Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Methoden om subcellulaire compartimenten van Muscle beoordelen Published: November 13, 2014 doi: 10.3791/52043
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1MRC/ARUK Centre for Musculoskeletal Ageing Research, University of Nottingham

Summary

Skeletspieren is essentieel voor de motoriek en is het lichaam 'belangrijkste eiwit store. Muscle gezondheid metingen binnen C. elegans beschreven. Prospectieve veranderingen in de spier structuur en functie worden beoordeeld met behulp van gelokaliseerde GFP en kationische kleurstoffen.

Abstract

Muscle is een dynamisch weefsel dat reageert op veranderingen in voeding, beweging, en ziektestadium. Het verlies van spiermassa en functie met de ziekte en leeftijd zijn belangrijke volksgezondheid lasten. Wij begrijpen dit moment weinig over de genetische regulatie van spieren gezondheid met ziekte of leeftijd. De nematode C. elegans is een gevestigd model voor het begrijpen van de genomische regulatie van biologische processen van belang. Lichaamswand spieren deze worm vertonen een grote mate van homologie met de spieren van hogere metazoan species. Aangezien C. elegans is transparant organisme, de lokalisatie van GFP voor mitochondria en sarcomeren maakt visualisatie van deze structuren in vivo. Evenzo voederen dieren kationische kleurstoffen, die zich ophopen op het bestaan ​​van een mitochondriale membraanpotentiaal, worden nagegaan of mitochondriale functie in vivo. Deze methoden, alsmede de evaluatie van spiereiwit homeostasis, gecombineerd met de beoordeling van hele dieren spierfunctie, in de vorm van beweging assays, de correlatie van subcellulaire vertonen functionele maatregelen spier prestatie mogelijk. Aldus C. elegans een krachtig platform waarmee het effect van mutaties, gen knockdown en / of chemische verbindingen op spier- structuur en functie te beoordelen. Ten slotte GFP, kationische kleurstoffen en beweging assays geëvalueerd non-invasief kunnen prospectieve studies spier structuur en functie over de gehele levensloop worden uitgevoerd en dit thans niet gemakkelijk worden onderzocht in vivo in een ander organisme.

Introduction

Muscle is een multifunctioneel weefsel, goed gewaardeerd voor haar rol in de motoriek, lichaamshouding ondersteuning en metabolisme. De ontwikkeling en het onderhoud van gezonde spier vraagt ​​coördinatie van meerdere cellulaire processen en componenten. Hetzij door schade of ziekte, kan ontregeling optreden, wat resulteert in gewijzigde spier structuur en / of functie. Leeftijdgebonden afname van de spierfunctie presenteert een aanzienlijke last voor het budget voor gezondheidszorg in de westerse wereld, omdat spiermassa 1,2 en in het bijzonder de spierkracht en uithoudingsvermogen 3-5 negatief gecorreleerd zijn met sterfte. De meting van de aspecten in verband met verslechterde spierfunctie zoals veranderde mitochondriale functie of sarcomeer verstoring, kan meer inzicht in de mechanismen die ten grondslag liggen aan de algemene ontwikkeling en de gezondheid van de spieren toe.

C aenorhabditis elegans (C. elegans) is een microscopisch nematode best bekend omdat het de eerste meercellige organisme dat zijn gehele genoom gesequenced 6, eerste genen tot zwijgen met RNAi 7 hebben, en de enige metazoan haar gehele cellijn 8 en 9 neuroanatomy bepaald. C. elegans werd eerst voorgesteld hebben een model voor de studie van de genetische controle van het gedrag in 1974 door Sydney Brenner 10 en het belang van deze en latere werk werd bekroond met de eerste van drie Nobelprijzen uitgereikt aan C. elegans onderzoekers. Ongeveer 35% van C. elegans genen orthologen bij mensen geïdentificeerd, met C. elegans als voornaamste organisme gebruikt om de genetische controle van spierontwikkeling 11 begrijpen. Bijna elk gen in de C. elegans genoom kan omlaag door RNAi 7,12 worden gevloerd. Dus, door het neerhalen genen in volledig ontwikkelde spieren, genetische componenten die bijdragen aan de regulation gezondheid spier kan onderzocht worden met relatieve eenvoud 13.

