créative» sera probablement trouver certaines de leurs propres!

Les bases de la procédure sont les suivantes. Le donneur ascendant arc aortique est fin à côte anastomosé au destinataire aorte abdominale et l'artère pulmonaire du donneur est de bout en côté anastomosé au destinataire abdominale veine cave inférieure (VCI). Le sang coule de l'aorte bénéficiaire en mode rétrograde dans l'aorte des donateurs pour les artères coronaires. Une fois le sang a coulé dans le système coronaire, il se jette dans l'oreillette droite via le sinus coronaire, est pompé dans le ventricule droit etpuis par l'artère pulmonaire dans le récipient IVC. De cette manière, le système est alimenté coronaire artérielle et le rythme sinusal retourne à la greffe à l'intérieur de 1-2 min de reperfusion. Depuis les chambres gauche du cœur sont essentiellement la pression sous-chargé de la paroi libre du ventricule gauche va s'atrophier au fil du temps.

Protocol

Tous les animaux ont été logés dans des conditions exemptes d'agents pathogènes à l'Université du Colorado Barbara Davis Centre animalerie sous l'approbation du IACUC et soignés selon les directives du NIH.

Profondeur de l'anesthésie est jugée par pincement de l'orteil d'abord et par le respect des taux de respiration une fois la procédure a commencé.

1. Donateurs coeur de récolte

1. Anesthésier la souris donneuse par injection de pentobarbital (60 mg / kg IP).
2. Immobiliser la souris par 4 voies restrictions et couper la fourrure. Essuyez la peau avec de l'alcool.
3. Après dissection loin la peau, ouvrir la cavité abdominale par une incision transversale juste inférieure à la membrane.
4. Couper la membrane postérieure à l'insertion costale et soulever la paroi thoracique antérieure en avant et en haut exposer le coeur.
5. Étendre une épaisseur pleine couper le postérieur latéral cavité thoracique sur les côtés gauche et droit de la poitrine.
6. Isoler l'veine cave inférieure (VCI) et placer un lâche 5-0 soie suture autour de l'IVC à côté de son insertion dans l'oreillette droite.
7. Injecter 1,0 cc de 4 ° C saline héparine (200 u / cc) dans la veine cave inférieure, puis ligaturer le vaisseau avec la suture et fracture 5-0 soie.
8. Isoler le droit veine cave supérieure (rSVC) de la même façon et ligaturer avec 5-0 suture de soie et de diviser.
9. Roulez doucement le cœur vers le côté droit des animaux et isoler la veine cave supérieure gauche (LSVC), ligaturer avec un fil de soie 5-0 et diviser exposer l'artère pulmonaire gauche.
10. Fixez le cœur sous une gaze humide tandis que le thymus est blunt dissection de la principale artère pulmonaire (AP) et la PA branches gauche et droite et croissant crosse aortique.
11. Blunt disséquer l'arc aortique sans les tissus environnants. Micro-ciseaux sont utilisés pour diviser l'aorte proximale de l'artère brachiale-céphalique droit, c'est à dire qu'il devrait y avoir aucun branches entre le cœur et la divisionpoint de l'aorte.
12. Cette section de la crosse de l'aorte forme le brassard artériel pour le processus d'implantation.
13. Tenir compte de la manchette aortique en bas pour exposer le tronc et les branches PA gauche et droit de la PA.
14. Blunt disséquer les branches PA gauche et droite à partir des tissus environnants dans la mesure du cœur que possible. Cela permet de dissection facile du tronc PA de tissus environnants.
15. Diviser le coffre PA comme distale que possible, juste en amont de sa bifurcation. Cette section de l'artère pulmonaire veineuse constitue le brassard pour le processus d'implantation.
16. Placez une suture en soie 5-0 autour de la base du cœur et une cravate. Le cœur est ensuite découpé libre à la base, et placée dans 4 ° C une solution saline. Moment de la récolte totale est d'env. 10-15 min.

