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Biology

बैक्टीरियल के लिए दो घटक नियामक प्रणाली जीन लक्ष्य निर्धारित करने के लिए डीएनए आत्मीयता शुद्ध चिप (डीएपी चिप) विधि

Published: July 21, 2014 doi: 10.3791/51715
Automatic Translation
1, 1, 1
1Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory

Summary

इस वीडियो लेख दो घटक प्रणाली प्रतिक्रिया नियामकों के लिए जीन लक्ष्य और बाध्यकारी साइटों का निर्धारण करने के लिए इन विट्रो माइक्रोएरे आधारित विधि का वर्णन करता है.

Abstract

ऐसी चिप चिप के रूप में विवो तरीकों में प्रतिलेखन कारकों के लिए वैश्विक जीन लक्ष्य निर्धारित किया अच्छी तरह से स्थापित तकनीक है. हालांकि, वे uncharacterized सक्रियण शर्तों के साथ बैक्टीरियल दो घटक नियामक प्रणाली की खोज में सीमित इस्तेमाल के हैं. अद्वितीय संकेतों की उपस्थिति में सक्रिय जब इस तरह की प्रणाली केवल प्रतिलेखन विनियमित. इन संकेतों को अक्सर अज्ञात होते हैं, इसलिए इस वीडियो लेख में वर्णित इन विट्रो माइक्रोएरे आधारित पद्धति जीन लक्ष्य और प्रतिक्रिया नियामकों के लिए बाध्यकारी साइटों का निर्धारण किया जा सकता है. यह डीएनए आत्मीयता शुद्ध चिप विधि एक अनुक्रम जीनोम के साथ किसी भी जीव में किसी भी शुद्ध नियामक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रोटोकॉल शुद्ध किया टैग प्रोटीन एक कस्टम टाइलिंग सरणी के लिए डीएनए और संकरण के फ्लोरोसेंट लेबलिंग द्वारा पीछा प्रोटीन वाली डीएनए, sheared जीनोमिक डीएनए के लिए बाध्य है और फिर आत्मीयता सफ़ाई करने के लिए अनुमति शामिल है. Specifi के लिए परख अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कदम पूर्ववर्तीसी नियामकों भी वर्णित हैं. सरणी डेटा विश्लेषण द्वारा उत्पन्न चोटियों तो प्रयोगात्मक पुष्टि कर रहे हैं जो बाध्यकारी साइट रूपांकनों, भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. आकृति भविष्यवाणियों आगे निकट से संबंधित प्रजातियों में orthologous प्रतिक्रिया नियामकों के जीन लक्ष्य निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम जीन लक्ष्य निर्धारित करने और साइट बेरी बंधन और इस प्रकार पर्यावरण जीवाणु Desulfovibrio vulgaris Hildenborough में एक sigma54 निर्भर प्रतिक्रिया नियामक DVU3023 के लिए समारोह की भविष्यवाणी के द्वारा इस पद्धति के प्रयोग को प्रदर्शित करता है.

Introduction

जीवित और फूलने के लिए बैक्टीरिया की क्षमता वे देखती है और अपने वातावरण में perturbations के लिए प्रतिक्रिया करने में सक्षम होते हैं कितनी अच्छी तरह पर निर्भर है, और यह बदले में उनके संकेत पारगमन प्रणाली पर निर्भर है. सिगनल सिस्टम एक जीवाणु encodes की संख्या अपने "माइक्रोबियल बुद्धि" बुलाया गया है और अपने पर्यावरण की परिवर्तनशीलता और कई संकेत समझ करने की क्षमता और ठीक धुन अपनी प्रतिक्रिया 1 दोनों का एक संकेत हो सकता है. दो घटक संकेत पारगमन प्रणाली (टीसीएस) बैक्टीरिया द्वारा इस्तेमाल किया सबसे अधिक प्रचलित सिगनल व्यवस्था कर रहे हैं, और वे बाहरी संकेत होश और एक प्रेरक प्रतिक्रिया नियामक (आरआर) 2 के लिए phosphorylation के माध्यम से पहुंचाता है कि एक हिस्टडीन kinase (एच) से मिलकर बनता है. आरआरएस एक उत्पादन डोमेन की विविधता और इस प्रकार विभिन्न प्रेरक मोड में हो सकता है, लेकिन सबसे आम प्रतिक्रिया डोमेन 1 बाध्यकारी एक डीएनए के माध्यम से transcriptional विनियमन है. लगा संकेतों और वीएएस की इसी कार्योंTCSs की टी बहुमत अनजान रहते हैं.

ऐसी चिप चिप के रूप में विवो तरीकों नियमित प्रतिलेखन 3 कारकों के जीनोमिक बाध्यकारी साइटों के निर्धारण के लिए उपयोग किया जाता है सक्रिय शर्तों या संकेतों में जाना जाता है, वे केवल बैक्टीरिया के दो घटक प्रणाली आरआरएस के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अक्सर एक टीसीएस को सक्रिय कि पर्यावरण cues उनके जीन लक्ष्य से निर्धारित करने के लिए कठिन हैं. इन विट्रो माइक्रोएरे यहाँ वर्णित आधारित परख प्रभावी ढंग से और तेजी से जीन लक्ष्य निर्धारित करने और TCSs के कार्यों की भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह परख आरआरएस phosphorylated और इस तरह एसिटाइल फॉस्फेट 4 की तरह छोटे अणु दाताओं का उपयोग इन विट्रो में सक्रिय किया जा सकता है कि इस तथ्य का लाभ लेता है.

इस विधि में डीएनए आत्मीयता शुद्ध चिप (चित्रा 1) के लिए डीएपी चिप का नाम है, ब्याज की आरआर जीन ई. में एक उनकी टैग के साथ क्लोन है कोलाई, और एक बाद में शुद्ध किया टैग प्रोटीन द्वि की अनुमति दी हैएन डी जीनोमिक डीएनए sheared लिए. प्रोटीन वाली डीएनए तो आत्मीयता शुद्धि से समृद्ध है, समृद्ध और इनपुट डीएनए परिलक्षित कर रहे हैं, fluorescently एक साथ जमा और कस्टम ब्याज के जीव (चित्रा 1) के लिए किया जाता है कि एक खपरैल का छत सरणी संकरित, लेबल. माइक्रोएरे प्रयोगों कलाकृतियों के अधीन हैं और इसलिए अतिरिक्त कदम परख अनुकूलन करने के लिए कार्यरत हैं. ऐसा ही एक कदम (चित्रा 2 में कार्यप्रवाह देखें) electrophoretic गतिशीलता पारी assays (EMSA) का उपयोग करते हुए अध्ययन के तहत आरआर के लिए एक लक्ष्य निर्धारित करने के लिए प्रयास करने के लिए है. फिर, जीनोमिक डीएनए और डीएपी कदम को बंधन निम्नलिखित, प्रोटीन ही सीमित है और इनपुट डीएनए इस प्रकार के इष्टतम बाध्यकारी शर्तों की पुष्टि, सकारात्मक लक्ष्य इनपुट अंश के सापेक्ष प्रोटीन बाध्य अंश में समृद्ध है यह देखने के लिए qPCR द्वारा जांच कर रहे हैं आरआर (चित्रा 2). सरणी संकरण के बाद, डेटा जीनोमिक loci का संकेत उच्च तीव्रता संकेत की चोटियों को खोजने के लिए विश्लेषण कर रहे हैं जहां प्रोटीन घंटेविज्ञापन के लिए बाध्य. कार्य प्राप्त जीन लक्ष्य पर आधारित आरआर के लिए भविष्यवाणी की जा सकती है. लक्ष्य जीनोमिक loci तो प्रयोगात्मक EMSAs (चित्रा 2) का उपयोग कर पुष्टि कर रहे हैं जो बाध्यकारी साइट रूपांकनों, भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. आरआर के लिए कार्यात्मक भविष्यवाणियों और जीन लक्ष्य तो बारीकी इसी तरह बाध्यकारी रूपांकनों के लिए उन जीनोम (चित्रा 2) स्कैनिंग द्वारा orthologous आरआरएस सांकेतिक शब्दों में बदलना है कि प्रजातियों से संबंधित के लिए बढ़ाया जा सकता है. डीएपी चिप विधि पहले जहां कोई नहीं था एक टीसीएस के लिए जानकारी का खजाना प्रदान कर सकते हैं. विधि भी प्रोटीन शुद्ध किया जा सकता है और डीएनए बाध्यकारी शर्तों निर्धारित किया जा सकता है अगर किसी भी transcriptional नियामक के लिए प्रयोग किया जाता है, और एक जीनोम अनुक्रम के साथ ब्याज की किसी भी जीव के लिए उपलब्ध हो सकते हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1. डीएनए आत्मीयता शुद्ध चिप (डीएपी-चिप) रणनीति 7. ब्याज के जीव से आरआर जीन एक ई. में एक carboxy टर्मिनल उनकी टैग के साथ क्लोन है कोली अभिव्यक्ति तनाव. शुद्ध किया उसका टैग प्रोटीन एसिटाइल फॉस्फेट के साथ phosphorylation से सक्रिय, और sheared जीनोमिक डीएनए के साथ मिलाया जाता है. बाकी नी NTA राल का उपयोग आत्मीयता शुद्धि के अधीन है, जबकि बाध्यकारी प्रतिक्रिया के एक विभाज्य, इनपुट डीएनए के रूप में सहेजा जाता है. इनपुट और आरआर वाली डीएनए प्रवर्धित पूरे जीनोम हैं, और क्रमशः Cy3 और Cy5, के साथ लेबल. लेबल डीएनए एक साथ जमा और फिर जीन लक्ष्य निर्धारित करने के लिए विश्लेषण किया जाता है जो एक खपरैल का छत सरणी, संकरित है. चित्रा संशोधित और क्रिएटिव 7 से उपयोग कर reprinted.

