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Immunology and Infection

L'utilisation des tableaux cibles fluorescentes pour l'évaluation des réponses des cellules T Published: June 19, 2014 doi: 10.3791/51627
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Immunology, John Curtin School of Medical Research, Australian National University

Summary

La capacité de surveiller les réponses des cellules T en détail in vivo est importante pour le développement de la compréhension de la réponse immunitaire. Nous décrivons ici l'utilisation de réseaux de cibles fluorescentes (ALE) dans un test in vivo de cellules T en évaluant> 250 paramètres simultanément par cytométrie de flux.

Abstract

La capacité de surveiller les réponses des lymphocytes T in vivo est importante pour le développement de la compréhension de la réponse immunitaire et les immunothérapies. Nous décrivons ici l'utilisation de la matrice cible fluorescente (ALE) de la technologie, qui utilise des colorants vitaux tels que l'ester carboxyfluoroscéine succinimidylique (CFSE), laser violet colorants excitables (CellTrace Violet: CTV) et laser rouge colorants excitables (prolifération cellulaire Dye eFluor 670: DPC ) à combinatoire lymphocytes de souris d'étiquettes dans> 250 discernables amas de cellules fluorescentes. amas de cellules au sein de ces ALE peuvent être puisées avec majeur d'histocompatibilité (CMH) des peptides de liaison de classe I et du CMH de classe II et ainsi agir comme cellules cibles pour CD8 + et les cellules T CD4 +, respectivement. Ces cellules ALE restent viables et entièrement fonctionnel, et peuvent donc être administrés à des souris pour permettre l'évaluation de CD8 + T meurtre à médiation cellulaire des cellules cibles de l'ALE et T CD4 + hel médité cellulairep B de FTA cellules cibles des cellules en temps réel in vivo par cytométrie de flux. Depuis> 250 cellules cibles peuvent être évaluées à la fois, la technique permet la surveillance des réponses des lymphocytes T contre plusieurs épitopes antigéniques à plusieurs concentrations, et dans de multiples répétitions. En tant que tel, la technique permet de mesurer les réponses des lymphocytes T à la fois quantitative (par exemple, l'ampleur cumulée de la réponse) et un (avidité fonctionnelle par exemple. Épitope et-réactivité croisée de la réponse) qualitative niveau. Ici, nous décrivons comment ces ALE sont construits et donnent un exemple de la manière dont ils peuvent être appliqués afin d'évaluer les réponses des cellules T induites par un vaccin contre le virus de la variole recombinant.

Introduction

Lymphocytes T jouent un rôle central dans la réponse immunitaire adaptative et sont souvent la cible de la manipulation dans l'immunothérapie. Cellules CD4 + T effecteurs répondent à un antigène étranger en sécrétant des cytokines qui régulent de nombreux aspects de l'immunité et peuvent aussi aider directement les cellules B à fabriquer des anticorps. Cellules T cytotoxiques CD8 + (CTL) peuvent également répondre à un antigène étranger en sécrétant des cytokines ainsi que de jouer un rôle central à tuer directement les cellules exprimant un antigène étranger. L'interaction fondamentale qui initie ces fonctions effectrices des cellules T implique l'interaction du récepteur de lymphocyte T (TCR) avec des peptides étrangers présentés sur les molécules du CMH à la surface des cellules. Cellules T CD4 + reconnaissent peptides présentés sur les molécules du CMH de classe II sur les cellules présentatrices de l'antigène et des cellules T CD8 + reconnaissent peptides présentés sur les molécules du CMH de classe I qui sont habituellement affichées sur les cellules microbiennes infectés.

Pourafin d'évaluer le rôle des cellules T jouent dans une réponse immunitaire, il est indispensable que leurs fonctions effectrices sont mesurées par des techniques fiables et sensibles. Des méthodes communes pour l'évaluation de la réponse T cellulaire comprennent; CMH class-I/II/peptide tétramère réactivité; la production de cytokine par ELISPOT et coloration des cytokines intracellulaires; et tuant capacité de 51 Cr-tests de libération. Ces tests, cependant, sont généralement effectuées ex vivo avec une stimulation in vitro, ou donnent un aperçu limité dans la fonction des cellules T. Idéalement, lorsque l'on mesure les réponses des cellules T, il serait bénéfique pour les évaluer in situ, in vivo, car ils se produisent, sans aucune manipulation de cellules T de manière à éviter des changements dans les paramètres de fonctionnement qui peuvent se produire par la stimulation in vitro. Parmi les plus couramment utilisés in vivo de cellules T des tests fonctionnels sont basées sur la mesure de meurtre CTL médiée par les cellules cibles marquées avec des peptides du CMH de classe I-contraignantes, qui sont énumérés in vivovia leur détection par marquage fluorescent avec des colorants vitaux tels que CFSE. Bien que ces types d'essais peuvent surveiller meurtre CTL médiation de cibles quand ils se produisent in vivo, ils ont déjà eu une capacité relativement limitée pour évaluer assassinat de cibles multiples présentant différentes concentrations et différents types d'épitopes peptidiques, qui est nécessaire pour permettre paramètres qualitatifs tels avidité fonctionnelle et comme variante de l'épitope de réactivité croisée à évaluer. Ces essais ne fournissent pas d'informations sur les réponses à médiation cellulaire T CD4 +.