2. Coeur Implant Technique

1. Anesthésier les souris receveuses avec du pentobarbital (/ kg de dose initiale IP 60 mg, 25 mg / kg dose supplémentaire IP si nécessaire).
2. Clip de la fourrure etimmobiliser la souris par 4 voies restrictions et préparer la peau avec de la povidone-iode et drapé dans un mode stérile.
3. Faire un 2 cm ligne médiane verticale incision abdominale et entrer dans la cavité abdominale.
4. Retrait de l'intestin haut et externalisé sur la poitrine. Gardez enveloppé dans de la gaze humide stérile (solution saline stérile) tout au long de l'affaire.
5. Isoler l'aorte abdominale et la veine cave inférieure (VCI) sous les artères rénales et placez 4-0 liens de coton autour de l'aorte et IVC supérieur puis inférieur au site d'anastomose.
6. Identifier tous les navires lombaires dans le domaine et ligaturer avec 10-0 suture en nylon.
7. Nouer des liens de coton, d'abord l'inférieur suivi par le supérieur. De cette manière, un peu de sang est retenu dans la prise de l'aorte aortotomie plus facile.
8. Former le aortotomie avec une aiguille 30 G pour entrer dans la lumière de l'aorte. Elargir l'incision avec de fines micro ciseaux pour une longueur d'environ 2 mm. Cette incision est faite dans une ligne droite le long de la longuetudinal axe de la cuve.
9. Faire une fin anastomose de l'aorte du donneur à l'aorte bénéficiaire de la façon suivante. Placez un nylon 10-0 séjour de suture point dans l'aorte des bailleurs de fonds et à l'angle inférieur de l'incision dans l'aorte du destinataire et une cravate. Placez un deuxième nylon 10-0 opposée à la première dans l'aorte du donneur et le coin supérieur de l'incision dans l'aorte abdominale et une cravate.
10. Faire une ligne de suture allant de supérieur à inférieur à la paroi latérale de l'aorte et cravate contre un séjour point précédemment placé. N'oubliez pas d'apporter les intimas (surface intérieure du vaisseau) ainsi que vous assemblez. Puis suturer la partie médiane de façon courante et une cravate. Le premier et le dernier point de chaque côté doit être placé au plus près des points de séjour que possible. Puis objectif est d'avoir trois points espacés entre ces deux pour un total de 5 points.
11. Faire une fin anastomose de l'artère pulmonaire de donneur au receveur IVC de la façon suivante. Puncture la VCI avec une aiguille 30 G et étendre l'incision pendant env. 2 mm avec de beaux ciseaux micro. Cette incision est faite dans une ligne droite le long de l'axe longitudinal du navire.
12. Attachez l'artère pulmonaire des bailleurs de fonds dans le coin inférieur de l'incision dans la veine cave inférieure avec nylon 10-0. Placez un deuxième nylon 10-0 opposée à la première dans l'artère du donneur et le coin supérieur de l'incision dans la veine cave inférieure et une cravate.
13. Faire une ligne de suture s'étendant entre l'artère pulmonaire et la veine cave inférieure et une cravate. Le premier et le dernier point de chaque côté doit être placé au plus près des points de séjour que possible. Puis objectif est d'avoir 5 points régulièrement espacés entre ces deux soit un total de 7 points.
14. Relâchez le coton rétablir le flux veineux distal 4-0 cravate.
15. Une fois l'hémostase de l'anastomose veineuse a été observée proximale 4-0 coton cravate est progressivement desserré et l'anastomose artérielle observée pour l'hémostase. Lorsque les deux anastomoses sont considérés comme sûrs, retirez le cotton cravates de la souris.
16. Retour de l'intestin à l'abdomen. La paroi abdominale est fermée en deux couches en utilisant 5-0 suture de soie dans un mode course.
17. Administrer un bolus de 1,0 ml de solution saline stérile normale chaud dans le ventre comme la réanimation liquidienne à la clôture, et 0,8 ml de solution saline normale est injecté par voie sous cutanée post-opératoire. Pas d'autres mesures de soutien sont nécessaires pendant la chirurgie. Récupérer l'animal sur une couverture chauffante. Temps implant totale est d'env. 90-120 min pour les débutants, 45-60 min avec l'expérience. Administrer la buprénorphine analgésie, 0,05 mg / kg, SC, 0,1-0,2 ml au début de la procédure et tous les 6-12 h pendant 72 heures post-op.

