Abstract
Инсектицидные сопротивление представляет собой серьезную проблему для программ по борьбе с малярией. Комары адаптироваться к широкому диапазону изменений в окружающей среде быстро, что делает борьбы с малярией вездесущую проблему в тропических странах. Появление инсектицидами устойчивых популяций гарантирует разведку новых целевых наркотиков путей и соединений для контроля комаров-переносчиков. Эпигенетические препараты хорошо зарекомендовали себя в области исследований рака, но не так много известно об их влиянии на насекомых. Это исследование дает простой протокол для изучения токсикологических эффектов 3-Deazaneplanocin А (DZNep), экспериментальной эпигенетической препарата для терапии рака, на переносчиками малярии, Anopheles gambiae. Зависит от концентрации увеличение смертности и уменьшением размера наблюдалось в незрелых комаров, подвергшихся DZNep, в то время как соединение уменьшили плодовитость взрослых комаров по сравнению с контрольными процедурами. Кроме того, было снижение наркотической зависимостью в S -аденозилгомоцистеин (САК) гидролазы деятельность в комаров после воздействия DZNep по сравнению с контрольной процедуры. Эти протоколы обеспечивают исследователя с простой, шаг за шагом процедуры для оценки несколько токсикологических для экспериментального препарата и, в свою очередь, демонстрируют уникальный подход мульти-контакт для изучения токсикологических эффектов водорастворимых эпигенетических наркотиков или соединений Интерес к комаров и других насекомых.
Introduction
Малярия является ответственным за наибольшее количество смертей насекомых, связанных в мире. По оценкам, 219 млн случаи происходят ежегодно во всем мире, в результате чего около 660 000 случаев смерти, главным образом в Африке 1. Несмотря на согласованные усилия, малярии, сталкиваются с рядом проблем. В то время как инсектицидные сеток, обработанных инсектицидами, а также крытый остаточные компоненты форма распыления ключевые программы, устойчивость к инсектицидам в местных групп населения подрывают эти усилия 2. Быстрый рост инсектицидом устойчивых популяций комаров в значительной степени объясняется способностью малярийных комаров быстро адаптироваться к изменениям в окружающей среде и эксплуатировать различные ниши 3,4,5. Чтобы преодолеть существующие механизмы стойкости к инсектицидам, разведка новых объектов инсектицидами и соединений нового поколения является оправданным. Простой, шаг за шагом протокол для определения эффективности экспериментальных инсектицидов на различных стадиях жизненного цикла малярийного мosquitoes значительно повысит эти усилия.
Фармакологические исследования эффектов препарата на клеточных линий и моделей на животных установлено использование эпигенетических наркотиков в качестве полезного инструмента для модуляции генетики и физиологии клеток и организмов. Метилирование ДНК и модификации гистонов два эпигенетические механизмы, которые влияют на экспрессию генов в многоклеточных организмов, не изменяя основную последовательность ДНК 6. Сообщение трансляционные модификации, такие как метилирование играют решающую роль в поддержании целостности клеток и экспрессию генов, и может повлиять на несколько фундаментальных процессов 7,8,9. Исследования в некоторых видов насекомых подчеркнули важность эпигенетических в процессах с участием оогенеза и стволовых ячейку для содержания 10, а также дозовой компенсации 11. Тем не менее, такие аспекты переносчиков болезней еще предстоит исследовать. Использование соединения для модуляции эту систему в комаров может предоставить нам вдостопримечательности в роман целевых инсектицид путей. 3-Deazaneplanocin (DZNep) является известный метилирования гистонов ингибитор, которые оказывают влияние на различные виды рака были изучены 12,13,14,15,16. DZNep является стабильным водорастворимый эпигенетические препарат, который косвенно препятствует гистонов лизина N -methyltransferase (EZH2), компонент Поликомб репрессивный комплекс 2 (PRC2) в клетках млекопитающих. PRC2 играет важную роль в регуляции роста стволовых клеток в многоклеточных организмов, и метилирования гистонов является ключевым аспектом PRC2 опосредованного молчания генов. В ослабленным иммунитетом мышей, клетки предварительно обрабатывали DZNep, как было показано, менее онкогенными 17. Этот препарат становится для изучения других заболеваний, таких как безалкогольное жирных заболевания печени, в которой EZH2 вовлечен 18. DZNep является создана S -adenosylhomocysteine (САК) гидролазы ингибитор 19, 20. Ингибирование САК результатов гидролазы внакопление и САК, в свою очередь, приводит к ингибированию активности метилтрансферазы, ограничивая доступные метил группы доноров. САК является производным аминокислоты используются многих организмов, в том числе насекомых, в их метаболических путей. Недавнее исследование показало, что DZNep в низких дозах может влиять на диапаузы и задержкой развития у насекомых 21.