चित्रा 2
कार्यप्रवाह के चित्रा 2. सारांश. किसी भी शुद्ध किया टैग किया protei के लिएएन, EMSA का उपयोग कर एक लक्ष्य निर्धारित करने से शुरू करते हैं. (WGA) समृद्ध और इनपुट डीएनए बढ़ाना जीनोमिक डीएनए और फिर डीएनए आत्मीयता-शुद्ध (डीएपी) और पूरे जीनोम बाध्य करने के लिए प्रोटीन की अनुमति दें. एक जीन लक्ष्य जाना जाता है, में जाना लक्ष्य प्रोटीन बाध्य अंश में समृद्ध है कि यह सुनिश्चित करने के लिए qPCR का उपयोग करें. कोई लक्ष्य निर्धारित किया जा सकता है, डीएनए लेबलिंग और सरणी संकरण करने के लिए सीधे आगे बढ़ना. QPCR द्वारा संवर्धन देखा नहीं जा सकता है, तो बाध्यकारी प्रोटीन gDNA और विभिन्न प्रोटीन मात्रा का उपयोग डीएपी-WGA चरणों को दोहराएँ. चोटियों पाते हैं और जीनों को लक्ष्य करने के लिए उन्हें नक्शा करने के लिए सरणी विश्लेषण का प्रयोग करें. बाध्यकारी साइट रूपांकनों भविष्यवाणी करने के लिए लक्ष्य जीन के अपस्ट्रीम क्षेत्रों का प्रयोग करें. प्रयोगात्मक EMSAs का उपयोग रूपांकनों मान्य करें. अध्ययन के तहत आरआर के orthologs एन्कोडिंग संबंधित प्रजातियों के जीनोम को स्कैन करने के लिए आकृति का प्रयोग करें, और साथ ही उन प्रजातियों में लक्षित जीन का अनुमान है. प्राप्त जीन लक्ष्य के आधार पर, आरआर और उसके orthologs की शारीरिक समारोह की भविष्यवाणी की जा सकती है. चित्रा संशोधित और रचनात्मक सी का उपयोग पुनर्मुद्रितommons 7 से लाइसेंस.

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Protocol

नोट: नीचे प्रोटोकॉल जीवाणु Desulfovibrio vulgaris Hildenborough से आरआर DVU3023 के जीन लक्ष्य के निर्धारण के लिए सिलवाया है. यह ब्याज की किसी भी अन्य transcriptional नियामक के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

1. क्लोन और शुद्ध आरआर

  1. आरआर जीन, डी. से विशेष रूप से DVU3023, क्लोन vulgaris Hildenborough एक Escherichia कोलाई अभिव्यक्ति वेक्टर में जीन सी टर्मिनली उनकी टैग और अभिव्यक्ति एक T7 प्रमोटर के नियंत्रण में है कि इस तरह के.
    नोट: कई क्लोनिंग तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है और अनुसंधानकर्ता द्वारा निर्धारित किया जाता है. वैकल्पिक आत्मीयता टैग भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. अभिव्यक्ति ई. में निर्माण रूपांतरण कोली BL21 (DE3) अभिव्यक्ति तनाव.
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर BL21 अभिव्यक्ति तनाव का 1 एल बड़े हो जाओ मध्य लॉग चरण में, प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए 0.5 मिमी तक IPTG जोड़ने. 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर विकास जारी.
  4. 10 मील के लिए 5000 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं4 डिग्री सेल्सियस पर n Lysis बफर में Resuspend कोशिकाओं (20 मिमी सोडियम फास्फेट, 7.4 पीएच, 500 मिमी NaCl, 40 मिमी imidazole, 1 मिलीग्राम / एमएल lysozyme, 1x nuclease Benzonase). 4 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रांसीसी प्रेस का उपयोग lyse कोशिकाओं
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 15,000 XG पर अपकेंद्रित्र lysate 0.45 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर.
  6. धोने बफर के 10 एमएल (20 मिमी सोडियम फास्फेट, 7.4 पीएच, 500 मिमी NaCl, 40 मिमी imidazole) का उपयोग कर एक FPLC साधन पर एक 1 मिलीलीटर नी Sepharose स्तंभ धो लें.
  7. स्तंभ पर lysate लोड करें. धोने बफर के 20 मिलीलीटर के साथ स्तंभ धो लें.
  8. 0-100% क्षालन बफर की एक ढाल (20 मिमी सोडियम फास्फेट, 7.4 पीएच, 500 मिमी NaCl, 500 मिमी imidazole) का उपयोग Elute DVU3023.
  9. एक desalting स्तंभ पर eluted भिन्न लोड, और एक desalting बफर (20 मिमी सोडियम फास्फेट 7.4 पीएच, 100 मिमी NaCl) से धो लें.
  10. प्रोटीन ध्यान केंद्रित करने के लिए एक उच्च आणविक भार कटऑफ अपकेंद्रित्र फिल्टर में अपकेंद्रित्र प्रोटीन नमूना. -20 डिग्री सेल्सियस पर 50% और दुकान प्रोटीन को 0.1 मिमी और ग्लिसरॉल डीटीटी जोड़ें
    नोट: शोधन तरीकों के अध्ययन के तहत प्रत्येक प्रोटीन के लिए व्यक्तिगत रूप से अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी.