Pour surmonter bon nombre des difficultés avec les méthodes actuelles utilisées pour évaluer les réponses des lymphocytes T, nous avons récemment mis au point un test multiplex sur la base de tableaux fluorescentes cibles (ALE), qui permet le suivi des réponses des lymphocytes T contre> 250 cellules cibles simultanément dans un animal par la cytométrie de flux 1, 2. ALE sont constitués de lymphocytes marqués par sevconcentrations et combinaisons sieurs de colorants vitaux comme CFSE, CTV et DPC permettant> 250 groupes de cellules de fluorescence unique à être générés. Étant donné que ces cellules restent viables et totalement fonctionnel, elles peuvent être injectées dans des animaux pour permettre la surveillance de leur interaction avec les cellules in vivo 3 T effectrices. Par exemple, les agrégats de cellules ALE peuvent être puisées avec des peptides de classe I du CMH de liaison pour permettre une évaluation de la mise à mort médiée par des CTL spécifiques de l'antigène des cellules cibles 1. En outre, les agrégats de cellules d'ALE peut également être puisées avec des peptides du CMH de classe II se liant, ce qui permet l'évaluation de spécifique cellulaire de l'antigène T auxiliaire (T H) de l'activité par l'évaluation de l'activation (par évaluation des marqueurs d'activation tels que CD69, CD44 et / ou CD62L) des cellules B dans l'ALE portant peptide apparenté 2. Depuis plus de 250 cibles peuvent être détectés simultanément, il est possible de mesurer de CTL et T H réponses contre de nombreux amas de cellules cibles puisées avec npeptides ombreux à différentes concentrations et l'inclusion de nombreux répétitions. Le test FTA fournit donc un niveau de T effecteur cellulaire évaluation de la réponse in vivo sans précédent.

Ici, nous décrivons en détail la construction d'un ALE et montrons comment ils peuvent être appliqués à l'évaluation des réponses des lymphocytes T in vivo. Le mode opératoire décrit la construction d'un FTA composé de 252 groupes de cellules discernables par l'utilisation de trois colorants vitaux, composés de six répétitions de 42 groupes de cellules puisées avec des peptides de liaison II-CMH de classe I et. L'étiquetage des 42 groupes de cellules se produit dans 10 ml conique à fond des tubes et il est utile de prévoir ceux-ci dans un porte-tube, comme décrit dans le Tableau 1. Cette méthode peut être ajustée pour un plus petit nombre de grappes discernables au besoin, en réduisant la quantité d'étiquetage de chaque colorant a effectué 1.

Nous soulignons l'utilité de l'analyse en montrant comment il peut mesurer responsabes générés par la vaccination poxvirus recombinant contre plusieurs épitopes dans une petite cohorte de souris. Ceci montre comment le dosage ALE peut être utilisée pour mesurer les réponses cumulatives et avidité fonctionnelle par le biais, respectivement, l'utilisation de l'aire sous la courbe (AUC) et les évaluations mesure de la concentration de peptide efficace nécessaire pour générer des réponses maximales moitié (CE 50).

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Protocol

Remarque: Les souris utilisées en vertu du présent protocole ont été traitées conformément aux directives du Comité d'éthique expérimentation animale Australian National University et les souris ont été euthanasiés par dislocation cervicale.

1. Dye et Peptide Préparation

  1. préparation de colorant
    Remarque: Les colorants sont pré-dilués à différentes concentrations pour permettre l'étiquetage des cellules à des intensités de fluorescence discrets. CFSE est utilisé à sept concentrations effectués par des dilutions en série de 3,5 fois, et CTV et CPD sont utilisés à six concentrations différentes faites par des dilutions en série 3,7 fois (voir les tableaux 2-4). Les actions des concentrations de colorants énumérés dans les tableaux 2-4 seront utilisés pour marquer les cellules cibles à des concentrations de colorant finales figurant dans les tableaux 2-4. Colorants réagissent lors de l'exposition à la solution aqueuse. Il est donc important que les flacons soient équilibrés à température ambiante avant de l'ouvrir pour minimiser l'exposition des colorants à condensation.
    1. CFSE
      Remarque: CFSE est acheté sous forme d'ester diacétate de carboxyfluorescéine succinimidylique (CFDA, SE; MW 557,47), généralement à 25 mg / flacon.
      1. Reprendre 25 mg de CFSE dans 4,48 ml de DMSO pour obtenir une solution mère à 10 mM.
      2. Série diluer CFSE: Ajouter 35 ul de 10 mM CFSE actions dans 87,5 ul de DMSO et répéter ce avec une solution d'achat d'actions dilué pour donner à chaque concentration de colorant dans le tableau 3.
    2. CTV
      Remarque: CTV est généralement acheté en paquets de 9 flacons, dont chacun peut être reconstitué avec 10 pl de DMSO pour produire une solution à 10 mM du colorant.
      1. Reconstituer et mettre en commun tous les 9 flacons de CTV avec 90 ul de DMSO pour donner une solution à 10 mM.
      2. Série diluer CTV: Ajouter 11 ul de 10 mM CTV actions dans 29,7 ul de DMSO et répéter ce avec une solution d'achat d'actions dilué pour donner à chaque concentration de colorant dans le tableau 2.
    3. DPC
      Remarque: CPD (MW 792,6) est typiquement acheté que 0,5 mg / flacon.
      1. Remettre en suspension 0,5 mg de CPD dans 63 ml de DMSO pour obtenir une solution à 10 mM.
      2. Série diluer CPD: Ajouter 11 ul de 10 mM CPD actions dans 29,7 ul de DMSO et répéter ce avec une solution d'achat d'actions dilué pour donner à chaque concentration de colorant dans le tableau 4.
        Remarque: les stocks de teinture peuvent être conservés à -20 ° C pendant plusieurs mois et peuvent être décongelés et recongelés plusieurs fois sans perte significative de la fonction.
  2. préparation d'un peptide
    Remarque: Les peptides du CMH de classe I de liaison sont généralement utilisés pour pulser des cellules cibles à 6 concentrations différentes réalisés en utilisant 10 dilutions d'un facteur à partir d'une concentration de départ de 1 pM (tableau 5). CMH de classe II-peptides de liaison sont généralement utilisés pour pulser des cellules cibles à 6 concentrations différentes réalisés en utilisant trois dilutions à partir d'une concentration de départ de 400 pM (tableau 5). Chaque peptide est effectué à une concentration finale de 2 x dans du PBS telle that chaque concentration de peptide a un volume minimum de 250 ul. stocks de peptides peuvent être préparés avant la construction FTA et stockés à -20 ° C sans perte significative de la fonction.
    1. Peptides préparation actions CMH de classe I contraignants
    2. Préparer la plus forte concentration de chaque épitope peptidique 2 solutions uM d'actions (2x 1 uM)
    3. Diluer en série peptides de classe-I-liaison du CMH: ajouter 44,4 ul de 2 uM peptide solution stock dans 400 pi de PBS. Répétez cette opération avec la solution mère diluée pour donner à chaque concentration de peptide dans le tableau 5.
    4. Peptides préparation actions CMH de classe II contraignants
    5. Préparer la plus forte concentration de chaque épitope peptidique à 800 um solutions mères (2x 400 uM).
    6. Diluer en série du CMH de classe II peptides de liaison: ajouter 150 ul de solution de peptide 800 uM dans 300 pi de PBS. Répétez cette opération avec la solution mère diluée pour donner à chaque concentration de peptide dans le tableau 5