Здесь надежный протокол исследования влияния водорастворимой соединения на различных стадиях жизненного цикла комаров развивается. Три части этого протокола включают в себя инструкции для изучения влияния водорастворимого соединения на незрелых комаров, взрослых крови вскармливания женщин и ферментативной активности у взрослых самцов и самок москитов. Во-первых, DZNep растворяют в воде для изучения незрелых развитие комаров и выживание. Это выполняется в двух концентрациях для сравнения каких-либо различий, связанных с 10-кратным увеличением воздействия лекарственного средства. Для изучения влияния препарата на взрослых самок комаров, DZNepдобавляется к defibrillated овечьей крови и подается кровь искусственно женщин. Впоследствии, исход препарата на плодовитость рассматривается. Наконец, активность фермента анализ проводят с использованием 5,5'-дитиобис (2-нитробензойной кислоты) (DTNB) в качестве индикатора для определения влияния на DZNep SAH гидролазы ингибирования у взрослых самцов и самок москитов. Хотя этот протокол разработан с малярийного комара Anopheles, gambiae, он может быть легко адаптирована к изучению влияния соединений, представляющих интерес в любых видов комаров или других насекомых. Методы, описанные в этом протоколе не может быть эффективно применено к препарату с ограниченным или нет растворимости в воде или водной среде.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти три части протокола описания водной экспозиции препарата DZNep в местах скопления личинок комаров, в контакте с кровью основе из DZNep к взрослых самок для изучения его влияния плодовитости и САК гидролазы ингибирование DZNep измеряется с помощью простого колориметрического технику. Схематическое представление этих анализов показано на фиг.1.
1. Незрелые Москитная развития и выживаемости Анализы
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе объясняется, как использовать растворимый в воде препарат, который влияет на развитие личинок комаров и выживание.
- Hatch А. gambiae яиц при 28 ° С в дистиллированной воде (DH 2 O) и задней им 2-й возрастной стадии личинок.
- Возьмите шесть-а-аз, РНК РНКазы клеточной культуры тарелку и залить 10 мл дН 2 O в каждую лунку.
- Выберите личинок комаров в 2-й возрастной стадии и добавить 15 личинок на лунку. Перед добавлением 2-й возрастной стадии личинки к пластине, струт их на бумажное полотенце на 2-3 сек, чтобы удалить лишнюю воду.
- Этикетка скважин с цветовой кодировкой лент в случайном порядке эксперимента. Добавьте 2 скважин в концентрации тест на каждой пластине (рисунок 2).
- Подготовьте 1 мМ DZNep гидрохлорид (MW = 298,73) раствор путем растворения 0,3 мг DZNep в 1 мл дН 2 O. Добавить исходного раствора DZNep.HCl с мечеными скважин для достижения конечной концентрации 0,5 мкМ и 5,0 мкМ.
ПРИМЕЧАНИЕ: раствор можно хранить при 4 ° C за короткий срок (1 день в месяц) или -20 ° C на длительный срок (более одного месяца).
