マラリア蚊の開発、産卵および生存者にエピジェネティック薬の試験に及ぼす影響のために毒物学的アッセイ

サマリー

蚊の発生、繁殖力、生存率に対するエピジェネティックな薬DZNepの効果を調べるためのプロトコルが開発されました。 ここでは、未成熟の蚊へのDZNepの水性曝露と、SAH加水分解酵素阻害の測定に加えて、成虫の蚊へのDZNepの血液ベースの曝露の手順について説明します。

要約

殺虫剤耐性マラリア制御プログラムの主要な問題を提起する。蚊はマラリアは熱帯諸国で遍在する問題を制御すること、すぐに環境の変化の広い範囲に適応させる。殺虫剤抵抗性の集団の出現は、媒介蚊の制御のための新規薬剤標的経路及び化合物の探索を保証します。エピジェネティック薬はよくしかし多くの昆虫への影響について知られていない、がん研究に確立されている。この研究は、マラリア媒介、 ハマダラカに、3-デアザネプラノシンA（DZNep）、癌治療のための実験的なエピジェネティック薬の毒性効果を調べるための単純なプロトコルを提供します。化合物は、治療を制御するために相対的な成体の蚊の繁殖を減少に対し、死亡率およびサイズ​​の減少の濃度依存的増加が、DZNepに露出未熟蚊で観察された。また、S中の薬物依存的な減少があった-治療を制御するためDZNepの相対への曝露後に蚊におけるアデノシル（SAH）加水分解酵素活性。これらのプロトコルは、順番に、水溶性のエピジェネティック薬または化合物の毒性効果を探索するためのユニークな多面的なアプローチを実証し、実験的な薬剤に対して複数の毒性学的エンドポイントを評価するためのシンプルな、ステップバイステップの手順で研究者を提供し、媒介蚊や他の昆虫に対する関心。

概要

マラリアは世界で昆虫関連死亡の最大数を担当しています。推定2.19億例は、主にアフリカ¹において約66万人が死亡、その結果、世界中で毎年起こる。協調した努力にもかかわらず、マラリアプログラムはいくつかの課題に直面しています。殺虫扱わ蚊帳とプログラムの屋内残留噴霧フォームキーコンポーネントが、地元住民の殺虫剤抵抗性は、これらの取り組み^2を妨げる。殺虫剤抵抗性の蚊の個体数の急速な増加は、主に彼らの環境の変化に迅速に適応し、異なるニッチ^3,4,5を悪用するマラリア蚊の能力に起因する。殺虫剤抵抗性の既存のメカニズムを克服するために、新規殺虫剤の目標と次の世代の化合物の探索が保証されています。マラリアmの様々なライフステージに実験的な殺虫剤の有効性を決定するための簡単​​な、ステップバイステップのプロトコルosquitoesが大幅にこれらの取り組みを強化するだろう。

細胞株および動物モデルでの薬物作用の薬理学的研究は、細胞および生物の遺伝学と生理学を調節するために有用なツールとしてのエピジェネティックな薬の使用を確立している。 DNAメチル化およびヒストン修飾は、基礎となるDNA配列^6を変更することなく、多細胞生物における遺伝子発現に影響を与える2つのエピジェネティックなメカニズムである。メチル化などの翻訳後修飾は、細胞の完全性および遺伝子発現を維持する上で重要な役割を果たし^{、7,8,9、....}

プロトコル

注：プロトコルの3つの部分幼虫蚊、繁殖力の効果を研究するための雌成虫に対するDZNepの血液ベース露光DZNep薬物の水性曝露を記述し、DZNepによるSAH加水分解酵素の阻害は、単純な比色法を用いて測定。これらのアッセイの概略図を図1に示されている。

1.未熟モスキート開発·サバイバーシップアッセイ

注：このセクションでは、蚊の幼虫の発達と生存に影響を与える水溶性薬物の使用を説明しています。

1. ハッチA. 28℃でのハマダラカの卵蒸留水（DH ₂ O）で2 ^回目の幼虫にリアそれらを。
2. 6ウェルDNアーゼ、RNアーゼを含まない細胞培養プレートを取り、各ウェルに10ミリリットルのdH ₂ Oに注ぐ。
3. 2 ^番目の齢で蚊の幼虫を選択して、ウェル当たり15の幼虫を追加します。プレートに^第 2齢幼虫を追加する前に、P過剰の水を除去するために2-3秒間ペーパータオル上にUT。
4. 実験をランダム化するために色分けされたテープでラベルの井戸。各プレート上の試験濃度につきラベル2のウェル（ 図2）。
5. のdH ₂ O ....