2. Electrophoretic गतिशीलता शिफ्ट परख (EMSA) का उपयोग करना आरआर के लिए जीन लक्ष्य का निर्धारण करें

  1. पीसीआर डी. का उपयोग कर, उम्मीदवार लक्ष्य जीन DVU3025 की 400 बीपी क्षेत्र अपस्ट्रीम बढ़ाना vulgaris Hildenborough टेम्पलेट के रूप में जीनोमिक डीएनए, और एक आगे unlabeled किताब और एक रिवर्स 5'बायोटिन लेबल प्राइमर.
    नोट: अक्सर आरआरएस अपने स्वयं के जीन / operon के अपस्ट्रीम क्षेत्रों बाँध, या वे proximally इनकोडिंग जीन को नियंत्रित कर सकते हैं: एक उम्मीदवार लक्ष्य जीन का चयन करने के टिप्स. आरआर अन्य प्रजातियों में orthologs है, तो पड़ोस में संरक्षित कर रहे हैं कि जीन के लिए देखो. वैकल्पिक तरीकों खुद को sigma54 पर निर्भर कर रहे हैं कि आरआरएस के लिए regulon भविष्यवाणियों (जैसे, RegPrecise 5), या भविष्यवाणी के sigma54 निर्भर प्रमोटरों 6 के आधार पर चुनने के उम्मीदवार जीन शामिल हैं.
  2. 400 बी बाहर कट, एक 1% agarose जेल पर पीसीआर उत्पाद चलापी आकार के उत्पाद, और एक जेल निकालना किट को साफ डीएनए का उपयोग कर शुद्ध.
  3. 10 मिमी Tris एचसीएल, 7.5 पीएच, 50 मिमी KCl, 5 मिमी 2 MgCl, 1 मिमी डीटीटी, 25% ग्लिसरॉल और 1 ग्राम / एमएल पाली dI.dC (गैर में biotinylated डीएनए सब्सट्रेट के 100 fmol साथ DVU3023 प्रोटीन (0.5 pmol) मिक्स 20 μl की कुल मात्रा में विशेष प्रतियोगी डीएनए). इसके अलावा एक नियंत्रण के रूप में किसी भी प्रोटीन के बिना एक प्रतिक्रिया की स्थापना की. 20 मिनट के लिए बेंच पर कमरे के तापमान पर प्रतिक्रियाओं सेते हैं.
  4. नोट: ये सूचीबद्ध और अन्य प्रतिक्रिया घटकों ब्याज की आरआर के आधार पर जोड़ा जा सकता है मानक स्थितियां हैं. सक्रियण वांछित है, प्रतिक्रिया (अक्सर आरआरएस सक्रियण के बिना इन विट्रो में डीएनए बाध्य होगा) को 50 मिमी एसिटाइल फॉस्फेट जोड़ें.
  5. 30 मिनट के लिए 100 वी पर 0.5x TBE बफर में एक मिल में बना हुआ छोटा 6% polyacrylamide-0.5x TBE जेल पूर्व चलाते हैं. छ पर बाध्यकारी प्रतिक्रियाओं और प्रतिक्रियाओं का भार 18 μl को 5x लोड हो रहा है बफर के 5 μl (नीला 0.1% bromophenol, 0.1% xylene cyanol, 1x TBE में 30% ग्लिसरॉल) जोड़ेंएल. 2 घंटे के लिए 100 वी पर चलाते हैं.
    नोट: जेल के बहुमत बफर से अछूता रहा है कि इस तरह के बफर चलाने के साथ वैद्युतकणसंचलन प्रणाली में बाहरी बफर कक्ष को भरने, प्रोटीन डीएनए परिसरों की विसंघटन को जन्म दे सकता है जो overheating, से बचने के लिए. वैकल्पिक रूप से, जेल 4 डिग्री सेल्सियस पर चलाया जा सकता है
  6. जेल के आकार के एक आरोप लगाया नायलॉन झिल्ली कट और कम से कम दस मिनट के लिए 0.5x TBE में लेना. कैसेट से जेल निकालें. जेल बंद किसी भी लकीरें कट और 0.5x TBE में भिगो दो मोटी फिल्टर कागजात के बीच जेल और झिल्ली सैंडविच, और एक अर्द्ध शुष्क सोख्ता तंत्र के अंदर डाल दिया और 30 मिनट के लिए 20 वी पर चलाते हैं.
  7. एक वाणिज्यिक पराबैंगनी प्रकाश crosslinker साधन अंदर झिल्ली प्लेस और 3 मिनट का समय निर्धारित किया है.
    नोट: झिल्ली अब अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले कई दिनों के लिए कमरे के तापमान पर शुष्क संग्रहित किया जा सकता है.
  8. एक streptavidin घोड़ा मूली peroxida काम में एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध chemiluminescent जांच किट का प्रयोग करेंनिर्माता के निर्देशों के अनुसार दाग को विकसित करने के एसई संयुग्म.
  9. छवि एक कंप्यूटर का उपयोग कर धब्बा एक सीसीडी सुसज्जित कैमरे को झुका और आरआर परीक्षण किया जा रहा डीएनए बांध को इंगित करता है कि जो आरआर, की उपस्थिति में डीएनए सब्सट्रेट गतिशीलता में बदलाव के लिए लग रही है.
    नोट: प्रोटीन डीएनए पारी की विशिष्टता प्रतिक्रिया में खत्म करने या देखा पारी में कमी करनी चाहिए जो unlabeled प्रतियोगी डीएनए की एक अतिरिक्त सहित द्वारा परीक्षण किया जा सकता है.

3. जीनोमिक डीएनए प्रोटीन बंधन के बाद लक्ष्य संवर्धन सत्यापित करें

  1. जीनोमिक डीएनए प्रोटीन बाध्यकारी प्रतिक्रिया
    1. बीच में 2 सेकंड के अंतराल के साथ, 1 सेकंड की 9 कम आयाम दालों के साथ एक microtip का उपयोग कर एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में (सांद्रता 100-200 एनजी / μl पर) 100 μl जीनोमिक डीएनए sonicating द्वारा 500 बीपी के एक औसत आकार के कतरें जीनोमिक डीएनए प्रत्येक.
      नोट: ट्यूब के पक्षों के लिए डीएनए मस्तिष्क, हर 3 दालों के बाद सामग्री नीचे स्पिन हैं. सटीक इस्तेमाल शर्तोंइस्तेमाल किया sonicator साधन के साथ अलग अलग होंगे. sheared डीएनए टुकड़े 100-1000 बीपी से लेकर कर सकते हैं, लेकिन औसत आकार 400-600 बीपी के भीतर होना चाहिए. बहुत ज्यादा बाल काटना कम बरकरार बाध्यकारी साइटों में हो सकता है, और बहुत अधिक या बहुत कम बाल काटना या तो नीचे की ओर पूरे जीनोम प्रवर्धन चरणों के दौरान पुस्तकालय तैयारी को प्रभावित करेगा.
    2. 10 मिमी Tris-एचसीएल 7.5 पीएच, 1 मिमी डीटीटी, 50 मिमी KCl, 5 मिमी 2 MgCl, 25% ग्लिसरॉल, और 50 मिमी एसिटाइल फॉस्फेट में आरआर प्रोटीन (DVU3023 के 0.5 pmol) के साथ sheared जीनोमिक डीएनए के 2-3 ग्राम मिलाएं. 30 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रियाओं सेते हैं. इनपुट डीएनए के रूप में एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और लेबल करने के लिए इस प्रतिक्रिया का स्थानांतरण 10 μl.
      नोट: Acetyl फॉस्फेट में इन विट्रो phosphorylation द्वारा प्रोटीन को सक्रिय करने के लिए जोड़ा गया है. Phosphorylation बाध्यकारी डीएनए को उत्तेजित करता है, लेकिन कई आरआरएस भी सक्रियण 7 के बिना इन विट्रो में डीएनए बाँध. प्रतिक्रिया के लिए जोड़ा प्रोटीन की मात्रा प्रोटीन तैयार करने की गतिविधि पर निर्भर करेगा. EMSA चुनते करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैइस राशि imize.
  2. आत्मीयता प्रोटीन वाली डीएनए को शुद्ध
    1. एक 0.6 मिलीलीटर microfuge ट्यूब नी NTA agarose राल के 30 μl जोड़ें. तल पर राल इकट्ठा करने के लिए 1 मिनट के लिए 100 XG पर अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला हटायें. 100 धोने बफर (10 मिमी Tris-एचसीएल, 7.5 पीएच, 5 मिमी 2 MgCl, 50 मिमी KCl, 25% ग्लिसरॉल) के μl, झटका ट्यूब मिश्रण करने के लिए, और 2 मिनट के लिए 100 XG पर अपकेंद्रित्र जोड़ें. सतह पर तैरनेवाला निकालें.
    2. धोया नी NTA राल के लिए बाध्य प्रतिक्रिया की शेष 90 μl जोड़ें और 30 मिनट के लिए एक रोटरी प्रकार के बरतन में सेते हैं.
    3. 2 मिनट के लिए 100 XG पर अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला (अनबाउंड डीएनए) को हटा दें. , धोने बफर के 100 μl जोड़ें सामग्री मिश्रण करने के लिए ट्यूब झटका, और 2 मिनट के लिए 100 XG पर अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला निकालें. दो बार अधिक धोने कदम दोहराएँ.
    4. राल के लिए क्षालन बफर के 35 μl (20 मिमी सोडियम फास्फेट बफर पीएच 8, 500 मिमी NaCl, 500 मिमी imidazole) जोड़ें और vortexing द्वारा मिश्रण. 5 मिनट के लिए आरटी पर बेंच पर सेते. 2 मिनट के लिए 100 XG पर अपकेंद्रित्र. प्रोटीन वाली डीएनए अंश के रूप में एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और लेबल स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला.
    5. इसके अलावा इनपुट डीएनए को क्षालन बफर के 35 μl जोड़ें.
    6. इनपुट और एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग प्रोटीन वाली डीएनए भिन्न शुद्ध.
  3. पूरे जीनोम इनपुट और प्रोटीन वाली डीएनए के नमूने बढ़ाना.
    1. इनपुट और पीसीआर ट्यूब अलग करने के लिए प्रोटीन वाली डीएनए के 10 μl जोड़ें. 10x विखंडन बफर के 1 μl, पुस्तकालय तैयारी बफर के 2 μl, और प्रत्येक नमूने के लिए लाइब्रेरी स्थिरीकरण समाधान के 1 μl जोड़ें. Vortexing द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं. 2 मिनट, और बर्फ पर ठंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर thermocycler में हीट.
      नोट: डीएनए की प्रारंभिक राशि प्रवर्धन पूर्वाग्रह शुरू करने से बचने के क्रम में कम से कम 10 एनजी होना चाहिए.
    2. , पुस्तकालय तैयारी एंजाइम की 1 μl जोड़ें pipetting द्वारा मिश्रण है, और, 16 ° C/20 मिनट पर थर्मल cycler में 24 ° C/20 मिनट, 20 मिनट, 75 डिग्री सेल्सियस / 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस सेते4 डिग्री सेल्सियस पर, और पकड़
    3. प्रत्येक ट्यूब, पानी की 47.5 μl, 10x प्रवर्धन मास्टर मिश्रण के 7.5 μl, और पोलीमर्स के 5 μl जोड़ें. 94 ° C/15 सेकंड के 20 चक्र, 65 डिग्री सेल्सियस / 5 मिनट के द्वारा पीछा 95 डिग्री सेल्सियस / 3 मिनट, पर अच्छी तरह से और गर्मी से मिलाएं. 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रियाओं पकड़ो
    4. एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग प्रवर्धित डीएनए नमूने शुद्ध और spectrophotometrically डीएनए एकाग्रता को मापने.
  4. QPCR का उपयोग प्रोटीन वाली डीएनए में लक्ष्य संवर्धन सत्यापित करें
    1. डिजाइन qPCR प्राइमरों किसी भी स्वतंत्र रूप से उपलब्ध प्राइमर डिजाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर EMSA सत्यापित लक्ष्य जीन (DVU3025) के अपस्ट्रीम क्षेत्र की 200 बीपी बढ़ाना.
    2. प्रत्येक प्राइमर सेट के साथ प्रत्येक डीएनए टेम्पलेट के लिए तीन प्रतियों qPCR प्रतिक्रियाओं सेट करें. प्रत्येक प्राइमर सेट के लिए एक मास्टर मिश्रण तैयार करें. 1x मास्टर मिश्रण 2x Sybr ग्रीन qPCR मिश्रण की 10 μl, 18 μl की कुल करने के लिए प्रत्येक प्राइमर और पानी की 0.5 माइक्रोन होता है. एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट के प्रति अच्छी तरह से मास्टर मिश्रण की विभाज्य 18 μl.
    3. Dilutई परिलक्षित और 5 एनजी को शुद्ध इनपुट और प्रोटीन वाली डीएनए नमूने / पानी के साथ μl और डीएनए टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल करते हैं. वेल्स को डीएनए टेम्पलेट के 2 μl जोड़ें.
    4. एक अल्ट्रा स्पष्ट qPCR सील फिल्म के साथ थाली सील 200 XG / 1 मिनट पर एक अपकेंद्रित्र में थाली नीचे स्पिन. एक वास्तविक समय qPCR मशीन में प्लेट रखें. साइकिल एसोसिएटेड qPCR सॉफ्टवेयर का उपयोग इस प्रकार है: 95 डिग्री सेल्सियस / 1 मिनट, और 95 ° C/10 सेकंड के 40 चक्र, 59 ° C/15 सेकंड, और 70 ° C/35 सेकंड.
    5. इसके अलावा एक असंबंधित जीन (नकारात्मक नियंत्रण) के अपस्ट्रीम क्षेत्रों बढ़ाना प्राइमरों के साथ तीन प्रतियों qPCR प्रतिक्रियाओं की स्थापना की.
    6. इनपुट डीएनए के उस से प्रोटीन वाली डीएनए का सी टी मूल्य घटाकर ΔC टी की गणना. 2 ΔC टी के रूप में प्रोटीन वाली डीएनए में लक्ष्य जीन की गुना संवर्धन की गणना.
      नोट: लक्ष्य अपस्ट्रीम क्षेत्र इनपुट डीएनए बनाम प्रोटीन वाली डीएनए में समृद्ध किया गया था, तो यह बाध्यकारी प्रतिक्रियाओं और आत्मीयता शुद्धि succ थे इंगित करता है किessful. 4 कदम आगे बढ़ना. लक्ष्य अपस्ट्रीम क्षेत्र के संवर्धन नहीं मनाया गया, तो प्रोटीन के विभिन्न राशि के साथ बंधन प्रतिक्रियाओं (3.1 कदम) दोहराएँ.