Примечание: Добавление раствора для вышеупомянутых концентрациях, не будет изменять объем воды в скважинах значительно. Однако в случае значительно более высоких концентраций, желательно, чтобы растворить соединение в личиночной среды, чтобы избежать ненужного разбавления соединения. - Добавить равное количество чешуйчатого рыбы пищи в каждую лунку. Закройте планшетс и инкубировать их на 28 ° C в инкубаторе.
- Запишите смертности в DZNep обработанных и необработанных личинок комаров после периода экспозиции 24-час. Снимите и выбросьте любые мертвых личинок. Повторяйте эту запись каждый день, пока все личинки умирают или окукливаются и появляются как взрослые. Запишите размер личинок каждый второй день, то есть, день 0, 2, 4, 6, 8, пока они не окукливаются.
- Проанализируйте личинок данные развития и смертности с использованием соответствующего программного обеспечения статистического анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: гистограмма может использоваться для представления данных о смертности в Microsoft Excel. Многофакторный дисперсионный анализ (MANOVA) осуществляется с программным обеспечением, таким как JMP или SPSS будет выявить, если различные дозы препарата приводит к существенному изменению выживания личинок комаров.
2. Плодовитость Анализ путем введения лекарственного средства через искусственный подачи на самок комаров
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе подробно добавление препарата в кровий подачи ее взрослых самок комаров с помощью системы искусственного подачи.
- Настройка взрослых комаров клетки с равным количеством мужчин и женщин комаров для контроля и испытаний клетке. Обеспечить 10% -ный раствор сахара, смоченной в ватные шарики в обеих клетках до женщин готовы для кормления (3-5 дней является оптимальным для Anopheles gambiae).
- 2 ч до кормления крови, снимите ватные шарики, чтобы женщины голодны.
- Собирают две искусственные кровеносные питатели, которые состоят из перевернутого широком нижней нную воронку (диаметр = 50 мм, длина = 70 мм) и окружающей пластика запечатанную промышленного клея. Прикрепите пластиковые трубы (диаметр = 7 мм) с двумя выходами питающих кабелей (диаметр = 10 мм) через разъемы для притока и оттока воды. Этикетка две кормушки, как "Контроль" и "5 мкМ DZNep."
- Использование имеющихся в продаже нагревательный элемент, настроить программу для кормления. В "меню" Перейти к "Настройки"и выберите "Уставки"; Появится предустановленной программы. Выберите "SP1" и установите температуру в течение 37 ° С.
Примечание: Нагревательный элемент гарантирует, что кровь вводят поддерживают при постоянной температуре. Дополнительные параметры программы могут быть использованы для различных комаров или насекомых видам. - Заполните ведро с водой и опустите в нее нагревательный элемент в воду.
- Вырезать квадратный кусок парафильмом (50 мм х 50 мм) и растянуть его, чтобы сделать тонкую мембранную пленку. Обложка дно искусственных фидеров с парафильмом. Вырезать другой кусок парафильмом (50 мм х 10 мм), растянуть его и запечатать края кормушки.
- Соберите систему, соединяющий кормушки и нагревательный элемент трубами. После завершения переключения на систему и выберите "SP1". Нажмите "Enter", чтобы запустить систему.
ПРИМЕЧАНИЕ: вода нагреваются до 37 ° C и выдерживают при этой температуре. - Монитор-йэлектронной температуры воды с помощью термометра в ведре воды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разъемы и трубки помогают поддерживать постоянную циркуляцию воды через систему так, что температура крови остается на 37 ° С. - Заполните плоскую нижнюю лоток с 10% -ным раствором хлорной извести, который будет использоваться для обеззараживания любых утечек крови.
- Добавить 2 мл крови defibrillated овечьей для микроцентрифужных трубки. Добавьте описание этого как "Контроль". Повторите процесс для экспериментального трубки, обозначенный как «5 мкм DZNep" .add 6 мкл DZNep маточного раствора (см шаг 1,5) в экспериментальной пробирку "5 мкМ DZNep" Осторожно смешать кровь и препарат переворачиванием несколько раз. Инкубируйте трубки 10 мин при комнатной температуре.
