siRNA contrôle pour la ubiquitine et les régulateurs du système ubiquitine-comme des voies biologiques dans des cellules de mammifères en culture

Résumé

Ici, nous décrivons une méthode pour effectuer un siRNA ciblés écran "ubiquitome" pour identifier de nouveaux régulateurs de l'ubiquitine et ubiquitine de la réponse cellulaire médiée HIF1A à l'hypoxie. Ceci peut être adapté à n'importe quelle voie biologique où une lecture robuste de l'activité du rapporteur est disponible.

Résumé

Modification post-traductionnelle des protéines avec l'ubiquitine et ubiquitine (UBL) molécules est en train de devenir un réseau de signalisation cellulaire dynamique qui régule diverses voies biologiques, y compris la réponse à l'hypoxie, proteostasis, la réponse aux dommages de l'ADN et la transcription. Pour mieux comprendre comment UBL réglementer les filières pertinentes à la maladie humaine, nous avons compilé un siRNA humain "ubiquitome" bibliothèque composée de 1186 siARN piscines duplex ciblant tous connus et prévus des composants de voies du système UBL. Cette bibliothèque peut être projeté contre un éventail de lignées cellulaires exprimant journalistes de diverses voies biologiques pour déterminer quels composants UBL agissent comme régulateurs positifs ou négatifs de la voie en question. Ici, nous décrivons un protocole utilisant cette bibliothèque pour identifier ubiquitome-régulateurs de la réponse cellulaire médiée par HIF1A à l'hypoxie en utilisant un rapporteur de luciférase à base de transcription. Un stade de développement de l'essai initialest effectuée pour établir les paramètres de dépistage appropriés de la lignée cellulaire avant d'effectuer l'écran en trois étapes: dépistage / déconvolution primaire, secondaire et tertiaire. L'utilisation de bibliothèques ciblée sur génome entier de siRNA est de plus en plus populaire car il offre l'avantage de rendre compte uniquement sur les membres de la voie avec laquelle les enquêteurs sont plus intéressés. Malgré les limites inhérentes de dépistage siRNA, en particulier les faux positifs causés par siARN effets hors-cible, l'identification des véritables nouveaux régulateurs des voies en question l'emportent sur ces lacunes, qui peuvent être surmontées par l'exécution d'une série d'expériences de contrôle attentivement entreprises.

Introduction

Modification des protéines avec l'ubiquitine et ubiquitine (UBL) molécules représente un système biochimique expansive qui régule diverses voies biologiques et des réactions de stress. La fixation covalente d'UBL à leurs protéines cibles peut avoir divers effets de régulation de la stabilité, la localisation, la fonction ou interactome du substrat ^1. Les étapes enzymatiques sous-jacents UBL modification ont d'abord été établies pour l'ubiquitine, et maintenant servir de paradigme pour la modification avec la plupart des UBL, y compris SUMO, NEDD8, ISG15 et FAT10. Pour la modification de se produire, le groupe carboxylate de la diglycine UBL....

Protocole

1. Phase de démarrage de dosage

Remarque: avant de lancer l'écran de siRNA, un stade de développement de dosage est essentiel de définir des paramètres importants pour le dépistage de la lignée cellulaire rapporteur. Il est essentiel d'investir des efforts importants à ce stade que cette sous-tendra la réussite future de l'écran.

1. Pour caractériser l'hypoxie-réactivité de U20S-EDH lignée cellulaire rapporteur, grandir 2 x 75 ^cm2 de cellules U20S-EDH à 80-90% de confluence dans Dulbecco Modified Eagle (DMEM) supplémenté avec 10% de FBS.
2. Aspirer le support d'un flacon de cellules, laver deu....

Résultats

Avant le dépistage, l'hypoxie-réponse des cellules U20S-EDH est établi. Cellules U20S-EDH expriment une construction rapporteur constitué de la luciférase de luciole fusionné en aval de trois copies en tandem de l'élément de réponse à l'hypoxie, qui est lié par l'hétérodimère HIF1A/HIF1B lors de l'exposition à l'hypoxie (figure 1A). Les cellules sont placées dans un poste de travail de l'hypoxie pour une plage de temps pour établir laquelle l'exposition à l'hypoxie pr.......

Discussion

L'utilisation d'écrans de siRNA du génome dans les cellules de mammifères s'est avérée extrêmement utile dans l'identification de nouveaux régulateurs de voies biologiques distinctes. Ici, nous avons décrit l'utilisation d'un écran de siRNA ciblé ubiquitome pour identifier des régulateurs de la réponse cellulaire médiée par HIF1A à l'hypoxie. Écrans ciblés sont de plus en plus attrayant car ils sont généralement moins cher, plus rapide, plus facile à gérer et rapport uniquement sur ​​les comp.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Distributeur automatique de liquide	Fluid-X	XPP-721	http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html
Plaque de dosage à paroi blanche	Greiner Bio One	655083	http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/
Film de plaque transparent	Perkin Elmer	1450-461	http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461
Thermo	Scientific	On-Target Plus	http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/
Réactif de transfection	Invitrogen	Lipofectamine RNAimax	http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html
Sérum Réduit Medium	Invitrogen	Optimem	http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product
DMEM	Invitrogen	41965-039	http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039#
FBS	Invitrogen	16000-044	https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product#
Tryspin-EDTA	Invitrogen	25300-054	https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product#