4. डीएनए लेबल और सरणी संकरण

  1. Cy5 साथ Cy3 और समृद्ध डीएनए के साथ लेबल दें डीएनए
    OTE: Cy3 और Cy5 रंजक प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं और देखभाल के लिए एक न्यूनतम करने के लिए प्रकाश जोखिम रख लिया जाना चाहिए.
    1. 40 μl के साथ मिक्स 1 ग्राम डीएनए 9 mers Cy3/Cy5-labeled और पानी के साथ 80 μl के लिए मात्रा समायोजित करें.
    2. हीट (thermocycler में) अंधेरे में 10 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर denature. 2 मिनट के लिए बर्फ पर त्वरित ठंड.
    3. मिश्रण अच्छी तरह से, प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, 5 मिमी dNTPs, और 8 μl पानी, और में (अंधेरे में 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते - 2 μl Klenow पोलीमरेज़ (50,000 यू / मिलीलीटर 3'-5'-Exo) जोड़ें एक thermocycler).
    4. 0.5 एम. की प्रतिक्रिया और NaCl समाधान को रोकने के लिए 50 मिमी EDTA जोड़ें
    5. 1.5 मिलीलीटर ट्यूब ऑन करने के लिए स्थानांतरण नमूने10 मिनट के लिए 12,000 XG पर 0.9 isopropanol की मात्रा, 10 मिनट के लिए अंधेरे में सेते हैं, और अपकेंद्रित्र aining. गोली Cy5 लेबल डीएनए के लिए Cy3 लेबल डीएनए और नीले रंग के लिए गुलाबी होना चाहिए.
    6. 2 मिनट के लिए 12,000 XG पर 80% इथेनॉल (500 μl) और अपकेंद्रित्र के साथ गोली धो लें. अंधेरे में 5-10 मिनट के लिए हवा शुष्क छर्रों.
      नोट: हिमपात -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है
    7. 25 μl पानी में resuspend गोली. Spectrophotometrically डीएनए एकाग्रता उपाय.
    8. पूल एक साथ 6 ग्राम अंधेरे में कम गर्मी पर एक अपकेंद्रित्र में एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और वैक्यूम शुष्क में Cy3 और Cy5 लेबल डीएनए (यह पारदर्शी है अगर अपकेंद्रित्र ढक्कन कवर) के प्रत्येक.
      नोट: हिमपात संकरण के लिए तैयार है जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
  2. माइक्रोएरे संकरण
    1. सी. का उपयोग और 42 डिग्री तक तापमान सेट करने से पहले 3-4 घंटे पर संकरण प्रणाली बारी
    2. 1x समाधान 11.8 μl 2x Hybridi होता है कि इस तरह के एक संकरण समाधान मास्टर मिश्रण तैयारzation बफर, 4.7 μl संकरण घटक, और 0.5 μl संरेखण oligo.
    3. 5 μl पानी में छर्रों Resuspend. नमूने के लिए इस मिश्रण की 13 μl जोड़ें. 15 सेकंड के लिए भंवर, 5 मिनट के लिए एक सूखी स्नान में 95 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. लोड हो रहा है के लिए तैयार है जब तक संकरण प्रणाली में 42 डिग्री सेल्सियस पर नमूने रखें.
    4. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार, माइक्रोएरे स्लाइड मिक्सर विधानसभा तैयार करें.
    5. संकरण प्रणाली के भीतर मिक्सर स्लाइड विधानसभा रखें. भरण पोर्ट में लोड नमूना के 16 μl, एक चिपकने वाली फिल्म के साथ बंदरगाहों सील प्रणाली में मिश्रण बारी, और 42 डिग्री सेल्सियस पर 16-20 घंटे के लिए संकरण
    6. पानी में 10x व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बफ़र्स गिराए 1x धोने बफ़र्स मैं (250 मिलीलीटर), द्वितीय (50 मिलीग्राम) और तृतीय (50 मिलीलीटर) तैयार करें, और प्रत्येक के लिए डीटीटी 1 मिमी जोड़ें. गर्म बफर मैं करने के लिए 42 डिग्री सेल्सियस
    7. , गर्म बफर मैं छीलकर मिक्सर युक्त पकवान अंदर एक disassembly उपकरण में मिक्सर स्लाइड, और जगह स्लाइड सख्ती श जबकिहाथ से disassembly उपकरण aking.
    8. धो बफर मैं के 50 एमएल के साथ एक कंटेनर में स्लाइड रखें और हाथ से 2 मिनट के लिए सख्ती से हिला.
    9. स्थानांतरण 50 मिलीलीटर धो बफर द्वितीय के साथ एक दूसरे कंटेनर में स्लाइड और हाथ से 1 मिनट के लिए सख्ती से हिला.
    10. स्थानांतरण 50 मिलीलीटर धो बफर III के साथ एक तिहाई कंटेनर में स्लाइड, और हाथ से 15 सेकंड के लिए सख्ती से हिला.
    11. जल्दी से एक कागज तौलिया पर स्लाइड के किनारों दाग, और एक स्लाइड रैक में रखें. स्लाइड सुखाने के लिए 2 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र. , स्लाइड मामले के भीतर जगह पन्नी के साथ रैप, और एक desiccator में दुकान.
  3. ऐरे स्कैनिंग
    1. साधन के निर्देशों के अनुसार माइक्रोएरे स्कैनर के अंदर स्लाइड रखें.
    2. 532 एनएम = Cy3 और 635 एनएम = Cy5 के रूप में तरंग दैर्ध्य सेट करने के लिए एक स्कैनर सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें, और 350 और 400 के बीच प्रारंभिक photomultiplier लाभ.
    3. स्लाइड पर सरणी का पता लगाने के लिए स्लाइड देख लें. स्कैनिंग के लिए सरणी क्षेत्र का चयन करें. सरणी स्कैन और सरणी सुविधाओं ज्यादातर पीले कर रहे हैं कि photomultiplier सेटिंग्स इस तरह समायोजित करें. हिस्टोग्राम लाल और हरे रंग आरोपित घटता या संभव के रूप में एक दूसरे के करीब के रूप दिखाना चाहिए. घटता संतृप्ति में 10 -5 सामान्यीकृत मायने रखता है ऊपर समाप्त करना चाहिए.
    4. अलग से दोनों 532 और 635 एनएम छवियों को बचाने.
  4. सरणी डेटा विश्लेषण
    1. एक सरणी विश्लेषण सॉफ्टवेयर में छवियाँ आयात. सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, (Cy3 और Cy5 छवियों के लिए) प्रत्येक सरणी के लिए दो जोड़ी रिपोर्ट (. जोड़ी) बना. जोड़ी फ़ाइलों का उपयोग बढ़ाया लॉग 2 अनुपात फ़ाइलें बनाएँ. 500 बीपी की एक रपट विंडो का उपयोग चोटियों के लिए खोज करने के लिए लॉग इन करें 2 अनुपात फ़ाइलों का प्रयोग करें. जीन लक्ष्य के अपस्ट्रीम क्षेत्रों के लिए शिखर स्थल मानचित्र.
    2. सकारात्मक लक्ष्य (EMSA का उपयोग करके निर्धारित और इस उदाहरण में qPCR, DVU3025 द्वारा पुष्टि) शीर्ष चोटियों के भीतर प्रकट होता है की जाँच करें.
      नोट: सकारात्मक लक्ष्य शीर्ष हिट बीच नहीं है, तो यह संभव है कि consi के तहत आरआरderation कई जीन लक्ष्य है और डीएपी चिप्स को दोहराने का आयोजन किया जा सकता है और सभी प्रतिकृति के लिए आम चोटियों एक लक्ष्य सूची उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