- С помощью пипетки добавьте 2 мл Контроль и испытание крови к верхней части соответственно помечены фидеров. Откажитесь от пипетки в раствор отбеливателя. Накройте клетку с темной сумкой и дышать воздухом на клетке периодически поощрять Females для кормления.
- Пусть комары питаются около 30 мин. После подачи завершена, выключите нагревательный элемент, принять кормушки, и лишить парафильм. Замочите подачи в раствор отбеливателя в течение приблизительно 5 минут и хорошо промыть в деионизированной воде.
- Удалить кормушки и положить ватные шарики с сахарной водой на клетках в течение 48 ч. Поместите яйцо блюдо, содержащей воду и фильтровальную бумагу в клетках ночь, чтобы облегчить кладку. На каждом яйцо блюдо с соответствующим тестируемой концентрации или управления.
- Снимите яйцо блюдо на следующий день и изучить количество и структуру яйца под стерео микроскопом. Получение изображений с помощью программного обеспечения Q-colors5. Подсчитайте количество яиц. Анализ разницы в количестве яиц, полученных из опытных и контрольных клетках.
Примечание: неспаренный т-тест может быть использован, чтобы определить, является ли количество яиц значительно отличаются (р ≤0.05).
3. Биохимический Анализ комаров ферментного ингибированияпо наркотикам
Примечание: В этом разделе описаны ферментативную активность анализа с использованием DTNB в качестве индикатора для определения влияния на DZNep SAH гидролазы ингибирования у взрослых самцов и самок москитов.
- Подготовьте 2 HPO 4 (двузамещенный фосфат натрия) М раствора Na 0,1 путем добавления 14,19 г Na 2 HPO 4 до 1 л дН 2 O. Далее, подготовить M NaH 2 PO 4 (одноосновной фосфат натрия) решение 0,1 путем добавления 13,79 г NaH 2 PO 4 до 1 л ЦТ 2 O.
- Титруйте 0,1 М Na 2 HPO 4 раствор с 0,1 M NaH 2 PO 4 рН раствора до 8,5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет работать маточный раствор 0,1 М Na 2 HPO 4 (рН 8,5). - Подготовка гомогенизации раствора 0,1 М Na 2 HPO 4 (рН 8,5) с добавлением 0,3% Тритон Х-100.
ПРИМЕЧАНИЕ: решение гомогенизации можно хранить при 4 ° С. - Prepare 1,6 мМ SAH (ММ = 384,4) раствор путем растворения 6,15 мг САК в 10 мл 0,1 М Na 2 HPO 4 (рН 8,5).
- Приготовьте 1,6 мМ ДТНБ (ММ = 396,4) раствор путем растворения 6,3 мг DTNB в 10 мл 0,1 М Na 2 HPO 4 (рН 8,5). Хранить свежий DTNB решение на льду до использования.
- Подготовьте 1 мМ DZNep.HCl (MW = 298,73) решение путем растворения 0,3 мг DZNep в 1 мл дН 2 O. Далее, разбавить 1 мм DZNep решение в серии концентраций от 1000 мкМ до 0,002 мкМ в дН 2 O.
- Для измерения гидролазы ингибирование SAH по DZNep, получения неочищенного экстракта фермента комаров: Перемешать 10 негосударственных крови кормили взрослых комаров в 1 мл ледяной 0,1 М NaH 2 PO 4 (pH 8,5), содержащий 0,3% Triton X- 100, с использованием стеклянного ткани гомогенизатора. Передача гомогената в 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
- Центрифуга гомогената в течение 5 мин при 10000 х г при 4 ° С. Передача супернатант в чистые1,5 мл микроцентрифужных трубки. Использование супернатант в качестве источника фермента для биохимического анализа SAH.
