Summary
ووصف طريقة لتنقية فعالة من البروتينات الانصهار المزدوج بكتيريا الموسومة والمجمعات الخاصة على تعديل streptavidin (بكتيريا-Tactin) الراتنج تساهميا عبر ربط مع مكرر (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3). أسلوب لديها مزايا السرعة، وحسن الانتعاش البروتين الهدف ونقاء عالية، ومتوافق مع تحليل لاحقة من قبل مطياف الكتلة.
Abstract
أصبحت تنقية تقارب من البروتينات الانصهار بكتيريا الموسومة على راتنجات يحمل streptavidin هندسيا (بكتيريا-Tactin) طريقة تستخدم على نطاق واسع لعزل المجمعات البروتين في ظل الظروف الفسيولوجية. البروتينات الانصهار تحتوي على نسختين من بكتيريا علامة الثاني، المعين المزدوج بكتيريا علامة أو علامة SIII، لديها ميزة أعلى النسب للبكتيريا-Tactin مقارنة مع تلك التي تحتوي على واحد فقط بكتيريا البطاقات، مما يسمح تنقية البروتين أكثر فعالية. ومع ذلك، ويقابل هذه الميزة من حقيقة أن شطف من البروتينات المزدوج بكتيريا الموسومة مع البيوتين قد تكون غير مكتملة، مما أدى إلى انخفاض الانتعاش البروتين. الانتعاش يمكن تحسنت بشكل كبير باستخدام تغيير طبيعة شطف مع دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS)، ولكن هذا يؤدي إلى تلوث عينة مع بكتيريا-Tactin صدر من الراتنج، مما يجعل الفحص يتعارض مع تحليل البروتين المصب. للتغلب على هذا القيد، قمنا بتطوير طريقة tetramer حيث يقترن الراتنج من بكتيريا-Tactinواستقرت أول من التساهمية عبر ربط مع مكرر (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) ثم يستخدم الناتجة الراتنج عبر ربط لتنقية البروتين المجمعات المستهدفة في خطوة تنقية دفعة واحدة. شطف كفاءة مع SDS يضمن الانتعاش البروتين جيدة، في حين أن غياب بكتيريا تلوث-Tactin يسمح تحليل البروتين المصب بواسطة مطياف الكتلة. كدليل على المفهوم، ونحن هنا وصف بروتوكول لتنقية البروتين الفيروسي SIII الموسومة VPG-Pro من نوى N. المصابة بالفيروسات النباتات benthamiana باستخدام الراتنج polymethacrylate بكتيريا-Tactin مرتبطة مع الصليب BS3. البروتوكول نفسه يمكن أن تستخدم لتنقية البروتين أي التوأم بكتيريا الموسومة المصالح وتميز شركائها ملزمة الفسيولوجية.
Introduction
في السنوات الأخيرة، أصبحت التكنولوجيا بكتيريا البطاقات المستخدمة على نطاق واسع في العديد من مجالات البحوث الطبية الحيوية، بما في ذلك البروتينات وعلم الأحياء الهيكلي. هذه التكنولوجيا لتنقية البروتين، والذي يعتمد على مزيج من البروتينات المؤتلف لفترة قصيرة بكتيريا علامة الببتيد، قد نضجت مع ظهور المصفوفات تقارب تحمل بكتيريا-Tactin، وهو البديل المعدلة وراثيا من streptavidin مع تحسين القدرات ملزمة الببتيد. 1، 2 البروتينات الانصهار تحتوي على نسختين من بكتيريا علامة الثاني، المعين المزدوج بكتيريا علامة أو علامة SIII، المعرض تقارب أعلى للمصفوفات بكتيريا-Tactin من تلك التي تحتوي على واحد فقط بكتيريا علامة، وضمان تنقية أكثر كفاءة من البروتينات المؤتلف و شركاء ملزمة المرتبطة بها. ومع ذلك، فإن تقارب أعلى من البروتينات المزدوج بكتيريا الموسومة إلى بكتيريا-Tactin ديها أيضا سلبيات. شطف التنافسية لهذه البروتينات مع البيوتين الزائدة قد تكون غير مكتملة، مما يؤدي إلى انخفاض العائد المستهدف البروتين. A مكفاءة خام البديل هو شطف مع SDS، لكنه يؤدي إلى تلوث العينة غير مرغوب فيها مع بكتيريا-Tactin صدر من الراتنج، مما يجعل الفحص يتعارض مع تحليل البروتين. تعرض هذه الورقة تقنية للتغلب على هذا التحديد عن طريق تثبيت لأول مرة tetramer يقترن الراتنج من بكتيريا-Tactin حسب المادة الكيميائية عبر ربط ثم باستخدام SDS إلى أزل البروتينات المزدوج بكتيريا الموسومة والمجمعات المرتبطة بها من الناتج راتنج عبر ربط. وبالتالي، لا يمكن أن يتحقق العائد كافية من البروتين دون تلوث العينة مع بكتيريا-Tactin، مما يتيح المزيد من التحليل بواسطة مطياف الكتلة.