結果

図1は、アッセイの略図である。それはこの資料に記載されている手順のさまざまな手順について説明します。プロトコルは蚊の異なるライフステージに基づいているように、ここで詳細な実験のために、次にすべき特定のシーケンスはありません。ユーザは、サンプルの可用性に依存して、同時に、1つ又は複数のアッセイを実施することを選択することができる。

図2は、未成熟な蚊の開発と生存アッセイのためにセットアップするプレートを示しています。試験濃度及び反復の数は、ユーザの要件および薬物のアベイラビリティに応じて変更することができる。未熟蚊アッセイのために、DZNepの1mMストック溶液は、0.5μMおよび薬物を含まない集団を含有するウェルを有する対照パンと一緒に5μMの最終濃度を達成するために蚊を含む水に添加した。実験は、その多くの幼虫と蛹survを実証したDZNep処理したウェルにおけるよりも対照ウェルにived。

図3は、

ディスカッション

このプロトコルの適用が成功に不可欠ないくつかのステップがあります。幼虫のアッセイのために、注意が正しくラベルを付け、各試験濃度を複製するために注意が必要です。試験サンプルをランダム化し、それぞれの試験ウェルに薬物の所定量を添加して設定し、この実験の重要な部分である。 96ウェルマイクロプレートに^第 2齢蚊の幼虫を追加する前に、それぞれの幼虫は、過剰の水を除去するために2-3秒間ペーパータオルを置くことができる。乾燥を防ぐために、幼虫はすぐに鉗子の鈍ペアを使用してマイクロプレートウェルに転送する必要があります。これは、各ウェルマイクロプレート中の水の体積を確保し、意図したように、薬物の濃度が残る。自分の体の長さを測定するために、幼虫を転送する場合には、静止して維持するために、数分間氷上で幼虫を置くことが推奨される。異なる化合物は、このプロトコルを適応させる際に、注意が各々に加えストック溶液の量を決定するために注意が必要うまく。このような場合には、直前に各ウェルマイクロプレートに幼虫を添加する水の中の化合物の計算された量を溶解するのに良いかもしれない。

吸血アッセ.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
96ウェルマイクロプレート	フィッシャーサイエンティフィック	12565561
細胞培養プレート	CytoOne	CC7682-7506
遠心分離機	Sorvall Fresco	76003758	異なる遠心分離機を使用することができます
カラーテープロール	フィ	ッシャーS68134
解剖顕微鏡	オリンパス	SZ
DTNB	シグマ アルドリッチ	D8130
DZNep.HCl	シグマ アルドリッチ	SMLO305
卵皿 カップ
濾紙	フィッシャー	09-795E
ガラスフィーダー	バージニア工科大学
ガラス組織ホモジナイザー
発熱体	フィッシャー サイエンティフィック	NC0520091
インキュベーター	パーシバル科学	I36VLC8	別のインキュベーターを使用することができます
マイクロ遠心チューブ、2 ml	Axygen	22-283
微量遠心チューブ、1.5 ml	Axygen	MCT-150-C
マイクロピペット	エッペンドルフ	4910 000.069
Na2HPO4	Fisher Scientific	M-3154
NaH2PO4	Fisher Scientific	M-8643
pH meter	メトラー・トレド 7easy	S20
プレート リーダー	Spectramax	M2
SAH	Sigma Aldrich	A9384	ストア -20 °C
トリトン X-100	シグマ アルドリッチ	T8787