5. बाध्यकारी साइट आकृति भविष्यवाणी और मान्यकरण

  1. डीएपी चिप विश्लेषण द्वारा उत्पन्न के रूप में शीर्ष जीन लक्ष्य के लिए नदी के ऊपर क्षेत्रों (400 बीपी) के लिए दृश्यों निकालते हैं. रूपांकनों भविष्यवाणी करने के लिए ऑनलाइन (meme.nbcr.net) रोगाणुओं के माध्यम से इन दृश्यों पर MEME लागू करें.
    नोट: इस तरह के sigma54 निर्भर नियामकों के रूप में बढ़ाने बंधनकारी प्रोटीन शुरू साइट के अपस्ट्रीम कई सौ जोड़े आधार बाध्य कर सकते हैं. अन्य transcriptional नियामकों के लिए, इस तरह के 200 बीपी के रूप में एक छोटे क्षेत्र नदी के ऊपर पर्याप्त होगा.
  2. डिजाइन शीर्ष और दोनों छोर पर 10 ठिकानों से घिरे भविष्यवाणी बाध्यकारी साइट आकृति के होते हैं कि नीचे कतरा डीएनए oligomers. Biotinylated शीर्ष किनारा 5 'ऑर्डर.
  3. 10 मिमी Tris एचसीएल, 8.0 पीएच, 1 मिमी EDTA, और 50 मिमी NaCl में में 1:1.5 अनुपात में ऊपर और नीचे किनारा oligos मिक्सपीसीआर ट्यूब में 20 μl की कुल प्रतिक्रिया मात्रा. गर्मी 25 डिग्री सेल्सियस के धीमी गति से ठंडा करने के बाद एक थर्मल cycler में 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस दस गुना पतला और EMSA के लिए जंगली प्रकार dsDNA सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल करते हैं.
  4. ऊपर के रूप में एक ही चरणों का उपयोग कर संशोधित substrates तैयार है, लेकिन डिजाइन oligomers बंधन मूल भाव के संरक्षित अड्डों में 4-6 प्रतिस्थापन ले जाने के लिए.
  5. आरआर और जंगली प्रकार या संशोधित substrates के साथ बंधन प्रतिक्रियाओं सेट अप और चरण 2 में वर्णित के रूप में EMSA का उपयोग कर जांच करते हैं.
  6. नोट: आरआर जंगली प्रकार सब्सट्रेट लेकिन नहीं संशोधित एक बांध की भविष्यवाणी की आकृति मान्य है.

अन्य संबंधित बैक्टीरियल प्रजातियों में आकृति की 6. संरक्षण

  1. DVU3023 की orthologs होते हैं कि ब्याज के जीनोम का चयन करें. NCBI साइट से जीनोम के लिए अनुक्रम और एनोटेशन फ़ाइलों को प्राप्त करने.
  2. एक स्थिति के निर्माण के लिए डीएपी चिप लक्ष्य से मूल भाव दृश्यों का उपयोग करेगा कि पटकथा लिखने के लिए इस तरह के पर्ल के रूप में एक प्रोग्रामिंग भाषा का उपयोगition भारित मैट्रिक्स और अन्य अनुक्रम जीनोम में मौजूद समान रूपांकनों स्कोर करने के लिए मैट्रिक्स का उपयोग करें.

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Representative Results

उपरोक्त विधि Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7 जीवाणु को कम करने के मॉडल सल्फेट में आरआरएस की वैश्विक जीन लक्ष्य निर्धारित करने के लिए लागू किया गया था. इस जीव होश में है और करने के लिए जवाब है कि संभव संकेतों की व्यापक विविधता का संकेत है, 70 से अधिक आरआरएस द्वारा प्रतिनिधित्व TCSs की एक बड़ी संख्या है. में vivo इन सिगनल सिस्टम के कार्यों पर विश्लेषण करती है उनके संकेतों के बाद से प्रदर्शन करने के लिए कठिन है और इस प्रकार उनके सक्रिय स्थितियां हैं अज्ञात हैं. यहां डीएपी चिप विधि जीन लक्ष्य निर्धारित करने और इस प्रकार एक प्रतिनिधि आरआर DVU3023 के लिए संभव कार्यों की भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.

DVU3023 अपने आत्मीय एच (चित्रा 3) के साथ एक operon में इनकोडिंग एक सिग्मा 54-निर्भर आरआर है. सी टर्मिनल उनकी टैग जीन में क्लोन और ई. से शुद्ध किया गया था कोलाई. प्रारंभिक लक्ष्य निर्धारण के लिए, शुद्ध आरआर एक दस जीन operon (DVU3025-3035) सी है जो अपने बहाव operon के लिए बाध्य करने के लिए परीक्षण किया गया थालैक्टेट तेज और ऑक्सीकरण जीन की onsisting. आरआर DVU3023 DVU3025 (3B चित्रा) के अपस्ट्रीम क्षेत्र में स्थानांतरित कर दिया. अगला आरआर DVU3023 sheared डी. करने के लिए बाध्य करने के लिए अनुमति दी गई थी vulgaris Hildenborough जीनोमिक डीएनए. Phosphorylation DVU3025 के प्रमोटर क्षेत्र के लिए बाध्य करने के लिए आवश्यक नहीं किया गया था, एसिटाइल फॉस्फेट यह अन्य प्रमोटरों के लिए बाध्य करने के लिए आवश्यक था मामले में प्रतिक्रिया करने के लिए जोड़ा गया था. प्रोटीन वाली डीएनए अंश की आत्मीयता शुद्धि के बाद, qPCR DVU3025 के अपस्ट्रीम क्षेत्र इनपुट डीएनए के लिए (सी टी = 6.9) रिश्तेदार (सी टी = प्रोटीन बाध्य अंश में (8.45 गुना) समृद्ध है कि दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया था 9.98 इस तरह इस्तेमाल बाध्यकारी शर्तों आरआर DVU3023 के लिए उपयुक्त थे कि यह दर्शाता है) (चित्रा -3 सी),. एक बेतरतीब ढंग से चुनी जीन (DVU0013) के प्रमोटर क्षेत्र के संवर्धन के अभाव में एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था.