- Для заготовки лечения (то есть, не DZNep, нет фермента), добавить 50 мкл 1,6 мМ SAH, 50 мкл 1,6 мМ DTNB и 100 мкл 0,1 М Na 2 HPO 4 (рН 8,5), чтобы отдельных лунках 96-луночного, плоское дно микропланшет.
- Для контроля (т.е. не DZNep), добавить 50 мкл 1,6 мМ САК, 50 мкл 1,6 мМ DTNB, 50 мкл 0,1 М Na 2 HPO 4 (рН 8,5) и 50 мкл фермента (САК гидролазы получены из сырого экстракта) для человека скважин.
- Для DZNep лечения, добавить 50 мкл 1,6 мМ САК, 50 мкл 1,6 мМ DTNB, 50 мкл фермента и 50 мкл выбранной концентрации DZNep к отдельным скважинам. Подготовка 4 дубликатов на лечение и контроль.
- Считать оптическую плотность (ОП) образцов фермента САК при 405 нм в течение 5 мин при 20-секундными интервалами с использованием микропланшет-ридера 96-а.
- Вычтите пустой диаметром от управлятьй лечение OD получены из каждой лунки. Рассчитать процент оставшегося гидролазы деятельность SAH, используя следующее уравнение:% остаточной активности = (лечение OD / управления ОП) х 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Фиг.1 представляет собой схематическое представление анализов; оно описывает различные этапы процедуры, перечисленные в этой статье. Поскольку протокол основан на различных стадиях жизни комаров, нет Конкретная последовательность которая будет применяться для экспериментов, описанных здесь. Пользователь может выбрать, чтобы провести одну или несколько анализов, в то же время, в зависимости от доступности выборки.
Рисунок 2 демонстрирует пластины, расположенные на незрелых развития комаров и наследования анализов. Количество тестовых концентраций и повторов могут быть изменены в зависимости от требований пользователя и доступность лекарств. Для незрелых комаров анализа, 1 мМ исходный раствор DZNep добавляли к воде, содержащей комаров, чтобы достичь конечной концентрации 0,5 мкМ и 5 мкМ вместе с контрольной сковороде с скважин, содержащих наркоманию среди населения. Эксперимент показал, что более личинок и куколок Survived в контрольных лунках, чем в DZNep-обработанных скважин.
На рисунке 3 показана эффект DZNep на общую выживаемости малярийных комаров во время эксперимента. Результаты показывают, что эпигенетическое DZNep препарат подавляет рост и развитие и индуцирует смертность незрелых комаров. Большинство комаров воздействию 0,5 мкМ умер 10-й день эксперимента, тогда как большое количество лиц, подверженных 5 мкМ погибли в день 8. В противоположность этому, смертность от комаров в лечении управления (без лекарственного средства) оставалась без изменений, а некоторые превратились в взрослых на 8-й день эксперимента. Обратная зависимость наблюдалась между концентрацией наркотиков и размера комаров тела (рисунок 4).
Рисунок 5 иллюстрирует влияние DZNep на комаров плодовитости. Взрослые самки комаров питаются кровью, содержащей DZNep наблюдалось значительное Reductioп числа жизнеспособных яиц. 5А показывает яйца, полученные из контрольной клетке (не лекарства). 5В показана яйца, полученные из испытательной клетке. Большое количество яиц, полученных от каждой клетке были темнее и не хватало точности (заполненные воздухом расширения exochorion) по сравнению с яйцами, полученных от нормальных кровеносных кормили самок комаров (рисунок 6). Отсутствие поплавков наряду с более темными цветными яйцами указывает на потенциальную роль эпигенетических в формировании exochorion.
Фиг.7 демонстрирует эффект DZNep на активной гидролазы SAH у взрослых самцов и самок москитов малярии. DZNep-зависимых снижение оптической плотности наблюдается для каждого лекарственного лечения по сравнению с контрольной обработки (без лекарственного средства), указывающее, что ингибирует DZNep активной гидролазы SAH.