Het gecombineerde vermogen om RNAi, mutanten, en chemische verbindingen gebruik maakt C. elegans een eersteklas systeem voor het verkennen van de genetische regulatie 7,14,15 van de spier structuur en functie met de leeftijd 16 en bij de ziekte van modellen 17. De invloed van gen knockdown, mutatie, en / of blootstelling aan chemische verbindingen bij spier- structuur en / of functie kan worden gemeten via meerdere aspecten. Beschrijven wij kort eenvoudige technieken voor het vaststellen C. elegans spier structuur en functie, waarvan vele worden toegepast bij prospectieve studies van spieren gezondheid.

De ontwikkeling van groen fluorescerend eiwit (GFP) 18 heeft visualisatie van zowel de plaats van specifieke eiwitten en de algemene structuur van organellen in C. elegans mogelijk. Hier leggen we uit hoe GFP uitgedrukt specifiek in het lichaam muur spier mitochondriën, kan kernen, of sarcomeres worden gebruikt om te bepalen of dystrofie van deze sub-cellulaire structuren aanwezig is. Aangezien structuur niet altijd betrouwbaar surrogaat voor functie ook verklaren hoe het gebruik van kationische kleurstoffen in vivo kan een oordeel verminderde mitochondriale membraanpotentiaal in spier. Wanneer de kleurstoffen worden gebruikt in combinatie met GFP maken zij de studie van architectuur en functie in een tijdelijke wijze gedurende de levensduur. Tenslotte ook verklaren hoe homeostase eiwitten in spieren mogelijk is en hoe al deze maatregelen kunnen worden gebruikt om wijzigingen in gehele diergezondheid spier correleren door gebruik van beweging assays. Deze technieken, gecombineerd met gen knockdown, mutaties en / of chemische verbindingen een krachtig arsenaal voor het bestuderen hoe specifieke genen of verbindingen beïnvloeden gezondheid spier in vivo. De parallellen in de structuur, het metabolisme en de bruto-functie van de spieren tussen C. elegans enzoogdieren betekenen C. elegans is een uitstekend modelorganisme voor het begrip van de regulatie van de spier in hogere organismen, inclusief de mens.

Protocol

1. Stammen, Cultuur en Microscopie

  1. Bedienen en te onderhouden stammen van C. elegans zoals eerder beschreven 19. Stammen zijn verkrijgbaar bij de Caenorhabditis Genetics Center (CGC).
    OPMERKING: De stammen die bij deze experimenten CB5600 (ccIs4251 (Pmyo-3 :: Ngfp-lacZ, Pmyo-3 :: Mtgfp) I; hem-8 (e1489 IV)) met GFP fusie-eiwitten gelokaliseerd mitochondriën en kernen; PJ727 (jls01 (myo-3 :: GFP, rol-6 (su1006)); unc-54 :: lacZ V) met GFP fusie-eiwitten gelokaliseerd in het contractiele apparaat en PD55 (ccIs55 (sup-7 (ST5); Unc- 54 :: lacZ) V) met β-galactosidase-fusie-eiwitten gelokaliseerd in het cytosol.
  2. Volledige RNAi experimenten als eerder beschreven voor multigenerational RNAi experimenten 13 en verkrijgen RNAi bacteriën uit de sequentie geverifieerd ORF-RNAi bibliotheek geconstrueerd door Marc Vidal et al. 12.
  3. Construct stammen bevattende <em> CCIS 4251, jls01 of CCI 55 met standaard technieken 20. Gebruik deze transgenen om een ​​stam te creëren om mitochondriale structuur van het netwerk, myosine organisatie of de toestand van proteostasis beoordelen, respectievelijk. Steek de stammen in een mutant waar te kijken naar een van deze sub-cellulaire compartimenten in elk dier is gewenst.
  4. Gebruik de Ptdlns-3-kinase remmer, LY-294002 (LY) zoals eerder beschreven 21. Kort toevoegen LY-294002 bij een eindconcentratie van 160 uM bovenop droge OP50 geplaatste NGM platen.
  5. Leg alle afbeeldingen te gebruiken GFP filter voor GFP gebaseerde experimenten en een microscoop met een triple-doorlaatfilter die beeldvorming van rode, groene en blauwe kanalen zorgt tegelijkertijd voor de beoordeling in vivo membraanpotentiaal met C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, gewoonlijk verkocht als Mitotracker Red CMXRos. Gedrag beeldanalyse en figuur voorbereiding in software voor beeldverwerking.

