Method Article

L'utilisation des tableaux cibles fluorescentes pour l'évaluation des réponses des cellules T In vivo

DOI:

10.3791/51627

⸱

June 19th, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Immunology, John Curtin School of Medical Research, Australian National University

In This Article

Summary

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La capacité de surveiller les réponses des cellules T en détail in vivo est importante pour le développement de la compréhension de la réponse immunitaire. Nous décrivons ici l'utilisation de réseaux de cibles fluorescentes (ALE) dans un test in vivo de cellules T en évaluant> 250 paramètres simultanément par cytométrie de flux.

Abstract

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La capacité de surveiller les réponses des lymphocytes T in vivo est importante pour le développement de la compréhension de la réponse immunitaire et les immunothérapies. Nous décrivons ici l'utilisation de la matrice cible fluorescente (ALE) de la technologie, qui utilise des colorants vitaux tels que l'ester carboxyfluoroscéine succinimidylique (CFSE), laser violet colorants excitables (CellTrace Violet: CTV) et laser rouge colorants excitables (prolifération cellulaire Dye eFluor 670: DPC ) à combinatoire lymphocytes de souris d'étiquettes dans> 250 discernables amas de cellules fluorescentes. amas de cellules au sein de ces ALE peuvent être puisées avec majeur d'histocompatibilité (CMH) des peptides de liaison de classe I et du CMH de classe II et ainsi agir comme cellules cibles pour CD8 + et les cellules T CD4 +, respectivement. Ces cellules ALE restent viables et entièrement fonctionnel, et peuvent donc être administrés à des souris pour permettre l'évaluation de CD8 + T meurtre à médiation cellulaire des cellules cibles de l'ALE et T CD4 + hel médité cellulairep B de FTA cellules cibles des cellules en temps réel in vivo par cytométrie de flux. Depuis> 250 cellules cibles peuvent être évaluées à la fois, la technique permet la surveillance des réponses des lymphocytes T contre plusieurs épitopes antigéniques à plusieurs concentrations, et dans de multiples répétitions. En tant que tel, la technique permet de mesurer les réponses des lymphocytes T à la fois quantitative (par exemple, l'ampleur cumulée de la réponse) et un (avidité fonctionnelle par exemple. Épitope et-réactivité croisée de la réponse) qualitative niveau. Ici, nous décrivons comment ces ALE sont construits et donnent un exemple de la manière dont ils peuvent être appliqués afin d'évaluer les réponses des cellules T induites par un vaccin contre le virus de la variole recombinant.

Introduction

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Lymphocytes T jouent un rôle central dans la réponse immunitaire adaptative et sont souvent la cible de la manipulation dans l'immunothérapie. Cellules CD4 + T effecteurs répondent à un antigène étranger en sécrétant des cytokines qui régulent de nombreux aspects de l'immunité et peuvent aussi aider directement les cellules B à fabriquer des anticorps. Cellules T cytotoxiques CD8 + (CTL) peuvent également répondre à un antigène étranger en sécrétant des cytokines ainsi que de jouer un rôle central à tuer directement les cellules exprimant un antigène étranger. L'interaction fondamentale qui initie ces fonctions effectrices des cellul....

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Protocol

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Remarque: Les souris utilisées en vertu du présent protocole ont été traitées conformément aux directives du Comité d'éthique expérimentation animale Australian National University et les souris ont été euthanasiés par dislocation cervicale.

1. Dye et Peptide Préparation

  1. préparation de colorant
    Remarque: Les colorants sont pré-dilués à différentes concentrations pour permettre l'étiquetage des cellules à des intensités de fluorescence discrets. CFSE est utilisé à sept concentrations effectués par des dilutions en série de 3,5 fois, et CTV et CPD sont utilisés à six concentrations différentes faites par des dilutions en sér....

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Results

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A titre d'exemple de l'utilisation du dosage FTA, une souris BALB / c a été immunisée avec un virus recombinant de la vaccine (VV) exprimant des épitopes du VIH-I (VV-VIH) et les réponses aux épitopes du VIH-I CTL, Gag, mut Gag, Env et Pol, la VV CTL épitopes F2L et F2L mut, et l'épitope du VIH-I T H, Gag Th (comme décrit en 2) ont été évalués à l'aide d'un paramètre 252 ALE essai (figure 1B). variantes d'épitopes de Gag (mut Gag) et F2L (F2L mut) ne sont pas exprimés dans le vecte.......

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Discussion

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L'avantage de tests basés sur l'ALE est qu'elles permettent la discrimination de> 250 populations de cellules cibles viable et pleinement fonctionnel à partir d'un seul animal hôte par cytométrie de flux. Cela fournit un niveau de complexité vivo découler des essais in base cytométrie qui n'a pas été possible avant. Cela est mis en évidence dans les deux expériences sur les animaux indiqués ci-dessus, où les réponses à 7 épitopes viraux distincts à 6 concentrations pourraient êtr.......

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Disclosures

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Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgements

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Ce travail a été soutenu par des subventions du projet # 1010395 (BQ et CP) et # 525431 (CR), et un programme de subventions # 455395 (CP) du Conseil de recherches en santé et médical national de l'Australie, un Centre australien pour l'hépatite et le VIH Virologie EOI 2012 subvention (CR et JJR) et une subvention de la Fondation Gordon Bouvier et Gretel (BQ et CR). Nous tenons à remercier Harpreet Vohra et Michael Devoy pour leur excellent entretien du laboratoire JCSMR FACS, le Fonds australien Cancer Research Foundation biomoléculaire ressources, JCSMR, ANU, pour la synthèse peptidique, et le Dr David Boyle, CSIRO animaux laboratoires de santé, Geelong, Au....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
RPMISigmaR8758
Sérum de veau fœtalSeranaFCS-500
CTVInvitrogenC34557
CFDA, SEInvitrogenC1157
CPDeBioscience65-0840-90
anti-B220 PerCp-Cy5.5eBioscience110730
anti-CD69 violet brillant 605Biolegend104529
PKH-26SigmaPKH26GL-1KT
VortexScientific Industries Inc
CentrifugeuseEppendorf
Cytomètre en flux (Fortessa ou équivalent avec source laser bleue, rouge et violette)BD Bioscience

References

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  1. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo. Cytometry A. 81, 679-690 (2012).
  2. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R.

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Fluorescent Target ArrayT Cell ResponsesFlow CytometryVital Dye LabelingMHC Peptide PulsingCellTrace VioletCFSE StainingCPD Proliferation DyeIntra assay ReplicatesIn vivo Assessment

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