Рисунок 1:. Схематическое изображение анализа с использованием эпигенетическую препарата на малярийных комаров левая часть схемы показывает развитие и выживаемости анализов с использованием незрелых комаров. Центральная часть демонстрирует плодотворность анализа с помощью питающимися кровью препарат для взрослых женщин. Правая часть изображает биохимический анализ ферментной торможения на наркотики.
Рисунок 2: Плита с изображением незрелой развития комаров и дожития анализа метка "C" контрольных марок скважин.. Этикетка "0,5" показывает скважин с 0,5 мкМ DZNep. Этикетка "5" означает, скважин с 5 мкМ DZNep.
Рисунок 3: Влияние DZNep на выживаемости малярийных комаров. Концентрация зависит от смертности наблюдается с незрелых комаров.
Рисунок 4:... Влияние DZNep на развитие незрелых комаров () личинки из контрольной обработки (размер = 5 мм) (B) Личинка обрабатывали 0,5 мкМ DZNep (размер = 4 мм) (C) Личинка обрабатывают 5 мкМ DZNep (размер = 3 мм). Все личинки были измерены в тот же день эксперимента.
Рисунок 5:. Влияние DZNep на комаров плодовитость яйцо блюдо из контрольной обработки (без наркотиков) комары не содержит гораздо большее количество яиц () комкрасный с яйцо блюдо самок, получавших 5 мкм DZNep (B).
Рисунок 6: Влияние DZNep на структуре яиц в малярии комаров видно под микроскопом. (A) Яйца из контрольной обработки (без лекарства) комары не проявляют поплавки и розетки, как Ассамблей. (B) яйца из комаров, обработанных 5 мкМ DZNep хватает поплавки и розетки, как собрания.
Рис. 7: САК гидролазы ингибирование DZNep в малярии комаров DZNep вызывает уменьшение оптической плотности по сравнению с контрольной обработки (без лекарственного средства).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть несколько шагов, жизненно важное значение для успешного применения этого протокола. Для личинок анализа, следует проявлять осторожность, чтобы правильно маркировать и повторить каждую концентрацию тест. Randomizing образцов и добавления Определенное количество препарата соответствующих испытаний скважин важной частью этого экспериментальной установки. Перед добавлением 2-й возрастной стадии личинок комаров в микропланшете 96-а, каждый личинка можно поставить на бумажное полотенце на 2-3 сек, чтобы удалить лишнюю воду. Чтобы предотвратить высыхание, личинки должны быть немедленно переведены в лунки микропланшета с использованием тупой пару щипцов. Это гарантирует, объем воды в каждой лунки микропланшета, и концентрация лекарственного средства остается по назначению. При передаче личинок для измерения их длины тела, рекомендуется поставить личинок на льду в течение нескольких минут для того, чтобы держать их в неподвижном состоянии. При адаптации этого протокола для другого соединения, следует соблюдать осторожность, чтобы определить количество исходного раствора добавили в каждуюхорошо. В таких случаях, было бы лучше, чтобы растворить расчетное количество соединения в воде непосредственно перед добавлением личинок в каждой лунки микропланшета.
Для питания кровью анализов, жизненно важно, что комары голодали соответствующим путем удаления воды сахара, по крайней мере 2 ч до эксперимента. Невыполнение этого требования может привести к неполному кормления и мало влияет на взрослых женщин производства яиц. Тщательное смешивание и равномерное распределение препарата в крови является важным шагом, а также, как DZNep занимает несколько минут, чтобы раствориться. Если препарат обработанной крови сразу подается, DZNep не получить равномерно распределены в системе комаров. Настоятельно рекомендуется, чтобы defibrillated крови свежий (то есть меньше чем через неделю после даты извлечения) для лучших результатов.