प्रोटीन ही सीमित है और इनपुट डीएनए नमूने तो fluorescently लेबल और संकरित गयाएक डी. intergenic क्षेत्रों में एक उच्च जांच घनत्व था कि vulgaris Hildenborough टाइलिंग सरणी. शीर्ष चार चोटियों DVU3023 (चित्रा 3 डी) के लिए सबसे अधिक संभावना लक्ष्य के रूप में चुने गए हैं. इन चार चोटियों भी डीएपी चिप में पहचान कई अन्य आरआरएस के लिए विश्लेषण करती है और इसलिए. चित्रा 3E DVU3023 द्वारा विनियमित जीन का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व है चिपचिपा डीएनए (तालिका 1) होना दिखाई देते थे, जो कई अन्य लोगों द्वारा पीछा किया गया था. सकारात्मक लक्ष्य DVU3025 उच्चतम स्कोर के साथ प्राप्त की पहली शिखर था. दो जीन लक्ष्य दो अन्य अकेले इनकोडिंग लैक्टेट permeases (DVU2451 और DVU3284) कर रहे हैं. चौथे जीन लक्ष्य एक नदी के ऊपर क्षेत्र में, लेकिन दो convergently लिखित जीन / operons (DVU0652 और DVU0653) के बीच intergenic क्षेत्र में झूठ नहीं करता है. यह एक बड़ी intergenic क्षेत्र है, और इसके अलावा भी एक भविष्यवाणी sigma54 निर्भर प्रमोटर encodes. यह नियमित है कि इस क्षेत्र में इनकोडिंग एक अनदेखा sRNA है कि संभव हैआरआर DVU3023 द्वारा lated.

डीएपी चिप के द्वारा प्राप्त लक्ष्य के अपस्ट्रीम क्षेत्रों का उपयोग करना, MEME एक बाध्यकारी साइट आकृति (चित्रा 3F, तालिका 2) भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. DVU3025 की विशिष्ट आकृति नदी के ऊपर ले जाने EMSA substrates कि आरआर DVU3023 भविष्यवाणी की आकृति को पहचानता है और बांध को पुष्टि करने के लिए डिजाइन किए गए थे. आकृति आगे बाध्यकारी पारी (चित्रा 3 जी) का सफाया कर दिया है, जो मूल भाव भीतर संरक्षित अड्डों में प्रतिस्थापन बनाकर मान्य किया गया था. यह मान्य मूल भाव तो DVU3023 के लिए orthologs था कि अन्य निकट से संबंधित सल्फेट बैक्टीरिया को कम करने के जीनोम अनुक्रम स्कैन करने के लिए पर्ल उत्पन्न लिपियों में इस्तेमाल किया गया था. मूल भाव खुला पढ़ने फ्रेम (तालिका 3) के अपस्ट्रीम क्षेत्रों में स्थित था जब loci संभव जीन लक्ष्य के रूप में चुना गया. Orthologous आरआरएस के लिए भविष्यवाणी की आकृति दृश्यों का उपयोग, एक आम सहमति बाध्यकारी साइट आकृति (चित्रा 3F) बारीकी से मची जो उत्पन्न किया गया हेपूर्वोत्तर के विकास के लिए प्राप्त अकेले vulgaris Hildenborough.

चित्रा 3
चित्रा 3. डी. के लिए जीनोमिक के लक्ष्यों को निर्धारित vulgaris प्रतिक्रिया नियामक DVU3023. ए DVU3023 अपने आत्मीय एच के साथ एक operon में इनकोडिंग है. नीचे की ओर operon एक sigma54 निर्भर प्रमोटर (तुला काला तीर) है और एक उम्मीदवार लक्ष्य जीन के रूप में इस्तेमाल किया गया था. बी शुद्ध आरआर DVU3023 बाध्य और DVU3025 के अपस्ट्रीम क्षेत्रों के. सी. क्यू पीसीआर (DVU3025 7 के अपस्ट्रीम क्षेत्र में स्थानांतरित कर दिया सकारात्मक लक्ष्य) और DVU0013 () एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में चुना. ई प्रोटीन बाध्य समृद्ध डीएनए अंश है, मैं इनपुट डीएनए है. डी. शीर्ष डीएपी चिप विश्लेषण के बाद प्राप्त चार चोटियों. आरंभ और डीएनए के लिए उल्लेख पीई के शुरू और अंत में निर्देशांक समाप्तअक्स; स्कोर शिखर में चौथे सर्वोच्च जांच की प्रवेश 2 आर अनुपात को संदर्भित करता है; एफडीआर झूठे खोज दर =; cutoff_p शिखर डीएपी चिप चोटियों पर आधारित DVU3023 के लिए जीन लक्ष्य की. ई. योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व की पहचान की थी, जिस पर कटऑफ प्रतिशत है. बक्से में नंबर डी एच आर आर जीन में शिखर संख्या ग्रे में नीले और अन्य जीन में हरी, लक्ष्य जीन में हैं संकेत मिलता है. काले तुला तीर sigma54 निर्भर प्रमोटर हैं, हरी भरा हलकों बाध्यकारी साइट रूपांकनों भविष्यवाणी कर रहे हैं. इस प्रकार के रूप जीन नाम हैं: -; LLP - लैक्टेट permease, पाइरूवेट ferredoxin oxidoreductase पोर GLCD-glycolate ऑक्सिडेज़; glpC Fe-S बाध्यकारी प्रोटीन समूह; पीटीए - phosphotransacetylase, ACK-एसीटेट kinase, lldE - लैक्टेट oxidase सबयूनिट; lldF / जी - लैक्टेट oxidase सबयूनिट; MCP -. Pred की मिथाइल स्वीकार कीमोटैक्सिस प्रोटीन एफ Weblogo 8 छवियोंबाध्यकारी साइट आकृति icted. टॉप - डीएपी चिप लक्ष्य से निकाली गई; निचला -. DVU3023 7 EMSA का उपयोग भविष्यवाणी बाध्यकारी साइट के मूल भाव के जी सत्यापन के orthologs साथ जीनोम में मौजूद बाध्यकारी साइटों से निकाली गई. DVU3023 जंगली प्रकार की आकृति (प.) में स्थानांतरित कर दिया लेकिन नहीं संशोधित मूल भाव (एम). डब्ल्यू और एम रूपांकनों के लिए दृश्यों सही 7 पर दिखाए जाते हैं. चित्रा संशोधित और राजीव एट अल 7 से क्रिएटिव कॉमन्स लाइसेंस का उपयोग reprinted.

तालिका 1
तालिका 1. डीएपी चिप सरणी विश्लेषण से शीर्ष 20 चोटियों. तालिका में तीन वर्गों में बांटा गया है. पीक विशेषताओं स्थान शिखर जीनोम या extrachromosomal प्लाज्मिड में पाया गया था कि क्या करने के लिए संदर्भित करता है, जहां सरणी विश्लेषण सॉफ्टवेयर, द्वारा उत्पन्न के रूप में, आरंभ और एस के लिए उल्लेख समाप्त चोटियों के विवरण दिखानेतीखा और चोटी के अंत लोकी, स्कोर शिखर में चौथे सर्वोच्च जांच के लिए लॉग इन करें 2 आर के अनुपात को संदर्भित करता है, एफडीआर झूठे खोज दर मूल्य को संदर्भित करता है, और cutoff_p शिखर की पहचान की थी, जिस पर कटऑफ प्रतिशत है. अन्य दो वर्गों मानचित्रण समन्वय और जीन के लिए चोटी की, क्रमशः, मानचित्रण मानचित्र शुरुआत और अंत स्थल का समन्वय अंत प्रारंभ. इन वर्गों में जीन किनारा जीन (सकारात्मक मूल्यों नकारात्मक मूल्यों loci जीन के भीतर है संकेत मिलता है जबकि लोकी, जीन के अपस्ट्रीम से संकेत मिलता है) की शुरुआत से दूरी इंगित करता है ऑफसेट जीन कोडिंग किनारा, को संदर्भित करता है, ओवरलैप जीन मूल्य सही है, तो लोकस एक जीन overlaps, DVU निर्देशांक के लिए नक्शे है कि जीन की DVU # करने के लिए संदर्भित करता है, और विवरण जीन एनोटेशन इंगित करता है. टेबल संशोधित और राजीव एट अल 7 से क्रिएटिव कॉमन्स लाइसेंस का उपयोग reprinted. अल देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस तालिका के arger संस्करण.

तालिका 2
चित्रा 3 में आम सहमति डीएपी चिप लक्ष्य आधारित आकृति का निर्माण किया जाता तालिका 2. दृश्यों. तालिका संशोधित और राजीव एट अल 7 से क्रिएटिव कॉमन्स लाइसेंस का उपयोग reprinted.