هذه الطريقة مناسبة لتنقية أي انصهار بروتين المؤتلف مع المعرضة للسطح SIII علامة 3 أو التوأم بكتيريا علامة (WSHPQFEK تسلسل الأحماض الأمينية (GGGS) 3 WSHPQFEK وSAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK، على التوالي). البروتين يمكن أن يكون من الحيوان والنبات أو الأصل البكتيرية ويمكن عزلها من خلية إما مجموعالمحللة أو المخصب عضية الكسر. كمثال على ذلك، ونحن تصف هنا تنقية من البروتين SIII الموسومة VPG برو من الفيروسات البطاطس A (PVA) 4 من الكسر النووية من PVA المصابة النباتات benthamiana نيكوتيانا. تم عزل جزء النووية كما هو موضح سابقا 5، مع إجراء التعديلات التالية: لم يعاملوا الخلايا مع الفورمالديهايد، تم استبداله بوتيرات الصوديوم في جميع مخازن مع 5 ملي فلوريد الصوديوم، تم استبداله كاملة مثبط البروتياز مع PMSF، تريتون X-100 تركيز في استخراج تم تخفيض العازلة # 2 إلى 0.3٪ (ت / ت) وكان بيليه معلق النووي التي تم الحصول عليها عن طريق الطرد المركزي من خلال وسادة السكروز (العازلة استخراج # 3) في 1.45 مل من العازلة ملزمة قبل المبردة وتناوب لمدة 1.5 ساعة في 4 درجات مئوية. تم معالجة واستخراج النووية الناتجة تحتوي على البروتين الطعم SIII الموسومة والمجمعات المرتبطة بها (عينة البروتين الطعم) وفقا لبروتوكول موضح أدناه (انظر القسم 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. عبر ربط بكتيريا-Tactin Polymethacrylate الراتنج مع مكرر (sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)
- تتوازن واحدة microtube مختومة تحتوي على 2 ملغ من BS3 عبر رابط إلى درجة حرارة الغرفة. تنبيه: BS3 هو عبارة عن مادة خطرة. ارتداء قفازات واقية ونظارات واقية.
- في resuspend بكتيريا-Tactin الراتنج polymethacrylate (50٪ معلق في 100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA، و 150 ملي مول كلوريد الصوديوم) من قبل وجيزة قوية تهز ونقل على الفور 600 ميكرولتر من تعليق إلى عمود الدوران باستخدام طرف ماصة مع خفض نهاية قبالة.
- أجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. تجاهل التدفق من خلال وإضافة 450 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى العمود.
- تكرار الخطوة السابقة أكثر من مرة 2 لتحل محل تماما عازلة تريس مع برنامج تلفزيوني وترك الراتنج في 430 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تعديلها لدرجة الحموضة 8.0 بعد الطرد المركزي الماضي.
- ثقب احباط من microtube مع BS3 مع طرف ماصة تحتوي على 1001، ل من الماء عالى النقاء. حل مسحوق BS3 في الماء من قبل pipetting بلطف صعودا ونزولا، وعلى الفور إضافة 20 ميكرولتر من الحل إلى عمود الدوران. تركيز النهائي من BS3 في رد الفعل عبر ربط هو ~ 1.2 ملم.
- تدوير العمود لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تأكد من أن يتم خلط الراتنج بشكل صحيح مع حل BS3.
- لإرواء رد الفعل، إضافة 6 ميكرولتر من 3M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5 وتدوير العمود لمدة 15 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة.
- أجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. تجاهل التدفق من خلال و resuspend الراتنج عبر ربط في 450 ميكرولتر من تريس مخزنة المالحة مع توين 20 (TBST). تكرار الطرد المركزي وغسل الخطوات مرتين أخريين. في الخطوة الأخيرة، resuspend والراتنج في 450 ميكرولتر من TBS.
- نقل تعليق الراتنج لأنبوب جديد باستخدام طرف ماصة مع نهاية تقطع. resuspend والراتنج اليسار في العمود مع 450 ميكرولتر من TBS آخر ونقل إلى نفس الأنبوب. تكرار عشره الخطوة الأخيرة مرة أخرى لضمان نقل أقصى الراتنج من العمود إلى الأنبوب.
- السماح للأنبوب الوقوف لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وضبط مستوى الصوت إلى 600 ميكرولتر من خلال إزالة TBS الزائدة. الراتنج جاهز للاستخدام الفوري (مستحسن) أو يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية، من دون تجميد.
2. ملزم من البروتين بيت التوأم بكتيريا الموسومة والأفراد المرتبطين مجمعات للصليب المرتبطة بكتيريا-Tactin Polymethacrylate الراتنج
- الطرد المركزي 1 مل من العينة البروتين الطعم في المنطقة العازلة ملزمة في 17،000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية ونقل طاف لأنبوب جديد.
- للحد من البروتينات ملزمة البيروكسيديز الذاتية إلى الراتنج بكتيريا-Tactin، إضافة أفيدين إلى تركيز النهائي من 100 ميكروغرام / مل وتناوب لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- إذا تم تخزين الراتنج عبر ربط من الخطوة 1.10 لفترة طويلة من الزمن في 4 درجات مئوية، وجمع الراتنج بواسطة الطرد المركزي في 400 x ج FOص 1 دقيقة في 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف ويغسل الراتنج مع 1 مل من TBST. تكرار الطرد المركزي وغسل الخطوات مرتين أخريين، الأولى مع TBST ثم مع TBS. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 400 x ج لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية، وضبط لحجم الأصلي عن طريق إزالة TBS الزائدة.
- resuspend وعبر ربط الراتنج بكتيريا-Tactin من قبل vortexing. إضافة على الفور 50 ميكرولتر من تعليق الراتنج إلى الأنبوب الذي يحتوي على عينة بروتين الطعم باستخدام تلميح قطع ماصة وتناوب لمدة 30 دقيقة أخرى في 4 درجات مئوية.
- أثناء انتظار، تعيين thermomixer إلى 55 درجة مئوية، وتسخين 500 ميكرولتر من شطف العازلة للاستخدام في الخطوة 3.1.
- أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل طاف ويغسل الراتنج على محور دوار لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية مع 1 مل من قبل المبردة غسل العازلة # 1. تكرار الطرد المركزي وغسل خطوات ثلاث مرات. في الخطوة الأخيرة، resuspend والراتنج في 250 ميكرولتر من غسل العازلة # 2.
- آر ansfer تعليق الراتنج إلى عمود الدوران الطازجة. resuspend والراتنج المتبقية في الأنبوب في 250 ميكرولتر آخر من غسل العازلة رقم 2 ونقل إلى نفس العمود.
- أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل من خلال تدفق ونقل العمود إلى الطازجة الدلفين الأنف 2 مل أنبوب. الشروع فورا في الخطوة شطف أدناه.
3. شطف من البروتين المجمعات محددة
- إضافة 150 ميكرولتر من شطف العازلة محمى من الخطوة 2.4 إلى عمود الدوران.
- احتضان في thermomixer لمدة 5 دقائق عند 55 درجة مئوية، والهز في 1،400 دورة في الدقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تجاهل العمود وتخزين البروتينات المستهدفة المنقى في ≤ -20 درجة مئوية.
| الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) | نا 2 هبو 4 | 10 ملي |
| KH 2 PO 4 | 2mm و |
| كلوريد الصوديوم | 137 ملي |
| بوكل | 2.7 ملي |
| درجة الحموضة تعديلها إلى 7.4 ما لم ينص على خلاف ذلك (الرقم الهيدروجيني 8.0 في القسم 1.4) | |
| تريس مخزنة المالحة (TBS) | |
| تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4 | 50 ملي |
| GHT = "20" على غرار = "الطول: 20px؛ العرض: 299px؛"> كلوريد الصوديوم | 150 ملي |
| تريس مخزنة المالحة مع توين 20 (TBST) | |
| تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4 | 50 ملي |
| كلوريد الصوديوم | 150 ملي |
| توين 20 | 0.1٪ (V / V) |
| ملزمة العازلة | |
| تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0 | 25 ملي |
| كلوريد الصوديوم | س؛ "> 550 ملي|
| ناف | 5 ملي |
| EDTA | 0.5 ملي |
| الغليسيرول | 10٪ (V / V) |
| PMSF | 0.1 ملي |
| غسل العازلة # 1 | |
| تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0 | 25 ملي |
| كلوريد الصوديوم | 500 ملي |
| ناف الدفتيريا> | 5 ملي |
| EDTA | 0.4 ملي |
| Igepal CA-630 | 0.2٪ (V / V) |
| الغليسيرول | 5٪ (V / V) |
| PMSF | 0.1 ملي |
| غسل العازلة # 2 | |
| تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0 | 25 ملي |
| كلوريد الصوديوم | 150 ملي |
| تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0 | 25 ملي |
| SDS | 1٪ (ث / ت) |
الجدول 1. المخازن المؤقتة المستخدمة في هذه الدراسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويتضح الإجراء تنقية تخطيطي في الشكل 1، جنبا إلى جنب مع تمثيل من المشاكل المرتبطة غيرها من وسائل تنقية القائمة.
الشكل 1. تمثيل تخطيطي لإجراء التنقية. يتضمن سير العمل لتحقيق الاستقرار للجانب الراتنج بكتيريا-Tactin tetramer عبر التساهمية عبر ربط مع BS3، ملزمة للبروتين الطعم المزدوج بكتيريا الموسومة والمجمعات المرتبطة الراتنج عبر ربط ، تجرف من البروتينات غير منضم، تغيير طبيعة شطف من المجمعات البروتين ملزمة على وجه التحديد مع 1٪ SDS وتحليلها من قبل اللوني السائل، جنبا إلى جنب مطياف الكتلة (LC-MS/MS). مجالين الحمراء في البروتين الطعم دلالة على التوأم بكتيريا البطاقات. وترد القيود المفروضة على وسائل أخرى في تنقية أقحممربعات على اليمين. وهي تشمل شطف غير مكتملة من البروتينات الهدف مع البيوتين وتلوث العينة مع بكتيريا-Tactin التالية تغيير طبيعة شطف مع 1٪ SDS.
وتظهر نتائج نموذجية من تنقية البروتين SIII الموسومة باستخدام العرضي مرتبطة BS3 بكتيريا-Tactin الراتنج polymethacrylate وتغيير طبيعة شطف مع 1٪ SDS في الشكل 2. بنسبة 10٪ (15 ميكرولتر) من العمود شطافة تدور تحتوي على تنقية SIII الموسومة تم تحليل PVA VPG برو وما يرتبط بها من البروتينات بواسطة SDS-PAGE تليها الفضة تلطيخ. غياب 52 كيلو دالتون الفرقة الموافق PVA VPG برو في حارة السيطرة السلبية أكدت خصوصية المنسدلة. تم تطبيق 40 ميكرولتر من تبقى تدور العمود شطافة إلى خالية من الكيراتين SDS هلام وتم قطع المقابلة من الممر وكان يهضم البروتينات الواردة مع التربسين وتحليلها من قبل اللوني السائل، جنبا إلى جنب مطياف الكتلة (LC-MS/MS). حددت تحليل الطيف الكتلي الفيروسي RNA-DEPEndent الحمض النووي الريبي بوليميراز (المتنسخة) بنك الاستثمار القومي كشريك التفاعل من VPG برو. تم الكشف عن الببتيدات زيتية متعددة المقابلة لبنك الاستثمار القومي في جميع مكررات البيولوجية أربعة من تنقية تقارب وليس في التعبير عن الضوابط أربعة VPG برو دون SIII علامة، مؤكدا خصوصية التفاعل. لأن الوزن الجزيئي للالمنقار (59 كيلو دالتون) هو قريب من SIII الموسومة VPG برو (52 كيلو دالتون)، يبدو أن البروتينات اثنين والفرقة المزدوج خلال SDS PAGE تحليل (الشكل 2، رأس السهم). أخذت معا، فإن النتائج المذكورة أعلاه تقديم الأدلة التجريبية التي تقارب على تنقية راتنجات بكتيريا-Tactin تساهميا عبر ربط مع BS3 يمكن استخدامها بنجاح لعزل البروتينات المزدوج بكتيريا الموسومة وتحديد الشركاء ملزمة الفسيولوجية عن طريق قياس الطيف الكتلي.