Есть несколько шагов, решающее значение для успеха биохимического анализа с соединением интерес. Концентрации каждого раствора, используемые в данном прото кол были оптимизированы для DZNep. Для адаптации протокола для другого соединения, мы предлагаем тестирование спектр различных значениях рН, САК, концентрации DTNB и насекомых размер выборки, чтобы определить наиболее надежные результаты. Получение неочищенного экстракта фермента является наиболее трудоемким этапом этой процедуры. В ходе подготовки гомогената рекомендуется использовать не более 10 взрослых комаров, как липидов, присутствующих в супернатанте, может помешать считывание оптической плотности. Чтобы избежать этой проблемы, верхний слой липидов в надосадочной жидкости (с помощью одного микропипетку канала) могут быть удалены после стадии 3.8. Супернатант должны быть переданы в чистой пробирке. Шаг 3.8 должен быть повторен, чтобы отменить все оставшиеся вязких липиды. Остальные прозрачный супернатант должны быть объединены со всех труб и осторожно перемешивают. Многоканальный пипеткой может быть использован для повышения эффективности добавления SAH в лунках. DTNB используется в качестве индикатора в анализе, и должны быть получены в прошлом, и держали на льду.
NT "> Этот протокол предоставляет пользователю простые шаги, чтобы проверить влияние соединения на разных стадиях жизненного цикла комаров. Тем не менее, существуют некоторые ограничения на использование этого протокола. Этот метод в основном зависит от растворимости в воде DZNep. Незрелые Личинки воздействию препарата, растворенного в окружающих их средах. Если соединение проходит проверку нерастворим в водной среде, он может оказать этот протокол менее эффективным. Для тестирования плодовитость, мы подвергли взрослых самок на лекарственное средство, растворенное в defibrillated овечьей крови. This не было бы возможным, если лаборатория поднимает комаров колонии на крови млекопитающих непосредственно (то есть, использует мышей или морских свинок для кормления комаров).Сочетание различных анализов, описанных в этой статье, предоставляет пользователю новый способ тестирования эффекты водорастворимого соединения на насекомых. DZNep в основном добавлен в клеточных линиях в пробирке для исследования рака; Однако, этот протокол позволяет USer рассматривать любые воздействия на различных стадиях жизненного цикла насекомого в естественных условиях. Кроме того, он также предоставляет исследователю шаг за шагом руководящих принципов для токсикологических анализов. В современной литературе, знания ограничены в отношении последствий эпигенетических лекарственных препаратов на насекомых. Использование DZNep в качестве примера, мы предоставляем процедуру, которая может быть использована в качестве предварительного условия шагом на пути к изучению других эпигенетических наркотиков или новых соединений в качестве потенциальных агентов для борьбы с насекомыми. Хотя этот протокол разработан для малярийного комара, она может быть приспособлена, чтобы проверить эффект DZNep или любой водорастворимый интерес соединения, в других комаров или насекомых видам.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well microplate | Fisher Scientific | 12565561 | |
| Cell culture plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Centrifuge | Sorvall Fresco | 76003758 | A different centrifuge can be used |
| Colored tape rolls | Fisher | S68134 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ | |
| DTNB | Sigma Aldrich | D8130 | |
| DZNep.HCl | Sigma Aldrich | SMLO305 | |
| Egg dish cups | |||
| Filter papers | Fisher | 09-795E | |
| Glass feeders | Virginia Tech | ||
| Glass tissue homogenizer | |||
| Heating element | Fisher Scientific | NC0520091 | |
| Incubator | Percival scientific | I36VLC8 | A different incubator can be used |
| Microcentrifuge tube, 2 ml | Axygen | 22-283 | |
| Microcentrifuge tube, 1.5 ml | Axygen | MCT-150-C | |
| Micropipette | Eppendorf | 4910 000.069 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | M-3154 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | M-8643 | |
| pH meter | Mettler Toledo 7easy | S20 | |
| Plate reader | Spectramax | M2 | |
| SAH | Sigma Aldrich | A9384 | store at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
References
- CDC Report. , Available from: http://www.cdc.gov/malaria (2010).