2. Préparation ALE

Remarque: la procédure ci-dessous décrit la construction d'un FTA composé de cellules puisées avec 7 épitopes peptidiques différents à six concentrations différentes (c.-à-42 clusters cellulaires. Répétées 6 fois) pour générer des amas de cellules 252 discernables. Dans chaque répétition, un amas de cellules non marquées avec une épitope (Nil), est inclus en tant que témoin. Il est utile pour les ALE pour CD45 ont une différence de allotype à partir d'animaux hôtes pour permettre leur discrimination de cellules receveuses par marquage de l'anticorps au moment de l'analyse. Sinon ALE peut être marqué avec d'autres colorants tels que PKH-26 à cet effet (décrit à l'étape 2.6). En règle générale, la procédure de préparation ALE est réalisée de bout en bout au cours d'une séance.

  1. Étiquette 42, 10 ml à fond conique des tubes en plastique de 1 à 42 (comme dans le tableau 1, par exemple).
  2. Préparation de cellules
    1. Isoler la rate et / ou lymphnodes de souris. Préparer seule suspension de cellules provenant de tissus de brassage à travers un tamis de 70 um à pores avec un piston de seringue de 5 ml et compter les cellules en utilisant un hématimètre.
    2. Reprendre lymphocytes jusqu'à 200 x 10 6 cellules / ml dans 11,5 ml de Rochester Park Memorial Institute 1640 (RPMI, ou équivalent) contenant 5% de sérum de veau foetal (SVF). Remarque: il est important d'utiliser un tampon à haute teneur en amine à minimiser la toxicité pour les cellules de colorant 3.
  3. Étiquetage CTV
    Note: Les cellules sont d'abord marquées avec 6 concentrations de CTV.
    1. Remettre en suspension les cellules à fond en renversant le tube plusieurs fois. Ajouter 1,9 ml de suspension cellulaire à 6 des tubes de 10 ml étiquetés 37-42, en prenant soin de ne pas mouiller la moitié supérieure des tubes.
    2. Pour marquer les cellules avec CTV, retirez le bouchon du tube et jeter le tube horizontalement.
    3. Ajouter 83 pi de PBS à la partie non mouillée au sommet du tube, et à cette ajouter 17 ul d'actions CTV (voir Table 2 pour lesquels la solution mère est affectée à ce tube). Remarque: un tube non mouillée est important pour empêcher un mouvement de suspension de cellules et mélange prématuré de la solution de cellules avec la solution de colorant.
    4. Boucher le tube et mélanger la suspension de cellules avec le colorant rapidement et complètement par vortex.
    5. Répétez les étapes 2.3.2-2.3.4 pour les solutions de stockage de CTV dans les tubes désignés décrits dans le tableau 2.
    6. Incuber les cellules pendant au moins 5 min à température ambiante (20 ° C).
  4. Étiquetage CFSE
    1. Après marquage CTV, ajouter 5 ml de milieu RPMI contenant 5% de FCS dans chaque tube et remettre en suspension les cellules à fond au vortex.
      1. De tube 37 de transfert de 1 ml de suspension cellulaire aux tubes 31, 25, 19, 13, 7 et 1.
      2. De tube 38 de transfert de 1 ml de suspension cellulaire aux tubes 32, 26, 20, 14, 8 et 2.
      3. De tube 39 de transfert de 1 ml de suspension cellulaire aux tubes 33, 27, 21, 15, 9 et 3.
      4. De 40 tubes de transfert de 1 ml de cellulessuspension à tubes 34, 28, 22, 16, 10, et 4.
      5. De tube 41 de transfert de 1 ml de suspension cellulaire aux tubes 35, 29, 23, 17, 11, et 5.
      6. De tube 42 transfert 1 ml de suspension de cellules dans des tubes de 36, 30, 24, 18, 12, et 6
        Remarque: Prenez soin de ne pas mouiller la moitié supérieure des tubes au cours des étapes 2.4.1.1-2.4.1.6.
    2. Pour marquer les cellules avec CFSE, retirez le bouchon du tube et jeter le tube horizontalement.
    3. Ajouter 103 ml de PBS à la partie non mouillée au sommet du tube, et à ce module 7 ml de stock CFSE (voir le tableau 3 pour lesquels la solution mère est affectée à ce tube).
    4. Boucher le tube et mélanger la suspension de cellules avec le colorant rapidement et complètement par vortex.
    5. Avez étapes 2.4.2-2.4.4 pour les solutions de stockage de CFSE dans les tubes désignés décrits dans le Tableau 3.
    6. Incuber les cellules pendant au moins 5 min à température ambiante (20 ° C).
    7. Laver les cellules: Diluer la suspension cellulaire avec 9 ml de 20 ° CRPMI contenant 5% de FCS, les sédiments par centrifugation à 300 xg pendant 10 min à 20 ° C et enlever les surnageants par aspiration avec une pipette de transfert.
  5. Peptide pulsation et le lavage des cellules
    Remarque: Après que les cellules ont été marquées avec CTV et CFSE, ils sont puisées avec des peptides de liaison (préparé en 1.2) du CMH de classe I et / ou du CMH de classe II. Un des populations de cellules doivent également pas être puisées avec le peptide (par exemple. Nil dans le tableau 1) et utilisé comme contrôle négatif pour le calcul des réponses des lymphocytes T.
    1. Peptide pulsation
      1. Resuspendre les cellules dans un volume total de 250 pi de milieu RPMI contenant 5% de FCS. Remarque: En général 50 pi de suspension cellulaire reste après aspiration du surnageant à la fin de l'étape 2.4.7, donc ajouter 200 ul de milieu à la cellule pastille.
      2. Ajouter 250 ul de stocks de pré peptidiques préparés (comme dans le tableau 5) à tubes désignée de manière appropriée (comme dans le tableau 1) et être sure pour inclure un tube de commande de PBS ajouté seul sans peptide comme un contrôle Néant.