तालिका 3
तालिका 3. DVU3023 अन्य अनुक्रम Desulfovibrio में मौजूद orthologs और संबंधित प्रजातियों के लिए बाध्यकारी साइट रूपांकनों. स्कैन किए गए प्रत्येक जीनोम के लिए, जीव नाम कोष्ठक में DVU3023 को DVU3023 ortholog और इसकी प्रतिशत पहचान के लिए ठिकाना टैग द्वारा पीछा किया, संकेत दिया है. स्कोर इनपुट sequen को समानता के आधार पर पर्ल प्रोग्राम द्वारा सौंपा मूल्य इंगित करता हैCES. विवरण लक्ष्य ओपेरोन में जीनों के लिए जीन एनोटेशन राज्यों. टेबल संशोधित और राजीव एट अल 7 से क्रिएटिव कॉमन्स लाइसेंस का उपयोग reprinted. इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

यहाँ वर्णित डीएपी चिप विधि सफलतापूर्वक एक एक प्रतिनिधि परिणाम के रूप में यहाँ दिखाया गया है, जिनमें से Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7 में कई आरआरएस के लिए जीन लक्ष्य निर्धारित किया गया था. आरआर DVU3023 के लिए, एक उम्मीदवार जीन लक्ष्य चुनने सीधा था. DVU3025 आरआर जीन की तुरंत नीचे की ओर स्थित है, और आरआर और लक्ष्य जीन कई Desulfovibrio प्रजातियों में संरक्षित कर रहे हैं, और इसके साथ ही DVU3025 एक भविष्यवाणी sigma54 निर्भर प्रमोटर है. EMSA तेजी से उम्मीदवार लक्ष्य जीन के लिए बाध्य करने के लिए आर आर परीक्षण करने के लिए एक सरल तरीका प्रदान करता है, और यह भी शुद्ध प्रोटीन नमूना की गतिविधि का आकलन है, साथ ही इष्टतम प्रोटीन डीएनए बाध्यकारी शर्तों का निर्धारण की अनुमति देता है.

डीएनए बाध्यकारी गतिविधि भी phosphorylation डीएनए बाध्यकारी के लिए आवश्यक है देखने के लिए एसिटाइल फॉस्फेट की उपस्थिति और अनुपस्थिति में परीक्षण किया जा सकता है. सभी आरआरएस छोटे अणु दाताओं द्वारा phosphorylated रहे हैं नहीं9, इन मामलों में शुद्ध आत्मीय सेंसर kinase, यदि उपलब्ध हो तो, प्रोटीन को सक्रिय करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. रिसीवर डोमेन कुंजी सक्रिय साइट अवशेषों की कमी है और phosphorylation 10 से सक्रिय नहीं जानते हैं कि असामान्य आरआरएस भी कर रहे हैं. अध्ययन आरआरएस के बहुमत के लिए, phosphorylation 11 बाध्यकारी डीएनए को उत्तेजित करता है. हालांकि phosphorylation 12 बाध्यकारी विट्रो डीएनए में प्रभावित नहीं करता है जहां उदाहरण हैं, और वहाँ phosphorylation 13 बाइंडिंग के लिए आवश्यक है, जहां उदाहरण हैं, और भी प्रमोटरों की सबसेट phosphorylation 14 के साथ बढ़ जाती है बाध्य जहां मामले हैं. डीएपी चिप विधि आरआर से बंधे प्रमोटरों के सेट में मतभेद हैं अगर यह निर्धारित करने के साथ और phosphorylation के बिना किया जा सकता है. हालांकि, यह भी कुछ आरआरएस ई. से एक कार्यात्मक phosphorylated रूप में शुद्ध किया जा सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए कोली 13.

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल एक उनकी टैग protei के लिए हैप्रोटीन वाली डीएनए नी NTA agarose राल का उपयोग कर शुद्ध आत्मीयता है, लेकिन यह आसानी से पुल से नीचे के लिए उपयुक्त आत्मीयता राल का उपयोग करके टैग प्रोटीन के किसी भी प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता पता है कि इस तरह. डीएपी-WGA कदम के बाद, qPCR कदम प्रोटीन gDNA बाध्यकारी शर्तों उपयुक्त और प्रोटीन वाली डीएनए सफलतापूर्वक आत्मीयता शुद्धि से समृद्ध किया गया था कि थे कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक अतिरिक्त नियंत्रण प्रदान करता है. ग्रेटर से 3 गुना संवर्धन संकरण कदम के साथ आगे बढ़ने के लिए पर्याप्त है. EMSA प्रतिक्रिया के विपरीत, पाली dI.dC यह WGA कदम के साथ हस्तक्षेप के बाद प्रतिक्रिया बाध्यकारी gDNA में शामिल करना कोई गैर विशिष्ट प्रतियोगी डीएनए है. प्रोटीन नमूना गैर विशिष्ट डीएनए बाध्यकारी गतिविधि है, तो इस के कारण तो पुष्टि की डीएनए लक्ष्य का स्पष्ट संवर्धन qPCR द्वारा मनाया जा नहीं होगा. इस प्रकार qPCR नियंत्रण कदम gDNA बाध्यकारी प्रतिक्रिया में इस्तेमाल किया प्रोटीन की मात्रा का अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पूरे जीनोम प्रवर्धन के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट intr का दावाoduce कोई प्रवर्धन पूर्वाग्रह न्यूनतम मूल्य उस डीएनए सामग्री और प्रवर्धन चक्र की कम संख्या के लिए अपने दिशा निर्देशों का पालन करते हैं. प्रवर्धन पूर्वाग्रह unamplified डीएनए बनाम प्रवर्धित पर विभिन्न प्राइमर सेट के साथ qPCR का उपयोग कर जाँच की जा सकती है. नीचे की ओर सरणी संकरण पर कोई असर भी विभिन्न लेबलिंग और प्रवर्धित जमा और unamplified जीनोमिक डीएनए hybridizing द्वारा निर्धारित किया जा सकता है.

सरणी डेटा विश्लेषण के बाद उत्पन्न कर रहे हैं कि चोटियों की सूची कई चोटियों 0 से झूठे खोज दर मूल्य होने के साथ आमतौर पर लंबा है. इसलिए इस तरह के उच्च प्रवेश 2 आर स्कोर और cutoff_p मूल्यों के रूप में अन्य चोटी विशेषताओं का एक संयोजन (सरणी विश्लेषण द्वारा उत्पन्न के रूप में इस अध्ययन में इस्तेमाल सॉफ्टवेयर) नीचे सर्वोच्च आत्मविश्वास जीन लक्ष्य को सूची चुनना करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. शीर्ष पांच हिट के बीच पूर्व निर्धारित जीन लक्ष्य की उपस्थिति बहुत डेटा सेट में आत्मविश्वास को मजबूत. Fro नियामक प्रोटीन की एक संख्या के लिए इस परख प्रदर्शनएक ही जीव भी कई डेटा में दिखाई देते हैं कि "चिपचिपा" डीएनए दृश्यों की पहचान करने में मदद मिलेगी एम 7 सेट. एक बाध्यकारी साइट आकृति भविष्यवाणी की है और मान्य किया जा सकता है यदि इसके अतिरिक्त तो चोटियों में सूची में नीचे कम मूल भाव की उपस्थिति भी एक रूढ़िवादी लक्ष्य जीन की सूची का चयन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रमोटर क्षेत्रों के अलावा और डीएनए दृश्यों का संवर्धन सरणी संकरण की कलाकृतियों हो सकता है या पहले से अज्ञात खुला पढ़ने फ्रेम या छोटे RNAs 7 के नियमन का संकेत हो सकता. एक जीन लक्ष्य EMSA का उपयोग पूर्व निर्धारित नहीं किया जा सकता है, जहां नियामकों के लिए, डीएपी चिप परख "अंधा" 7 प्रदर्शन किया जा सकता है. ऐसे मामलों में भी, एक बाध्यकारी साइट आकृति की पहचान जीन लक्ष्य के चयन में सुधार होगा. परख में प्रयोग की जाने वाली प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करने बेतरतीब ढंग से चुनी डीएनए substrates का उपयोग EMSA द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है जो प्रोटीन, के गैर विशिष्ट बंधन गतिविधि पर निर्भर करेगा. कम सांद्रता टी के लिए बेहतर कामउच्च अविशिष्ट बंधन गतिविधि के साथ नली प्रोटीन. एक अंधा डीएपी चिप की विश्वसनीयता विभिन्न प्रोटीन सांद्रता के साथ दोहराने assays के प्रदर्शन में सुधार किया जा सकता है. कुछ लक्ष्यों के साथ आरआरएस के लिए, सिर्फ दो या एक भी परख बाद EMSAs का उपयोग मान्य किया जा सकता है जो एक लक्ष्य सूची उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त हो सकता है. ऐसे आरआरएस के लिए डीएपी चिप डेटा आमतौर पर शुरुआती कुछ चोटियों परे प्रवेश 2 आर के स्कोर या cutoff_p मूल्यों में एक स्पष्ट कूद दिखा. कई लक्ष्यों के साथ आरआरएस के लिए, तीन replicates से डेटा EMSA सत्यापन के लिए चुना जा सकता है, जिनमें से कुछ आम चोटियों, की एक सूची उत्पन्न करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है.