  1. Een minimum van 1 dag voor nodig, zorg M9 buffer - 22.04 mM KH 2 PO 4, 42,27 mM Na 2 HPO 4, 85,56 mM NaCl (uiteindelijke concentraties), en steriliseer in de autoclaaf. Eenmaal afgekoeld tot 45 ° C, voeg steriel MgSO 4-1 mM na autoclaveren neerslag 22 voorkomen. Laat de M9 afkoelen bij 4 ° C en aliquot in 50 ml buizen.
  2. Op de dag van het experiment, voeg 3 ml M9 buffer een 9 cm plaat met grote aantallen L1 larven. Was de plaat meerdere malen door het opzuigen van de M9 vloeistof en pipetteren tegen het oppervlak van de agar met de plaat in handen in een hoek.
  3. Was de L1's van de plaat en breng de M9 naar een 10 ml buis met behulp van een pipet.
  4. Laat gedurende 2,5 min om de grotere volwassene en later larvale stadium dieren naar de bodem van de reageerbuis vallen en de kleinere L1 dieren blijven bij de top de M9 buffer.
  5. Verwijder de top 500 ul van M9 in de reageerbuis met een pipet. Pipet dan de M9 met L1 larven naar een nieuwe NGM plaat bezaaid met 500 pi OP50 onder een dissectie scope.
  6. Typisch, gericht op overdracht van ~ 200-300 L1 larven per plaat. Monitor platen dagelijks van volwassenheid en, indien nodig, pak dieren op om verse OP50 NGM platen om te voorkomen OP50 voedselbron wordt verbruikt.
    Opmerking: Dit is meestal 1-3 druppels M9 via een P1000 pipet, hoewel dit varieert sterk afhankelijk van het aantal L1 op de oorspronkelijke plaat.
  7. Als prospectieve studies bij individuele dieren gewenst zijn, zodra de dieren volwassen zijn, pick individuele dieren te gezaaide NGM platen te scheiden. Transfer dieren iedere 24-48 uur te scheiden van larvale dieren.

3. Beweging Testen 19

  1. Een minimum van 2 uur vóór de aanvang van het experimenteren, verwijderen van een 50 ml aliquot van M9 om de temperatuur tot kamertemperatuurerature.
  2. Sla een volwassen dier in 50 ul M9 buffer op een objectglaasje.
  3. Tel het aantal links en rechts lichaam bochten in 10 sec, waarbij een naar links en één rechts bocht is gelijk aan een slag.
  4. Herhaal de telling van lichaam slagen tot een totaal van ten minste 5 metingen waaruit een gemiddelde worden genomen geven. Vermenigvuldig deze cijfers door zes tot de beweging tarief per minuut geven.
  5. Met behulp van een pipet het dier terug naar de petrischaal. Deze methode maakt het mogelijk tijdelijke meting van beweging gedurende de gehele levensduur in C. ele s.

Figuur 1
Figuur 1: Beweging assays. Zodra wormen opgepikt in buffer worden een linkse (A) en één rechts (B) bend opgeteld bij een volledige beweging geven(Beroerte).