      3. Mélanger des suspensions de cellules avec un vortex. Remarque: Il est essentiel que chaque épitope peptidique et chaque concentration de peptide est affecté à un seul tube et ce de noter clairement sur ​​la base de la fluorescence attendue des cellules dans ce tube, depuis la signature de fluorescence de cette grappe définira ce peptide (comme dans le tableau 1 par exemple).
      4. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 1 heure.
    2. Cellule à laver
      1. Ajouter 5 ml de la glace froide (4 ° C) du milieu RPMI contenant 5% de FCS à la suspension de cellules et remettre les cellules en inversant le tube. Sous-tendait soigneusement la suspension de cellules avec 3 ml de glace froide (4 ° C) de SVF.
      2. Sédimenter les cellules par centrifugation à 300 xg pendant 10 min à 4 ° C. Utiliser l'accélération et le freinage lent pour assurer l'interface de FCS et de la solution de suspension de cellules est maintenue.
      3. Aspirer soigneusement le RPMI puisles FCS avec une pipette de transfert, en laissant les culots cellulaires lavés non perturbé. Remarque: L'utilisation d'une sous-couche de FCS pour laver les cellules permet d'assurer la solution de peptide est éliminé autant de cellules que possible et en limitant ainsi l'exposition de populations de cellules à de multiples peptides libres lorsque les cellules sont mises en commun.
      4. Laver les cellules encore: Remettre en suspension les culots cellulaires dans 10 ml de 4 ° C du milieu RPMI contenant 5% de FCS. Sédimenter les cellules par centrifugation à 300 xg pendant 10 min à 4 ° C. Décanter les surnageants.
      5. Piscine toutes les populations de cellules ensemble dans un seul tube avec une pipette en utilisant 6 ml de 4 ° C RPMI contenant 5% de FCS. Sédiments cellules réunies par centrifugation à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant avec une pipette de transfert.
  6. DPC étiquetage portable
    Remarque: A ce stade, six répétitions intra dosage peuvent être générés par les cellules puisées étiquetage peptidiques avec 6 concentrations différentes de DPC.
    1. Ajouter 11,4 ml de 20 ° CRPMI contenant 5% de FCS pour le culot cellulaire et remettre en suspension soigneusement mis en commun à l'aide d'une pipette.
    2. Ajouter 1,9 ml de suspension cellulaire à 6, 10 ml tubes étiquetés AF, en prenant soin de ne pas mouiller la moitié supérieure des tubes.
    3. Pour marquer les cellules CPD, retirez le bouchon du tube et jeter le tube horizontalement.
    4. Ajouter 92 pi de PBS à la partie non mouillée au sommet du tube, et à cette ajouter le bouillon DPC (voir le tableau 4 pour la quantité de solution mère attribué à chaque tube).
    5. Boucher le tube et mélanger la suspension de cellules avec le colorant rapidement et complètement par vortex.
    6. . Ne pas 2.6.3-2.6.5 pour les solutions de stockage de CPD dans les tubes désignés décrits dans le Tableau 4 Note: Contrairement CFSE et CTV, la concentration de l'étiquetage de CPD n'est pas précisément une relation linéaire entre l'intensité de la fluorescence résultant de cellules marquées, et de sorte que la concentration de l'étiquetage utilisé pour obtenir des pics fluorescents équidistants de plusieurs populations marquées a étédéterminée empiriquement (voir tableau 4).
    7. Incuber les cellules pendant au moins 5 min à température ambiante (20 ° C).
    8. Laver les cellules deux fois: Remettre en suspension les cellules à 10 ml avec du milieu RPMI à 20 ° C contenant 5% de FCS. Sédimenter les cellules par centrifugation à 300 xg pendant 10 min à 20 ° C. Aspirer le surnageant avec une pipette de transfert. Répétez.
    9. Piscine toutes les cellules ensemble dans un seul tube en utilisant 8 ml 4 ° C RPMI contenant 5% de FCS avec une pipette. Sédiments cellules rassemblées par centrifugation à 300 xg pendant 10 min à 4 ° C et aspirer le surnageant avec une pipette de transfert.
  7. (Facultatif) PKH-26 étiquetage portable
    Remarque: Si ALE ne peut pas être réalisé avec des cellules exprimant une différence allotypique CD45 pour accueillir des souris, ils peuvent être marqués avec PKH-26 afin de permettre leur discrimination à partir des cellules receveuses.
    1. Ajouter 2,9 ml de PBS à 20 ° C au culot de cellules et remettre en suspension regroupée soigneusement avec une pipette.
    2. Ajouter la suspension cellulaire à un pas d'n mouillée tube de 10 ml, en prenant soin de ne pas mouiller la moitié supérieure du tube.
    3. Retirez le bouchon du tube et jeter le tube horizontalement.
    4. Ajouter 58 ul de diluant C (dans le kit de teinture PKH-26) à la partie non mouillée au sommet du tube, et à cette ajouter 42 ul de 1 mM PKH-26.
    5. Boucher le tube et mélanger la solution de cellules avec le colorant soigneusement au vortex.
    6. Incuber les cellules pendant au moins 10 min à température ambiante (20 ° C).
    7. Laver les cellules deux fois: Remettre en suspension les cellules à 10 ml avec du milieu RPMI à 20 ° C contenant 5% de FCS. Sédimenter les cellules par centrifugation à 300 xg pendant 10 min à 20 ° C. Aspirer le surnageant avec une pipette de transfert. Répétez.
  8. L'injection ALE en animaux d'accueil
    Remarque: Pour mesurer les réponses des cellules T in vivo, les ALE sont injectées dans les animaux qui ont une réponse immunitaire active et laissé en place jusqu'à 24 h. Il est essentiel que les ALE sont également injectés dans un animal naïf comme contrôle négatif.
    1. Compter et remettre les cellules à 2,5 x 10 8 cellules par ml dans du PBS. Injecter 200 ul de cellules par voie intraveineuse à des souris de l'hôte, y compris un animal naïf comme témoin.

