Sonication facilitée immunofluorescence de phase tardive embryonnaire et larvaire<em&gt; Drosophila</em&gt; tissus<em&gt; In Situ</em

Résumé

L’immunomarquage est une technique efficace pour visualiser des types de cellules et des protéines spécifiques dans les tissus. En utilisant la sonication, le protocole décrit ici réduit la nécessité de disséquer les tissus de Drosophila melanogaster des embryons et des larves à un stade avancé avant l’immunomarquage. Nous fournissons une méthodologie efficace pour l’immunomarquage des larves de montures entières fixées au formaldéhyde.

Résumé

Les études réalisées chez Drosophila melanogaster embryons et des larves donnent un aperçu essentiel dans les processus de développement tels que la spécification du destin cellulaire et l'organogenèse. Immunomarquage permet la visualisation de tissus et organes en développement. Cependant, une cuticule protectrice qui se forme à la fin de l'embryogenèse empêche la pénétration des anticorps dans des embryons à un stade avancé et des larves. Bien que la dissection avant immunomarquage est régulièrement utilisé pour analyser les tissus des larves de drosophile, il s'avère inefficace pour certaines analyses parce que les petits tissus peuvent être difficiles à localiser et isoler. Le traitement par ultrasons offre une alternative à la dissection dans les protocoles de larves de drosophile immunomarquage. Il permet d'obtenir rapidement un traitement simultané d'un grand nombre d'embryons à un stade avancé et des larves et maintient la morphologie situ. Après fixation dans le formol, un échantillon est soumis à une sonication. L'échantillon est ensuite soumis à une coloration immunologique spécifique de l'antigène avec ant primaireet ibodies Anticorps secondaires marqués par fluorescence pour visualiser types de cellules cibles spécifiques et des protéines par microscopie de fluorescence. Au cours du processus de sonication, une mise en place correcte de la sonde de sonication ci-dessus de l'échantillon, ainsi que la durée et l'intensité de la sonification, est critique. Modifications mineures supplementaires aux protocoles d'immunomarquage standard peuvent être nécessaires pour les taches de haute qualité. Pour les anticorps ayant un faible rapport signal à bruit, de plus longs temps d'incubation sont typiquement nécessaires. Comme une preuve de concept pour ce protocole de traitement par ultrasons facilitée, nous montrons immunomarquages ​​de trois types de tissus (testicules, ovaires, et des tissus neuronaux) à une série de stades de développement.

Introduction

Embryons de drosophile et les larves fournissent un excellent modèle pour étudier les processus de développement dans de nombreux organes et tissus. L'imagerie de cellules individuelles est souvent nécessaire dans ces études afin de déterminer les milieux complexes dans lesquelles les cellules se développent. La visualisation des cellules dans les tissus peut être réalisée par coloration immunologique. Bien décrits immunomarquage protocoles existent pour les tissus embryonnaires de drosophile <17 h après la ponte (AEL) ^1-3. Cependant, une protection formes de la cuticule vers la fin de l'embryogenèse, empêchant la pénétration d....

Protocole

1: Préparation d'une cage de collecte

1. Anesthésier les jeunes, les mouches fertiles avec du CO _2. Transfert mouches anesthésiés dans une cage. Pour obtenir un rendement optimal, utilisez 100-120 mouches adultes allant de 2-7 jours d'âge à un ratio de 4: 1 femmes-hommes. Laisser vol une période d'acclimatation appropriée, ~ 24 heures avant d'obtenir l'échantillon pour la fixation. Si la cage a été mis en place avec des femelles vierges accouplées à des mâles, une utilisation de 36 - période d'acclimatation de 48 h.
2. Sur l'extrémité ouverte de la cage, placer une plaque de gélose de jus de pommes préalablement p....

Résultats

Pour démontrer l'efficacité de l'immunomarquage base ultrasons dans l'analyse de l'embryon à un stade avancé et les tissus des larves in situ, les embryons de type sauvage et des larves ont été traitées pour immunomarquage des testicules, des ovaires, et le tissu neural. Les échantillons ont été imagées par microscopie à foyer commun et les résultats représentatifs sont présentés (figure 1 et figure 2). Les résultats montrent que le protocole décrit est efficace.......