الرقم 3. شطف البيوتين من SIII الموسومة PVA VPG-Pro من بكتيريا-Tactin الراتنج polymethacrylate و ناقصة مقارنة مع 1٪ شطف SDS. ويوضح الشكل لطخة مناعية مضادة للVPG من eluates من الخرز بكتيريا-Tactin. ومزال حبات إما مع 15 ملم البيوتين أو مع 1٪ SDS. الفرق في كثافة إشارة تعكس غلة البروتين المختلفة التي تم الحصول عليها مع تقنيات شطف اثنين. ضوابط السلبية تتوافق مع التنقيات من الخلايا المصابة بالفيروس معربا عن VPG برو دون SIII البطاقات.
الشكل 4. التساهمية عبر ربط مع BS3 يمنع الإفراج عن بكتيريا-Tactin من الراتنج خلال SDS شطف. يوضح الشكل هلام الملطخة الفضة من eluates SDS من غير مرتبطة عبر (حارة اليسار) وعبر ربط-BS3 (حارة اليمين) بكتيريا-Tactin الراتنج polymethacrylate. لاحظ وجود بكتيريا-Tactin صدر في الممر الأيسر ولكن عدم وجوده في الممر الأيمن.
معشوقة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> 
الرقم 5. التركيب الكيميائي للمكرر (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) والتفاعل عبر ربط مع مجموعات إبسيلون الأمينية من بقايا يسين في بكتيريا-Tactin.
الرقم 6. تنقية المزدوج بكتيريا الموسومة بروتين الفلورية الخضراء (GFP) على ربط غير عبر وBS3-عبر ربط بكتيريا-Tactin الراتنج polymethacrylate. اثنان كميات متساوية من الجنينية الكلى 293 الخلايا البشرية معربا عن GFP المزدوج بكتيريا الموسومة و lysed ومعالجتها على نحو مماثل باستخدام بروتوكول أعلاه، إلا أنه في حالة واحدة تم الراتنج مرتبطة مع الصليب BS3 وفي BS3 أخرى قد تكونأون استبداله بالماء في رد الفعل عبر ربط. يوضح الشكل هلام SDS-بولكرلميد الملطخة الفضة وطخة مناعية مضادة للبروتينات GFP تنقيته. نلاحظ أن بعض الانخفاض في العائد البروتين هو الأصيل في أساليب تنقية تنطوي الكيميائية عبر ربط، ولكن هذا يتم تعويض من قبل عينة العالي النقاء بسبب غياب صدر بكتيريا-Tactin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول أعلاه يمكن استخدامها لتنقية أي بروتين الطعم المزدوج بكتيريا الموسومة المصالح والمجمعات المرتبطة به في أي مناسبة العازلة التي لا تحتوي على البيوتين أو denaturants قوية. في النسخة الحالية من بروتوكول، يتم تنفيذ ملزمة وغسل تحت شروط صارمة نسبيا في وجود الملح العالية والمنظفات غير الأيونية. على الرغم من هذه النتائج في أقل الخلفية، قد مجمعات البروتين الهشة فصل في ظل هذه الظروف. للحفاظ على مثل هذه المجمعات انخفاض تقارب، تركيز الملح قد خفضت وربما يتم تخفيض المنظفات غير أيوني أو حذفت من ملزمة ومخازن يغسل.