3. Cytométrie en flux

  1. 18-24 heures après l'injection ALE récolte du sang ou de la rate (ou d'autres tissus d'intérêt) de souris hôtes.
  2. Préparer une suspension cellulaire unique à partir de tissus en écrasant à travers un tamis de 70 um pores avec une seringue de 5 ml plongeur.
  3. Remettre en suspension les cellules jusqu'à 65 x 10 6 cellules / ml dans du PBS contenant 0,1% de BSA.
  4. Distribuer des aliquotes de 100 pl de suspension cellulaire dans les puits d'une microplaque de titration pour le marquage de l'anticorps.
  5. cellules d'étiquetage avec fluorochrome anticorps marqués et les sondes de viabilité fluorescents à fluorescence spectrale compatible avec CFSE, CTV et DPC. Remarque: Les anticorps à des marqueurs de cellules B tels que le B220 et les marqueurs d'activation tels que CD69 est essentiel de mesurer l'activation des cellules B, si à l'aide du FTUn de mesurer les réponses des cellules T H 2. Inclure un anticorps à CD45.1 et / ou CD45.2 si les ALE et les souris hôtes aient une différence allotypique CD45.
  6. Ajouter 100 ul de 2x solution stock de colorants anticorps / de viabilité (dans du PBS contenant 0,1% de BSA) à 100 aliquotes de cellules, bien mélanger et incuber sur de la glace (4 ° C) pendant 30 min.
  7. Laver les cellules: les cellules de sédiments par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 4 ° C et enlever le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans 200 ul de PBS contenant 0,1% de BSA, les cellules du sédiment par centrifugation à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.
  8. Resuspendre les cellules dans un volume total de 400 ul de PBS contenant 0,1% de BSA, les cellules de filtrage à travers une maille de 70 pm et d'analyse par cytométrie de flux dans un cytomètre en flux capable de détecter les colorants fluorescents et des conjugués concernés. Gagner jusqu'à 3 x 10 6 événements de lymphocytes afin de résoudre chaque grappe de cellules ALE et gagner suffisamment de cellules pour statistiquementanalyse cal. Remarque: S'assurer que tous les contrôles typiques (tels que les contrôles colorées simples) pour cytométrie de flux sont employés. Typiquement, CFSE nécessite une excitation provenant d'une source laser bleu (typiquement à 488 nm) et de détection avec des filtres passe-bande centré sur 520 nm; CTV nécessite d'excitation provenant d'une source laser violet (typiquement à 405 nm) et de détection avec des filtres passe-bande centré sur 450 nm; et CPD nécessite une excitation à partir d'une source laser rouge (typiquement à 633 nm ou 640 nm) et de détection avec des filtres passe-bande centré sur 670 nm.

4. Analyse des données

  1. Analyser cytométrie de flux de données en utilisant un logiciel de cytométrie de flux standard (voir le résultat représentant un exemple du type de stratégie de déclenchement indépendants).
  2. Pour la destruction spécifique de%, calculer le nombre de cellules dans chaque groupe de cellules ALE pulsé avec des peptides de classe-I-liaison du CMH et les grappes de libre-échange qui n'ont pas été puisées peptide («Néant») et en utilisant la formule suivante pour calculer% Destruction spécifique.
    % Destruction spécifique Formule
    Note: Dans la formule ci-dessus «apprêté» fait référence à des cibles d'animaux qui sont considérés comme ayant une réponse immunitaire contre les peptides cibles, "naïf" désigne des cibles provenant d'animaux naïfs, «peptide» se réfère à des cibles puisées avec des peptides et des "nil" se réfère à des cibles non puisées avec des peptides.
  3. Pour l'activation des cellules B en tant que mesure de l'activité de T H, calculer la moyenne géométrique intensité de fluorescence (GMFI) de CD69 anticorps par fluorescence sur des cellules FTA B puisées avec des peptides du CMH de classe II se liant à des animaux "prime" et à partir de cette soustraire la GMFI d' expression de CD69 sur les cellules B ALE correspondants chez les animaux «naïves» pour donner une mesure de l'activité T H.
  4. D'après les statistiques générées dans les étapes 4.2 et 4.3, l'utilisationtableur mathématique comme GraphPad Prism pour calculer d'autres paramètres quantitatifs et qualitatifs tels que la surface sous la courbe et CE 50 (une description approfondie de la façon dont ces calculs sont effectués pour l'ASC peut être trouvé à
    http://graphpad.com/guides/prism/6/statistics/index.htm?stat_area_under_the_curve.htm, et pour EC50: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/curve-fitting/index. htm? reg_the_ec50.htm).