Discussion

Ce protocole fournit un procédé pour cibler avec succès immunocoloration embryonnaire de Drosophila et tissus larvaires in situ, ce qui élimine la nécessité d'une dissection. Selon les protocoles antérieurs pour la coloration des embryons précoces ^1,2,3, la membrane chorionique est éliminé en utilisant 50% de javel (NaOCl). Les échantillons sont fixés dans du formol et du méthanol. Parce que la cuticule des larves provoque échantillon âgé de flotter, la totalité de l'échantillon est .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tableau 1 : Réactifs et tampons
Tampon phosphate Triton X-100 (PBTx)			Pour 5 L : 500 ml PBS 10X, 4,45 L ddH2O, 50 ml Triton 10 %. Magasin chez RT.
Tampon phosphate salin 10X (PBS 10X)			Pour 1 L en dH2O : 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4. Ajoutez des composants et remplissez jusqu’au volume approprié. Conserver à 4 °C.
Triton 10 %			Pour 50 ml : 5 ml de Triton, 5 ml de PBS 10X, 45 ml de ddH2O. Rock à mélanger. Magasin chez RT.
PEMS			0,1 m (pH 6,9), 2,0 mM MgSO4, 1,0 mM EGTA. Magasin chez RT.
Tuyaux			Pour 400 ml d’une solution 0,25 M (pH 6,9) : 30,24 g Tuyaux dH20 NaOH. Dissoudre les pipes dans 300 ml de dH2O, puis ajuster à pH 6,9 avec du NaOH. Porter le volume total à 400 ml avec dH2O et autoclave. Magasin chez RT.
Formaldéhyde			37 % de formaldéhyde en poids dans du méthanol. Conservez le mélange de déchets de formaldéhyde, d’heptane et de méthanol dans un récipient hermétiquement fermé dans une hotte avant de l’éliminer conformément aux directives de l’établissement.
Heptane		CAS 142-82-5	n-Heptane. Conservez le mélange de déchets de formaldéhyde, d’heptane et de méthanol dans un récipient hermétiquement fermé dans une hotte avant de l’éliminer conformément aux directives de l’établissement.
Méthanol		CAS 67-56-1	Stocker chez RT. Stocker le formaldéhyde, l’heptane et le mélange de déchets de méthanol dans un récipient hermétiquement fermé dans une hotte avant de l’éliminer conformément aux directives de l’établissement.
Tampon phosphate Tween (PBTw)			Pour faire 1 L : 100 ml de PBS 10X, 890 ml de ddH2O, 10 ml de Tween 10 %. Filtrer la stérilisation après avoir ajouté tous les composants. Conserver à 4 °C.
Tween 10 %			Pour 50 ml : 5 ml de Tween, 5 ml de PBS 10X, 40 ml de ddH2O. Rock à mélanger. Magasin chez RT.
Tampon albumine/phosphate sérique bovine Tween (BBTw)			Pour faire 1 L : 100 ml de PBS 10X, 890 ml de ddH2O, 10 ml de Tween 10 %, 1 g d’albumine sérique bovine (BSA). Ajouter du BSA puis stériliser à l’aide d’un 0,2 &mu ; Unité de filtration sous vide M. Conserver à 4 °C.
Sérum de chèvre normal (NGS)	ackson ImmunoResearch Laboratories	005-000-121	Pour faire 10 ml : Sérum de chèvre normal 10 ml ddH2O. Ajouter du ddH2O à la fiole de NGS et stériliser à l’aide d’un 0,2 &mu ; Filtre M Syrninge. Stocker les aliquotes à -20 °C.
1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)		CAS : 281-57-9	Pour faire 100 ml : 25 ml de ddH2O, 1 ml de Tris HCl (1M, pH 7,5), 2,5 g de DABCO solide, 3,5 ml de 6N HCl, 250 &mu ; l 10N NaOH, 70 ml de glycérol. Dans un bécher de 250 ml avec agitateur, ajoutez ddH2O, Tris HCl et DABCO. Remuez puis ajoutez du HCl 6N, du NaOH 10 N et du glycérol. Ajouter ensuite 10N de NaOH goutte à goutte jusqu’à ce que la solution atteigne un pH de 7,5. Aliquote. Stocker les aliquotes à -20 °C.