والميزة الرئيسية للنظام المزدوج بكتيريا علامة هو تقارب عالية من الصغيرة (3kDa) العلامة جنبا إلى جنب لstreptavidin هندسيا (بكتيريا-Tactin) 1، 2، مما يسمح للكفاءة في خطوة واحدة تنقية البروتينات المستهدفة والمجمعات الخاصة بهم حتى في دفعة واسطة. بسبب الربط القوي من التوأم بكتيريا علامةلبكتيريا-Tactin، الراتنج يمكن غسلها تحت شروط صارمة معتدلة، مثل المنظفات عالية و / أو تركيزات الملح، مما يؤدي إلى ارتفاع البروتين الهدف النقاء. ومع ذلك، مثل ملزمة قوية لها خلفياتها. حتى في حالة البروتينات مع واحد بكتيريا علامة الثاني (تسلسل الأحماض الأمينية WSHPQFEK)، شطف تنافسية من الراتنج قد يكون من الصعب أحيانا. على سبيل المثال، شطف من بكتيريا (II) الموسومة بروتين كيناز، NtCDPK2، من الراتنج polymethacrylate بكتيريا-Tactin مع 10 ملي desthiobiotin ثبت أن تنجح، والتي تتطلب تغيير طبيعة شطف مع SDS عينة العازلة 6. تم حل المشكلة فقط بعد أن تم استبدال desthiobiotin مع البيوتين أقوى المتنافسة (10 ملم) وأجري شطف خارج لمدة 5 دقائق مع قوي يهز 7. في حالة التوأم بكتيريا العلامة، التي لديها أعلى النسب للبكتيريا-Tactin، قد يكون الهدف شطف البروتين غير مكتملة حتى بتركيزات عالية البيوتين مثل 15 ملم. كما هو مبين في الشكل (3)،يمكن مزال سوى جزء صغير من SIII الموسومة PVA VPG-Pro من الراتنج بكتيريا-Tactin مع 15 ملي البيوتين مقارنة لكمية مزال مع 1٪ SDS. من المهم أن نلاحظ أن كفاءة شطف تنافسية المرجح يتوقف أيضا على طبيعة البروتين مزال أو معقدة البروتين. البروتينات أكبر وأكثر مسعور قد تعوق sterically إمكانية الوصول إلى جيب ملزمة البيوتين في بكتيريا-Tactin، مما يجعل شطف تنافسية أقل كفاءة. تم تلافي السلبيات أعلاه باستخدام شطف مع SDS، ولكن مثل شطف لديها مشاكلها الخاصة، التي تدور أساسا حول حقيقة أن التعرض لمواد التنظيف يؤدي إلى التفكك للجانب الراتنج tetramers بكتيريا-Tactin وتلوث العينة مع الافراج عن بكتيريا-Tactin 8. ويتجلى هذا في الشكل 4 (حارة اليسار)، مما يدل على كمية كبيرة من بكتيريا-Tactin أفرج عنه بعد الحضانة من الراتنج بكتيريا-Tactin في شطف العازلة التي تحتوي على 1٪ SDS. هذا التلوث أمر غير مقبول إذايحتاج العينة المراد تحليلها مزيدا من LC-MS/MS.
حل فعال لمشكلة التلوث أعلاه هو استقرار للجانب الراتنج بكتيريا-Tactin tetramer 9 بواسطة التساهمية عبر ربط. لهذا الغرض، ونحن توظيف للذوبان في الماء، غير شطورة، homobifunctional-الأمينات رد الفعل عبر رابط BS3 التي لها تاريخ في الاستخدام الناجح في تحقيق الاستقرار في هياكل البروتين 10-13. يبين الشكل 5 الصيغة الكيميائية للBS3 ولها عبر ربط رد مع المجموعات الأمينية الحرة إبسيلون من ليسين في بكتيريا-Tactin. عندما استقرت يقترن الراتنج بكتيريا-Tactin tetramer من قبل عبر ربط مع BS3، ومشكلة تلوث العينة مع الافراج عن بكتيريا-Tactin تم القضاء تقريبا (الشكل 4، الممر الأيمن). لأن للربط عبر مع BS3 لا يسبب اسعة تجميع البروتين 14، فإنه لا يقلل من إمكانية الوصول إلى البيوتين جيب ملزمة في streptavidin، مما يجعلالراتنج عبر ربط مناسبة لتنقية البروتينات الانصهار بكتيريا الموسومة. تجدر الإشارة، مع ذلك، أن المواد الكيميائية عبر ربط البروتينات مع النشاط البيولوجي (الأجسام المضادة، الخ) تستقر على حد سواء التشكل النشطة وغير النشطة من البروتين، مما يؤدي إلى فقدان بعض النشاط. على سبيل المثال، الأسلوب مناعي راسخة باستخدام الأجسام المضادة عبر ربط BS3 تنتج أقل من البروتين العائد المستهدف مقارنة مع الأجسام المضادة التي تم الحصول عليها غير مرتبطة عبر 15. ومع ذلك، يعتبر بعض فقدان النشاط البيولوجي ليكون مقبولا مفاضلة لتحسين نقاء العينة. لاحظنا نتائج مماثلة مع بكتيريا-Tactin الراتنج مرتبطة عبر BS3. كان العائد أقل نوعا ما من البروتين الحصول عليها مع الراتنج عبر ربط أكثر من تعويض من قبل تحسنت كثيرا نقاء العينة (الشكل 6).