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Representative Results

A titre d'exemple de l'utilisation du dosage FTA, une souris BALB / c a été immunisée avec un virus recombinant de la vaccine (VV) exprimant des épitopes du VIH-I (VV-VIH) et les réponses aux épitopes du VIH-I CTL, Gag, mut Gag, Env et Pol, la VV CTL épitopes F2L et F2L mut, et l'épitope du VIH-I T H, Gag Th (comme décrit en 2) ont été évalués à l'aide d'un paramètre 252 ALE essai (figure 1B). variantes d'épitopes de Gag (mut Gag) et F2L (F2L mut) ne sont pas exprimés dans le vecteur VV-VIH et donc des réponses contre ces épitopes sont le reflet de l'épitope variante croisées réponses des lymphocytes T réactifs. Souris naïves ont également été injectés avec l'ALE comme contrôle négatif. L'ALE a été victime de cellules de souris hôte par PKH-26 étiquetage et les cellules B ALE discriminé par B220 coloration des anticorps par cytométrie de flux (Figures 1A et 1B). Chacune des 6 répétitions intra animales a été fermée sur la base de DPC fluorescence (figure 1C (figure 1D). % Destruction spécifique de chaque répétition a été évaluée en comparant ALE groupe mort cellulaire chez les animaux sensibilisés par rapport aux grappes FTA chez les animaux naïfs (figure 1D) correspondant. activité de T H a été évaluée en comparant ALE cellules B CD69 dans la régulation positive des animaux sensibilisés par rapport aux ALE B amas de cellules chez les animaux naïfs (figure 1E) correspondant.

A partir de cette analyse, l'infection par le VIH-VV généré des réponses CTL puissantes contre l'épitope immunodominant de VV F2L, avec 100% des cellules cibles puisées avec un ALE 0,001 mM ou plus de l'épitope étant retiré de la rate (Figure 2A). Il y avait aussi une forte réponse généré contre la variante de F2L, F2L mut, avec 100% de cellules cibles ALE puisées avec 0,01 mM ou plus de l'épitope être retiré de la rate. DepuisF2L mut n'est pas présente dans le virus infectant, cette réponse indique un variant d'épitope réponse à réactivité croisée. Il y avait aussi une réponse relativement modéré généré contre des cibles exprimant l'épitope Gag du VIH et une légère réponse réactive croisée contre la variante de cet épitope, Gag du VIH mut. Il semble y avoir des réponses négligeables générés aux épitopes du VIH Pol et Env du VIH CTL.

En plus des réponses de CTL, par exemple le dosage FTA montré également mesuré les réponses des T H en évaluant l'activation de FTA B cellule exprimant l'épitope de classe II du CMH de liaison du VIH Gag du VIH Th (Figure 2B). Ceci a montré l'activation des lymphocytes B spécifiques de l'antigène a eu lieu dans des animaux sensibilisés suggérant génération du VIH Gag effecteurs cellulaires spécifiques Th-T H.

Ces mesures de la réponse des cellules T magnitude peuvent être résumées par les valeurs de l'aire sous la courbe (AUC) pour générer chacun des épitopes (figure 2C) que meaSures l'ampleur cumulée de la réponse.

En plus de la grandeur des réponses à réactivité croisée et des variantes spécifiques de l'épitope d'antigène, le dosage ALE permet des mesures d'avidité fonctionnelle à apporter. Par exemple, les concentrations de peptides efficaces utilisés à impulsion cellules cibles ALE nécessaires pour donner des réponses maximales demi (CE 50), est indiqué pour les effecteurs de CTL (figure 2D). Cela montre l'avidité fonctionnelle à la épitopes mut F2L, Gag du VIH et Gag du VIH mut, étaient environ 10, 100 et 4000 fois plus faibles, respectivement, que les réponses générées au F2L épitope VV dominante.

Tableau 1
Tableau 1. Présentation d'une mise en page 252 paramètre ALE. Typique d'une réplique d'un 252 ALE composée de 42 échantillons / tubes puisées avec 7 épitopes peptidiques différents à 6 différenciationconcentrations de t et y compris un échantillon non pulsé (Nil). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Nombre de métro Volume (ul) Dye actions (mM CTV) Concentration finale (uM)
37 0 0 0
38 17 0,053 0.451
39 17 0,197 1,48
40 17 0,73 6.21
41 17 2.7 23
42 17 10 85

Tableau 2. Actions de CTV utilisé pour marquer les cellules. Volume des sociétés cotéesCTV actions utilisé pour marquer les cellules dans 2 ml pour obtenir la concentration finale étiquetage de colorant.

Nombre de métro Volume (ul) Dye actions (mM CFSE) Concentration finale (uM)
37 - 42 0 0 0
31 - 36 7 0,022 0,139
25 - 30 7 0,078 0,492
19 - 24 7 0,23 1,45
13-18 7 0,82 5.17
7-12 7 2.9 18.3
1 - 6 7 10 63,1

Tableau 3. Actions CFSE utilisé pour marquer les cellules. Volume des sociétés cotées CFSE nous stocked pour marquer les cellules dans 1,11 ml pour donner la concentration finale de colorant étiquetage.

Nombre de métro Volume (ul) Dye actions (mM DPC) Concentration finale (uM)
A 0 0 0
B 4 0,053 0,106
C 6.3 0,197 0,62
Ré 7.5 0,73 2.74
E 7.3 2.7 9,86
Fa 7.7 10 38,5

Stocks de DPC Tableau 4. Utilisé pour marquer les cellules. Volume des sociétés cotées CPD roulant utilisé pour marquer les cellules dans 2 ml de donner la Labelin finaleg concentration de colorant.

concentration de peptide (pM)
Peptides du CMH de classe I contraignant 0 0.00002 0,0002 0,002 0,012 0,2 2
CMH de classe II peptides de liaison 0 3.29 9,88 29,6 88,9 266 800

Tableau 5. II-peptide de liaison d'concentrations du CMH de classe I et II. Concentrations d'actions typiques 1 d'épitopes peptidiques utilisés pour construire un ALE 1. Ces concentrations sont 2 fois les concentrations finales utilisées pour pulser des cellules cibles.