		de DABCO + p-phénylènediamine (PPD)	1,765 ml de NaHCO3, 0,353 Na2CO3, 0,02 g de PPD (CAS : 106-50-3). Dissoudre la PPD dans les solutions NaHCO3 et NaCO3. Ajouter 60 &mu ; l de solution PPD à 500 &mu ; l de DABCO. Stocker les aliquotes à -20 °C.
			Pour faire ~200 assiettes : 45 g de gélose (CAS#9002-18-0), 45 g de sucre cristallisé (du commerce), 500 ml de jus de pomme (du commerce), 15 ml de Tegosept 10 %, 1,5 ml de ddH2O. Ajouter la gélose à la ddH2O dans une fiole de 4 L puis faire cuire à l’autoclave pendant 30 min. Mélanger le jus de pomme et le sucre sur une plaque à mélanger chauffée. Ajouter graduellement le mélange de jus de pomme à l’agar autoclave. Mélanger sur une plaque d’agitation chauffée puis aliquote des volumes de 10 ml dans des boîtes de Pétri de 35 mm et laisser reposer à RT pour solidifier. Conserver à 4 °C.
Tegosept 10 %			Pour faire 100 ml : 10 g de Tegosept, 100 ml d’éthanol. Stocker les aliquotes à -20 °C.
Pâte de			50 g de levure active sèche. Ajouter graduellement le ddH2O dans le bécher contenant la levure tout en remuant jusqu’à l’obtention d’une consistance pâteuse. Conserver à 4 °C.
Tableau 2 : Matériaux de coloration
DAPI	Invitrogen	D3571	1:1000, stock à 5 mg/ml.
Lapin anti-Vasa			1:250, un cadeau de Ruth Lehmann.
Souris anti-fasciclin III	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7G10	1:10
Souris anti-1B1	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1	1:4
Guniea pig anti-Traffic Jam			1:2500, un cadeau de Dorthea Godt (Li et al, 2003).
Souris anti-Prospero	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Prospero MR1A	1:10
Rat anti-Elav	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7EBA10	1:30
souris anti-Repo	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	8D12	1:10
Chèvre anti-lapin Alexa546	Invitrogen	A11010	1:500
Chèvre anti-souris Alexa488	Invitrogen	A11029	1:500
Chèvre anti-guniea cochon Alexa633	Invitrogen	A21105	1:500
Chèvre anti-rat Alexa488	Invitrogen	A11006	1:500
Tableau 3 : Matériaux et équipement
Cages à mouches	Fabriquées à la main ; Genesee Scientific Corporation	Sans objet ; Bouteilles : 32-130 ; Cage préfabriquée : 59-101	Fabriqué en découpant un tube acrylique coulé transparent (1 3/4 pouce de diamètre) en segments de 4 pouces de haut avec une scie à onglets composée à 400 tr/min. Écran en acier inoxydable ultrafin (a été fixé à une extrémité de la cuve avec de la colle acrylique. Une autre méthode utilisant une bouteille de nourriture pour mouches vide peut être trouvée dans Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Les cages peuvent également être achetées auprès de la Genesee Scientific Corporation.
Sonicateur : Sonificateur numérique Branson 250	Modèle Branson : Sonificateur numérique Branson 250
	Branson	Modèle # : 102C (CE)	EDP : 101-135-066 ; S/N : OBU06064658
Filtre à seringue	Nalgene	190-25-20	0.2 &mu ; m cellulose, filtre à membrane d’acétate
Système d’imagerie : Microscope confocal à disque rotatif avec source lumineuse multichromatique, caméra CCD numérique et logiciel d’imagerie	Microscope : Olympus, Source lumineuse : Lumen Dynamics, Caméra : Q-Imaging, Logiciel d’imagerie : Intelligent Imaging Inc.		Microscope : BX51 équipé d’un disque rotatif DSU, Source lumineuse : X-Cite 120Q, Caméra : RETIGA-SRV, Logiciel d’imagerie : Slidebook 5.0
Unité de filtre à vide	Nalgene	450-0020	0.2 &mu ; M Filtre à membrane en nitrate de cellulose

Tuyaux Solution levure~ Sonde sonificatrice