3. Évaluation de la greffe

1. Évaluer la fonction du greffon quotidiennement par palpation trans-abdominale.
2. Garder la souris comme si elle devait être reçu une injection intra-péritonéale.
3. Appuyez doucement sur la pointe d'un index contre la paroi abdominale et de déterminer la str battantongueur et la régularité de la greffe.
4. Offrir la qualité de la palpation un score de 4 (amplitude et la fréquence normale) à 0 (non-battant rejeté la greffe).

NOTES IMPORTANTES:

Tous les instruments sont stérilisés, des gants stériles sont portés tout au long de la procédure et un champ stérile est maintenu. Les chirurgies donateurs et bénéficiaires sont effectués avec l'utilisation d'un microscope opératoire. Veiller à ce que les anastomoses sont «propres». C'est que les parois arrière ne sont pas pris en plaçant des points. Cela entraînera un rétrécissement important de s'écouler qui sera plus que probablement suite à une greffe échoué et dans les cas extrêmes à des membres postérieurs paralysie. Il est également essentiel que toute l'épaisseur passe y compris l'adventice vasculaire et l'intima de l'aiguille de suture sont atteints. Evertion des bords garantit également qu'il n'y a intima-à-intima de contact, ce qui contribue à l'étanchéité et à la cicatrisation des anastomoses. Un autre fait d'importance vitaleou est de s'assurer que la tension des lignes de suture des anastomoses est également optimale. Trop lâche et il y aura une fuite irréversible, trop serré et une sténose de s'écouler entraînera. Si du côté artériel cela se traduira par une mauvaise perfusion du greffon, si sur le côté veineux cœur congestionné entraînera.

Representative Results

L'utilisation de cette technique chirurgicale ouvre la voie à des études, soit la survie du greffon / rejet simples, ou des protocoles expérimentaux très complexes. Dans l'étude décrit brièvement dans la figure ci-dessous, nous avons cherché à définir la participation, le cas échéant, de Fas et / ou la perforine que les mécanismes de T CD4 rejet cardiaque à médiation cellulaire. Ceci a été rendu possible par le choix extraordinaire de souches de souris qui sont disponibles aujourd'hui. Les résultats démontrent que le rejet d'allogreffes cardiaques directement par les cellules T effectrices CD4 nécessite la contribution de remplacement de greffage Fas expression et expression de la perforine T de la cellule. À notre connaissance, c'est la première démonstration que l'activité cytolytique par les cellules T CD4 peut jouer un rôle obligatoire pour le primaire rejet aigu d'allogreffe in vivo.

1.jpg "/>
. Figure 1 perforine et Fas représentez Obligez et voies parallèles de CD4 T rejet cardiaque B6 à médiation cellulaire, B6 PFPKO (perforine knock-out), et B6 gld cellules (Fas-ligand déficientes) T CD4 ont été utilisées pour reconstituer B6 chiffon ^{- / -} les bénéficiaires de C3H type sauvage ou C3H Fas déficient lpr allogreffes cardiaques. Retrait de Fas seul (♦, p = NS vs contrôle Poids C3H + B6 cellules T CD4) des cœurs de donneurs ou l'enlèvement ou la perforine seul à partir des cellules T CD4 (■, p = NS vs contrôle Poids C3H + B6 T CD4 cellules) n'a pas abrogé rejet. Fait intéressant, la suppression de FasL à partir de cellules effectrices T CD4 n'a retard rejet significativement (●, p <0,02 vs cellules C3H Wt + B6 T CD4, p <0,01 vs cellules C3H Wt + B6 PFPKO T CD4, et p <0,01 vs . C3H lpr + B6 de cellules T CD4). Cependant, la plupart des allogreffes étaient encore rejetées (4 sur 5). De manière significative, l'élimination simultanée du donneur Fas et T CD4 cellulaire perforinerejet complètement abrogée (○, p <0,002 vs contrôle Poids C3H + B6 cellules T CD4, Poids C3H + B6 cellules T CD4 PFPKO, et C3H lpr cellules T CD4 + B6). Cette abrogation était significativement plus robuste que la suppression individuelle de FasL des cellules T CD4 (○, p <0,003 vs contrôle Poids C3H + cellules B6 gld T CD4). De Grazia et al ^10. Reproduit avec la permission.