डीएपी चिप लक्ष्यों के आधार पर बाध्यकारी साइट रूपांकनों भविष्यवाणी करने की क्षमता इस विधि के मूल्य के लिए कहते हैं और बेहद प्राप्त जानकारी बढ़ जाती है. EMSA फिर प्रयोगात्मक भविष्यवाणियों को सत्यापित करने के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल प्रदान करता है. पर्ल या अन्य प्रोग्रामिंग भाषा में सॉफ्टवेयर लिपियों उपलब्ध जीनोम seque के माध्यम से तेजी से खोज करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैNCES. परिणाम अनोखे खोजा जीनोम में विनियमित orthologous लक्ष्य जीन के साथ ही लक्ष्य जीन दोनों की पहचान करेगा. यहाँ दिखाए गए प्रतिनिधि परिणाम में, DVU3023 के लिए पहचान की चार नदी के ऊपर लक्ष्य क्षेत्रों में से तीन लैक्टेट तेज और ऑक्सीकरण से संबंधित जीन कार्यों एनोटेट है. DVU3023 के लिए बाध्यकारी साइट आकृति मान्य किया गया था इसके अतिरिक्त, के बाद से अन्य जीनोम समान आकृति साइटों के लिए खोजा जा सकता है. साथ में परिणाम DVU3022-3023 टीसीएस अच्छी तरह Desulfovibrio और अन्य संबंधित सल्फेट बैक्टीरिया को कम करने में संरक्षित है कि संकेत मिलता है, और यह एसीटेट के लिए लैक्टेट परिवहन और ऑक्सीकरण के लिए जीन को नियंत्रित करता है. लैक्टेट इन जीवों द्वारा इस्तेमाल किया प्राथमिक कार्बन और इलेक्ट्रॉन स्रोत है, DVU3023 संभावना उनके शरीर क्रिया विज्ञान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. आरआर DVU3023 के लिए शीर्ष डीएपी चिप चोटियों के बीच, एक intergenic क्षेत्र भी वहाँ था. एक बाध्यकारी साइट आकृति इस क्षेत्र में नहीं पाया गया है, एक भविष्यवाणी सिग्मा 54-निर्भर प्रमोटर की उपस्थिति टी पता चलता हैटोपी इनकोडिंग एक अज्ञात ओआरएफ या sRNA वहाँ हो सकता है, और यह DVU3023 के लिए एक सच्चे लक्ष्य हो सकता है. यह निष्कर्ष अकेले कम्प्यूटेशनल भविष्यवाणियों के आधार पर लक्ष्य साइटों का निर्धारण करने के लिए विरोध के रूप में बाध्यकारी साइट भविष्यवाणियों के साथ संयुक्त प्रयोगात्मक डीएपी चिप दृष्टिकोण के मूल्य पर प्रकाश डाला गया.

ऐसे में यहाँ वर्णित एक के रूप में इसी प्रकार इन विट्रो विधियों केवल कुछ मामलों में 15-17 में इस्तेमाल किया है और बहुत मुश्किल से ही एक पहले से अशिक्षित नियामक के लिए किया गया है. अनुकूलन EMSA और qPCR पिछले काफी विधि एक उपन्यास नियामक के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है जब परिणामों का विश्लेषण करने में सहायता करेगा सरणी संकरण करने के लिए कदम. सरणी मुद्रण एक बाधा बन जाता है, डीएपी कदम बाध्यकारी साइटों 18,19 प्राप्त करने के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के साथ जोड़ा जा सकता है. बन अधिक सरणी आधारित विधियों अनुक्रमण आधारित रणनीति, विधि के ऐसे भविष्य रूपांतर ओ के लिए कस्टम टाइलिंग प्रोटीन डिजाइन की जरूरत गतिरोध उत्पन्न साथ एवजी के रूप मेंब्याज की rganism. चिप seq टेक्नोलॉजीज चिप चिप तरीकों की तुलना में जब चोटियों का पता लगाने के अधिक से अधिक संवेदनशीलता और विशिष्टता में परिणाम और भी तेजी से और अधिक लागत प्रभावी 20 होते जा रहे हैं. इस लेख दो घटक प्रतिक्रिया नियामकों पर ध्यान केंद्रित किया है, इस विधि किसी भी प्रोकार्योटिक या यूकेरियोटिक प्रतिलेखन कारक 15 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Nucleosome ऑक्यूपेंसी अक्सर विनियमित और vivo में से यूकेरियोटिक प्रतिलेखन कारक के लिए बाध्यकारी साइटों लक्ष्य की तुलना करने और इन विट्रो विश्लेषण में इन प्रभावों को 21 प्रकट कर सकते हैं कर रहे हैं कि लक्ष्य पर एक प्रभाव है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए ब्याज की कोई संघर्ष है.

Acknowledgments

हम वीडियो की शूटिंग के लिए तैयार करने में उसकी मदद के लिए और तकनीक के प्रदर्शन के लिए एमी चेन धन्यवाद. पहेली द्वारा आयोजित इस काम: जीन और आणविक विधानसभाओं (http://enigma.lbl.gov) के साथ पारिस्थितिकी प्रणालियों और नेटवर्क एकीकृत, लॉरेंस बर्कले राष्ट्रीय प्रयोगशाला में एक वैज्ञानिक फोकस क्षेत्र कार्यक्रम, विज्ञान, जैव के कार्यालय के कार्यालय और द्वारा समर्थित किया गया अनुबंध सं डे-AC02-05CH11231 के तहत अमेरिका के ऊर्जा विभाग के पर्यावरण अनुसंधान,.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HisTrapFF column (Ni-Sepharose column) GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA 17-5255-01
Akta explorer (FPLC instrument) GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA
HiPrep 26/10 Desalting column GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA 17-5087-01
Qiaquick Gel extraction kit Qiagen Inc, Valencia, CA, USA 28704
Biotin-labeled oligonucleotides Integrated DNA Technologies N/A
6% polyacrylamide-0.5x TBE precast mini DNA retardation gel Life Technologies, Grand Island, NY, USA EC63652BOX Alternately, you can pour your own gel.
Nylon membrane EMD Millipore, Billerica, MA, USA INYC00010
Trans-Blot SD Semi-dry electrophoretic transfer cell Biorad, Hercules, CA, USA 170-3940
Extra thick blot paper, 8 x 13.5 cm Biorad, Hercules, CA, USA 170-3967
UV crosslinker Model XL-1000 Fisher Scientific 11-992-89
Nucleic Acid chemiluminescent detection kit (Pierce) Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA 89880
Ni-NTA agarose resin Qiagen Inc, Valencia, CA, USA 30210
GenomePlex Whole genome amplification kit (Fragmentation buffer, library preparation buffer, library stabilization solution, library preparation enzyme, 10x amplification master mix, WGA polymerase) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA WGA2-50RXN
Nanodrop ND-1000 Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA For quantitation of DNA
Perfecta Sybr Green SuperMix, with ROX Quanta biosciences 95055-500 Any Sybr Green PCR mix may be used
PlateMax Ultra clear heat sealing film for qPCR Axygen
Name Company Catalog Number Comments
96-well clear low profile PCR microplate Life Technologies, Grand Island, NY, USA PCR-96-LP-AB-C
Applied Biosystems StepOne Plus Real time PCR system Life Technologies, Grand Island, NY, USA 4376600 Any real time PCR system may be used
Qiaquick PCR purification kit Qiagen Inc, Valencia, CA, USA 28104 Any PCR clean up kit may be used
Cy3/Cy5-labeled nonamers Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USA N46-0001, N46-0002
Klenow polymerase 50,000 U/ml, 3'-5' exo- New England Biolabs, Ipswich, MA M0212M
Hybridization system Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA N/A This company no longer makes arrays or related items, so alternate sources such as Agilent or Affymetrix will need to be used.
Custom printed microarrays and mixers Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA N/A
Hybridization kit (2x Hybridization buffer, Hybridization component A, Alignment oligo) Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA N/A
Wash buffer kit (10x Wash buffer I, II, III, 1 M DTT) Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA N/A
GenePix 4200A microarray scanner Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA This model has been replaced by superior ones
GenePix Pro microarray software Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA
Nimblescan v.2.4, ChIP-chip analysis software Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA N/A

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References

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जेनेटिक्स अंक 89 डीएनए आत्मीयता शुद्ध चिप प्रतिक्रिया नियामक प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी साइट दो घटक प्रणाली संकेत पारगमन, लैक्टेट उपयोग नियामक चिप चिप
बैक्टीरियल के लिए दो घटक नियामक प्रणाली जीन लक्ष्य निर्धारित करने के लिए डीएनए आत्मीयता शुद्ध चिप (डीएपी चिप) विधि
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Rajeev, L., Luning, E. G.,… More

Rajeev, L., Luning, E. G., Mukhopadhyay, A. DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems. J. Vis. Exp. (89), e51715, doi:10.3791/51715 (2014).

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