- Gatton, M. L., et al. The importance of mosquito behavioural adaptations to malaria control in Africa. Evolution; International Journal of Organic Evolution. 67, 1218-1230 (2013).
- Sternberg, E. D., Thomas, M. B. Local adaptation to temperature and the implications for vector-borne diseases. Trends in Parasitology. , (2014).
- Rocca, K. A., Gray, E. M., Costantini, C., Besansky, N. J. 2La chromosomal inversion enhances thermal tolerance of Anopheles gambiae larvae. Malaria Journal. 8, 147 (2009).
- Coluzzi, M., Sabatini, A., Petrarca, V., Di Deco, M. A. Chromosomal differentiation and adaptation to human environments in the Anopheles gambiae complex. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73, 483-497 (1979).
- Donepudi, S., Mattison, R. J., Kihslinger, J. E., Godley, L. A. Update on Cancer Therapeutics. Science Direct. 2 (4), 157-206 (2007).
- Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nature Reviews. Genetics. 13, 343-357 (2012).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
- Clough, E., Tedeschi, T., Hazelrigg, T. Epigenetic regulation of oogenesis and germ stem cell maintenance by the Drosophila histone methyltransferase Eggless/dSetDB1. Developmental Biology. 388, 181-191 (2014).
- Conrad, T., Akhtar, A. Dosage compensation in Drosophila melanogaster: epigenetic fine-tuning of chromosome-wide transcription. Nature Reviews. Genetics. 13, 123-134 (2011).
- Miranda, T. B., et al. DZNep is a global histone methylation inhibitor that reactivates developmental genes not silenced by DNA methylation. Molecular Cancer Therapeutics. 8, 1579-1588 (2009).
- Cui, B., et al. PRIMA-1, a Mutant p53 Reactivator, Restores the Sensitivity of TP53 Mutant-type Thyroid Cancer Cells to the Histone Methylation Inhibitor 3-Deazaneplanocin A (DZNep). J. Clin. Endocrinol. Metab. 99 (11), E962 (2014).
- Fujiwara, T., et al. 3-Deazaneplanocin A (DZNep), an inhibitor of S-adenosyl-methionine-dependent methyltransferase, promotes erythroid differentiation. The Journal of Biological Chemistry. , (2014).
- Li, Z., et al. The polycomb group protein EZH2 is a novel therapeutic target in tongue cancer. Oncotarget. 4, 2532-2549 (2013).
- Nakagawa, S., et al. Epigenetic therapy with the histone methyltransferase EZH2 inhibitor 3-deazaneplanocin A inhibits the growth of cholangiocarcinoma cells. Oncology Reports. 31, 983-988 (2014).
- Crea, F., et al. Pharmacologic disruption of Polycomb Repressive Complex 2 inhibits tumorigenicity and tumor progression in prostate cancer. Molecular Cancer. 10, 40 (2011).
- Vella, S., et al. EZH2 down-regulation exacerbates lipid accumulation and inflammation in in vitro and in vivo NAFLD. International Journal of Molecular Sciences. 14, 24154-24168 (2013).
- Tan, J., et al. Pharmacologic disruption of Polycomb-repressive complex 2-mediated gene repression selectively induces apoptosis in cancer cells. Genes & Development. 21, 1050-1063 (2007).
- Chiang, P. K., Cantoni, G. L. Perturbation of biochemical transmethylations by 3-deazaadenosine in vivo. Biochemical Pharmacology. 28, 1897-1902 (1979).
- Lu, Y. X., Denlinger, D. L., Xu, W. H. Polycomb repressive complex 2 (PRC2) protein ESC regulates insect developmental timing by mediating H3K27me3 and activating prothoracicotropic hormone gene expression. The Journal of Biological Chemistry. 288, 23554-23564 (2013).