Discussion

Cette technique chirurgicale n'est pas facile à maîtriser, mais une fois maîtrisé est un puissant outil de recherche. Le chercheur / chirurgien est récompensé par la cohérence de la technique et par l'attention au détail. Patience pendant la phase d'apprentissage est la clé. Comme publié par Niimi 3, à l'aide d'un outil d'apprentissage de vidéo sur ce qu'il faut en moyenne 11 tentatives pour atteindre la première procédure succès et 78 tentatives pour parvenir à un taux de réussite de 90%. Vidéos sont devenus un outil pédagogique important dans la chirurgie ^11,12.

Dépannage

Saignement des anastomoses peut se produire et cela est probablement attribuable à un manque de tension soit correcte dans les sutures, ou trop peu de points de suture. Même si un agent induisant la coagulation tels que Gelfoam peut être utile pour réduire les fuites, nous recommandons que le chirurgien doit s'appuyer sur une bonne technique. Encombré coeur non battant est le plus souvent due à des anastomoses qui sont trop serrés, en particulier sur le côté veineux. Un non-bienheureuxng, greffé non perfusé est souvent causée par une bulle d'air qui a voyagé dans l'une des artères coronaires. Il est important de maintenir un champ humide-à-humide pour éviter l'entrée des bulles dans les vaisseaux.

Limites de la technique

Cette technique n'est pas adaptée si un chercheur veut étudier les effets sur un coeur entièrement fonctionnel. Il faudrait pour cela une technique de transplantation orthotopique, qui s'est jusqu'ici révélée impossible à effectuer.

Significatives par rapport aux méthodes existantes

Si l'on veut étudier les effets sur, une transplantation d'organe solide entièrement vascularisé chez la souris, puis le modèle de cœur est probablement le plus simple à maîtriser. Des modèles murins de cancer du poumon, du rein et de foie existent, mais sont beaucoup plus difficiles à apprendre et parfait.

Étapes critiques dans le protocole

Il est extrêmement important que toute l'épaisseur pânes dont l'adventice et la tunique vasculaire de l'aiguille de suture sont réalisés. Evertion des bords garantit également qu'il n'y a intima-à-intima de contact, ce qui contribue à l'étanchéité et à la cicatrisation des anastomoses. Un autre facteur extrêmement important est de s'assurer que la tension des lignes de suture anastomotique est également optimale. Trop lâche et il y aura une fuite irréversible, trop serré et une sténose de s'écouler entraînera. Si du côté artériel cela se traduira par une mauvaise perfusion du greffon, si sur le côté veineux cœur congestionné entraînera.

Surtout, la répétition, la cohérence de la procédure et de l'attention constante aux détails se produire d'excellents résultats et des données susceptibles d'être financés et publiables.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrument	Roboz #	Fine Science Tools #	Arosurgical #
Straight micro-dissecting forcep #5	RS-5015	11295-51
Curved micro-dissecting forcep #7	RS-5047	11297-00
Curved serrated forcep	RS-5137	11052-10
Vannas micro-dissecting scissors, short	RS-5610		09.140.08
Micro-dissecting scissors, straight, sharp, long		11.602.11
Micro spring handle needle holder			11.549.15
Straight mosquito forcep		91308-12
Micro-dissecting scissors, straight, blunt	RS-5962	14078-10
Micro-dissecting scissors, curved, blunt	RS-5981	14079-10
Micro retractor	RS-6540
Instrument tray, 10” x 6 ½” x ¾”	RT-1350S
Silk suture, 5/0, 22.5 m spool		18020-50
10/0 nylon			T4A10Q07
5/0 silk			E19A05N
Gloves		Biogel from Medex Supply
Drapes		Precept, #64-9012-9
Syringes		B-D 1 cc insulin, #329424
Cotton applicators		Fisher-brand, #23-400-100
Povidone-Iodine swabs		PDI, #B40600
4/0 Cotton ties			Domestic cotton autoclaved with instruments