تطبيق آخر محتمل للطريقة المقترحة في تنقية البروتينات الغشاء بكتيريا الموسومة solubilizإد مع المنظفات. المنظفات ضرورية للحفاظ على هذه البروتينات مسعور والمجمعات المرتبطة بها في الحل، ولكن قد يؤدي وجودهم إلى تلوث العينة مع بكتيريا-Tactin صدر من راتنج تقارب. وخير مثال على ذلك هو تنقية للبكتيريا (II) الموسومة البروتين الغشاء وفي NTT1 على حبات بكتيريا-Tactin لغرض بلورة البروتين 8. وجود laurylamidodimethylpropylaminoxide المنظفات (LAPAO) في شطف العازلة أدت إلى الإفراج عن بكتيريا-Tactin من الخرز والنمو اللاحق للبلورات غير مرغوب فيها بكتيريا-Tactin 8. تحقيق الاستقرار للجانب الراتنج بكتيريا-Tactin tetramer بواسطة التساهمية عبر ربط قد توفر وسيلة فعالة للتغلب على هذه المشكلة.
باختصار، استخدمت الكيميائية عبر ربط بنجاح للتغلب على القيود المرتبطة تغيير طبيعة شطف من الراتنج بكتيريا-Tactin. ساعد هذا النهج تحقيق الخير البروتين المستهدف إعادةcovery دون إدخال تلوث العينة. يمكن بالتالي الطريقة المقترحة أن تستخدم لتحديد الشركاء ملزمة محددة من البروتينات الطعم المزدوج بكتيريا الموسومة بواسطة مطياف الكتلة. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة يمكن تطبيقها على عزل وتوصيف المجمعات البروتين النووي، بما في ذلك عبر ربط عكسية مع الفورمالديهايد، وكذلك بروتينات غشاء solubilized مع المنظفات. أخيرا، عبر ربط الكيميائية لا يغير كثيرا من الخصائص الفيزيائية للبكتيريا-Tactin الراتنج، مما يجعل من الراتنج عبر ربط يحتمل أن تكون مناسبة للتطبيقات عالية الإنتاجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
أعلن عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نحن نعترف بامتنان الدعم الفني من سيني Miettinen، مينا Pöllänen وترو Rautavesi. نشكر Helka Nurkkala لتوفير HEK 293 الخلايا معربا عن التوأم بكتيريا الموسومة GFP وبيكا Evijärvi لتوفير معدات تسجيل الصوت. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الأكاديمية من فنلندا، منح أرقام 138329، 134684 258978 و.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2 mg | Pierce/Thermo Scientific | 21585 | www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection. |
| Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension) | IBA | 2-1505 | www.iba-lifesciences.com |
| Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile | Costar (Corning) | 8163 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Dolphin-nose tubes | Costar (Corning) | 3213 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Avidin | IBA | 2-0204 | www.iba-lifesciences.com |
References
- Voss, S., Skerra, A. Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification. Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).
- Schmidt, T. G., Skerra, A. The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins. Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).
- Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells. Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).
- Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions. Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).
- Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. Detection of histone modifications in plant leaves. J. Vis. Exp. (55), (2011).
- Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope. Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).
- Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean. Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).
- Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).
- Hendrickson, W. A., et al. Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).
- Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability. J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).
- Singh, I., et al. Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering. J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).
- Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5 (9), (2010).
- Wang, W., Barger, S. W. Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase. BMC Biochem. 12, 63 (2011).
- Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).
- Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis. Proteome Sci. 9, 45 (2011).