Figure 1 Figure 1. Écoulement typique analyse par cytométrie d'ALE. Splénocytes provenant de souris BALB / c ont été utilisés pour construire un paramètre ALE 252 comme décrit dans le texte. Grappes de libre-échange ont été puisées avec 6 concentrations (comme indiqué dans le tableau 5) de 7 épitopes viraux différents, y compris les épitopes CMH de classe I contraignants, F2L (SPYAAGYDL, un L d restreinte virus de la vaccine (VV) de l'épitope); F2L mut (SP G AAGYDL, une variante de F2L), Gag (AMQMLKETI, un K d-restreint Gag du VIH épitope 4), mut Gag (AMQMLK D TI, une variante du VIH Gag 5), Pol (VGPTPVNII, un D d épitope restreint pol du VIH 6), Env (RGPGRAFVTI, un D d restreint VIH épitope env 7); et le CMH de classe II-peptide de liaison Gag T H (PVGEIYKRWIILGLN, un d-restreint Gag du VIH épitope 4 H-2). ALE ont été injectés iv. dans une souris BALB / c qui avaient été infectées par voie intranasale (in.) 6 jours plus tôt avec recombinant VV exprimant des épitopes du VIH (VV-VIH, animaux amorcée). L'ALE a également été injecté à des souris naïves comme témoin. Après 18 heures in vivo, les cellules ALE présents dans les suspensions de splénocytes de souris hôtes ont été analysés par cytométrie en flux. A) stratégie de déclenchement progressif typique pour identifier les cellules ALE montrant portes pour les lymphocytes, les maillots et PKH-26 + cellules ALE (il est également utile de résoudre les cellules vivantes en utilisant un colorant de viabilité comme Hoechst 33258, non représenté). B) parcelle 3D montrant toutes les grappes de libre-échange de la souris hôte naïf. C) parcelles de l'histogramme montrant ALE CPD fluorescence marquant chacun de l'animal intra 6 répétitions. D) parcelles 2D montrant un de la cellule 6 intra-animaux ALE B répétitions présentant les différents types et les concentrations des épitopes de l'animal naïf et apprêtée. Cela montre l'absence de cellules ALE dans l'animal apprêté par rapport à l'animal naïf, révélant des «événements de la mort»par les CTL qui forment la base de l'ALE tuer essai 1. E) analyse de l'histogramme de l'ALE B expression cellulaire du CD69 marqueur d'activation des animaux sensibilisés par rapport à naïves animaux, qui forme les bases de l'assistant test FTA T 2. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. ALE permettent la mesure de l'ampleur et de l'avidité des réponses des lymphocytes T in vivo. A 252 paramètre FTA a été utilisé pour évaluer les réponses des lymphocytes T dans des souris infectées avec VV-VIH, comme décrit dans la figure 1. A)% de destruction spécifique a été calculée pour tous les épitopes CTL et les résultats de chacun des six replicates affichés (panneau de gauche) ainsi que des moyens et de l'erreur type de la moyenne (à droite) montre. B) réponse T H a été évaluée par la mesure de l'activation de la cellule ALE B présentant l'épitope Gag du VIH Th pour chacun des 6 répétitions intra animaux ( panneau de gauche) et des moyens et de l'erreur type de la moyenne (panneau de droite) calculée. C) d'ASC pour la destruction spécifique de% (a) et les réponses T auxiliaires (b) a été calculé comme une mesure de l'ampleur cumulée. D) CE 50 mesures ont été calculées pour% des données d'abattage spécifiques (a) en tant que mesure de l'avidité fonctionnelle. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

L'avantage de tests basés sur l'ALE est qu'elles permettent la discrimination de> 250 populations de cellules cibles viable et pleinement fonctionnel à partir d'un seul animal hôte par cytométrie de flux. Cela fournit un niveau de complexité vivo découler des essais in base cytométrie qui n'a pas été possible avant. Cela est mis en évidence dans les deux expériences sur les animaux indiqués ci-dessus, où les réponses à 7 épitopes viraux distincts à 6 concentrations pourraient être suivis dans les répétitions de 6 simultanément dans un seul animal permettant à des paramètres tels que la CUA et la CE 50 à être déterminés pour les réponses des cellules T in vivo .

En plus de mesurer les réponses des lymphocytes T in vivo, les essais basés sur FTA peuvent être modifiés pour mesurer les réponses in vitro 1. Il s'agit essentiellement d'ajouter ALE aux cellules T en culture pour mesurer les réponses pendant plusieurs heures in vitro. Une des limites potentielles de tests basés vitro en utilisant des ALE est til tendance pour les cellules marquées au sein de l'ALE pour transférer le colorant de marquage de cellules environnantes 1, 3. Cela peut entraîner une diminution de la résolution d'amas cellulaires ALE que leur fluorescence devient moins nette entre chaque population. Ceci est plus apparent dans des essais in vitro par rapport à des essais in vivo parce que les cellules sont en proximité étroite pour les plus longues périodes de temps dans des essais in vitro. Cette perte dans la résolution des populations cellulaires d'ALE peut être réduite au minimum dans des essais in vitro, en réduisant le temps de culture d'ALE avec les cellules T effectrices et en utilisant les ALE qui ont un moins des populations de cellules cibles qui ont une plus grande quantité de «l'espace fluorescent» entre eux de manière que le transfert de colorant a moins d'impact.

Nous avons également noté une perte dans la résolution des populations de cellules ALE quand ALE ont été placés in vivo pour 48 h 1. Cela semble être le résultat de cellules cible B dans le prolife ALEEvaluation et réduisant de ce fait l'intensité de fluorescence de colorant. Ceci est probablement le résultat des lymphocytes B présentant un antigène apparenté à effectrices spécifiques de l'antigène des cellules T CD4 + qui ont abouti à la stimulation des lymphocytes B. Il est donc recommandé que l'essai est limitée à ~ 24 h ou moins lorsque les cibles cellulaires B sont surveillés.

La capacité à étiqueter multiples (> 96) des amas de cellules uniques par fluorescence a été rapporté précédemment en utilisant les cellules non viables fixes 8. La coloration de cellules vivantes, cependant, a été plus problématique de la disponibilité des colorants vitaux compatibles, et seules les cellules viables 8-12 grappes ont été réalisés précédemment 9. La capacité de générer> 250 cellules viables et fonctionnelles uniques marqués par fluorescence rapportés ici, se fonde sur les propriétés des colorants vitaux CFSE-like. Plusieurs de ces colorants, tels que CTV et DPC, ont récemment devenus disponibles. Ces colorants ont les caractéristiques d'être capables d'marquage des cellules avec une forte intensité de fluorescence, qui est longtemps vécu et de faible variance 3. Ces propriétés couplé avec le fait qu'il existe une relation linéaire (en particulier dans le cas de CFSE et CTV) entre la concentration du colorant utilisé pour le marquage et l'intensité de fluorescence des cellules marquées, signifie que les cellules peuvent être marquées avec plusieurs (jusqu'à à 7 présentés ici) intensités de chaque colorant qui peut être facilement distinguée par cytométrie de flux. En outre, étant donné que l'émission de fluorescence de CFSE, CPD et CTV ont un recouvrement spectral minimal, ils peuvent être utilisés en combinaison pour marquer des cellules, permettant ainsi jusqu'à> 250 signatures de cellules fluorescentes pour être détectées par cytométrie de flux. Il convient de noter que, afin de réaliser l'étiquetage des cellules avec ce nombre de signatures fluorescentes discernables, il est important que l'étiquetage cellulaire est effectuée rapidement 10, 11 (pour générer une faible variance de fluorescence) et dans un tampon approprié contenantamines libres 3 (pour tamponner la toxicité de colorant qui peut se produire autrement avec ces colorants à des concentrations élevées). Il est également essentiel que lors de l'acquisition d'ALE par cytométrie de flux que les fluctuations erronées de fluorescence d'événements sont surveillés (par exemple en mesurant CFSE, CTV et / ou CPD intensité de fluorescence au cours du temps). Ceci est important parce que ces fluctuations de fluorescence d'événements qui sont dues à la machine introduit des erreurs peuvent entraîner une mauvaise interprétation de positionnement de pôle de la cellule cible correcte qui à leur tour peuvent entraîner des erreurs dans les mesures finales de la fonction T effecteur cellulaire. Un tel cytomètre à écoulement erreurs introduites peut être limité en assurant des échantillons de haute qualité sont préparés (particulièrement attention aux cellules de filtrage à travers une maille de 70 pm afin de minimiser l'occlusion des lignes fluidiques dans le cytomètre en flux par de grands agrégats de cellules) et que le cytomètre de flux est maintenue à un niveau élevé.

Mesure des réponses des lymphocytes T in vivo,a été effectuée pendant de nombreuses années en utilisant des colorants vitaux tels que le CFSE pour surveiller la mort des cellules cibles in vivo 12. Généralement, ces essais, cependant, ont été seulement capable de surveiller jusqu'à 7-8 cellules cibles différentes à la fois 13 et ainsi de fournir une capacité limitée d'évaluer assassinat de cibles exprimant plusieurs concentrations de multiples épitopes qui sont normalement requises pour générer une évaluation détaillée des des paramètres tels que l'avidité fonctionnelle des réponses des lymphocytes T. A cet égard, des essais tétramère de dissociation peuvent être utilisés pour fournir une mesure de l'avidité des cellules T fraîchement isolées à partir de cellules T effectrices 14-16. Cette technique, cependant, mesure avidité de liaison CMH / TCR, et n'est donc pas un reflet complet de l'avidité fonctionnelle, qui peut également dépendre de changements dans la structure de la synapse immunologique et l'état de signalisation cellulaire T composants 17. Par conséquent, idéalement, une avidité fonctionnelle nécessite des expériences de dose-réponse à effectuer. Cea été accompli en utilisant des techniques in vitro précédemment, tels que le 51 Cr-release dosage, le dosage des cytokines intracellulaires de coloration 18, 19 ou l'essai ELISPOT 20, 21. Ces techniques, cependant, nécessitent souvent des cellules T effectrices à être stimulée in vitro, ce qui peut altérer l'avidité fonctionnelle globale de la population 22. Les essais ALE, par conséquent, offre une amélioration par rapport aux techniques existantes, la mesure de lymphocytes T CD4 + et CD8 + cellule doses-réponses in situ et en temps réel contre plusieurs épitopes simultanément, et ainsi fournir un ajout précieux à des techniques existantes pour mesurer les cellules T la fonction effectrice. Nous prévoyons que l'utilisation de la technologie ALE peut devenir utile dans les stratégies d'immunothérapie de dépistage visant à générer des réponses cellulaires de haute qualité T, tels que les vaccins dirigés contre le VIH-1 et de l'hépatite C.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions du projet # 1010395 (BQ et CP) et # 525431 (CR), et un programme de subventions # 455395 (CP) du Conseil de recherches en santé et médical national de l'Australie, un Centre australien pour l'hépatite et le VIH Virologie EOI 2012 subvention (CR et JJR) et une subvention de la Fondation Gordon Bouvier et Gretel (BQ et CR). Nous tenons à remercier Harpreet Vohra et Michael Devoy pour leur excellent entretien du laboratoire JCSMR FACS, le Fonds australien Cancer Research Foundation biomoléculaire ressources, JCSMR, ANU, pour la synthèse peptidique, et le Dr David Boyle, CSIRO animaux laboratoires de santé, Geelong, Australie pour fournir les mères VIH stocks de vaccins.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI Sigma R8758
Fetal calf serum Serana FCS-500
CTV Invitrogen C34557
CFDA, SE Invitrogen C1157
CPD eBioscience 65-0840-90
anti-B220 PerCp-Cy5.5 eBioscience 110730
anti-CD69 brilliant violet 605 Biolegend 104529
PKH-26 Sigma PKH26GL-1KT
Vortex Scientific Industries Inc
Centrifuge Eppendorf
Flow cytometer (Fortessa or equivalent with blue, red and violet laser source) BD Bioscience

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Quah, B. J. C., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo. J. Vis. Exp. (88), e51627, doi:10.3791/51627 (2014).

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