4. Imaging van mitochondriale Networks en sarcomeren in Body Muur Muscle

  1. OPMERKING: Hetzelfde protocol geldt voor de beeldvorming van zowel de mitochondriën en sarcomeres.
  2. Synchroniseer wormen zoals eerder beschreven (paragraaf 1) en te groeien voor 48-60 uur bij 20 ° C, als ze jonge volwassenheid zal bereiken.
  3. Pick 20 wormen (vertegenwoordiger van de plaat) van de platen in 20 ul M9 op een microscoopglaasje.
  4. Breng een dekglas en ga op de foto met behulp van een fluorescentiemicroscoop onder een GFP filter (460-500 nm, blauw licht excitatie) bij een vergroting van 40x.

5. Het beoordelen Membraanpotentiaal met behulp van een in vivo accumulatie assay met Mitotracker Red CMXRos (C 32 H 32 Cl 2 N 2 O)

  1. Synchroniseren CB5600 (deel 1), alle gelabeld met GFP in de mitochondriën van spieren en groeien vroege volwassenheid op NGM met OP50 gedurende 48-60 uur bij 20 ° C.
  2. Voeg 100 ul DMSO tot de 50 ug aliquot van C 32 H 32 Cl 2 N 2 O om een stamoplossing van 940,692 uM maken.
  3. Neem 1 ui van de 940,692 uM stockoplossing en resuspendeer in 199 ul M9 om een ​​werkende oplossing van 4,70 micrometer (4,70346 uM) te creëren. Bereid deze in bruin 1,5 ml buisjes, omdat C 32 H 32 Cl 2 N 2 O is lichtgevoelig.
  4. Bereid 20 pi fracties van de 4.70 uM werkende oplossing (20 volwassen wormen per 20 pi aliquot).
  5. Pick 20 volwassen dieren in 20 pi van 4,70 uM C 32 H 32 Cl 2 N 2 O in de bruine 1,5 ml buisjes. Incubeer bij 20 ° C gedurende 1 uur.
  6. Na de 1 uur incubatie, voeg 1 ml M9 tot het bruin 1,5 ml buisjes met de wormen, centrifuge bij 2000 xg gedurende 10 sec en schenk de bovenstaande vloeistof. Herhaal deze wasstap voordat resuspenderen de worm pellet en het overdragen van de resterende 20 μl (met de wormen) om een ​​glijbaan voor de beeldvorming.
  7. Neem beelden van de mitochondria 40X vergroting met een drievoudige laagdoorlaatfilter dat visualisatie van zowel de rode, blauwe en groene kanalen tegelijk toelaat. Beeldvorming met behulp van de triple-pass filter toont co-lokalisatie van C 32 H 32 Cl 2 N 2 O met GFP gelokaliseerd in mitochondriën verschijnen als oranje.
  8. Nadat een beeld van de oranje mitochondria genomen foto-bleken de dieren gedurende 10 seconden met licht van golflengte 540/25 nm op maximuminstellingen alle filters verwijderd. Dit zal de rode binnen de mitochondria bleken en onthullen de mitochondriale GFP alleen om colocalization in spier mitochondriën bevestigen.

6. Beoordeling van Muscle eiwitafbraak in C. elegans

  1. Synchroniseer PD55s (of een stam die het lacZ transgen) op NGM platen bezaaid met OP50 (deel 1). Groeien tot jonge volwassenheid voor 48-60 uur bij 20 ° C.
  2. Pick 20 volwassen wormen in 20 ul DDH 2 O op een objectglaasje. Wees voorzichtig om te proberen en halen alleen de worm en geen bacteriën met de pick. Label de microscoop dia in potlood.
  3. Plaats in de exsiccator gedurende 30 min drogen en barsten de cuticula van de dieren. Zorgen voor een goede afdichting op de exsiccator behulp vet rond de afdichting.
  4. Controleer de verdroging is effectief onder een dissectie scope (figuur 2) geweest.
  5. Dompel het microscoopglaasje in ijskoude aceton gedurende 3,5 min daarna blijven microscoopglaasje op keukenpapier bij kamertemperatuur gedurende 15 min om de aceton op de dia verdampen. Op dit punt dooi X-gal en oxidatie buffer en laat equilibreren tot kamertemperatuur.
  6. Voeg 2 pi X-gal 100 ul buffer oxidatie en vortex voorzichtig aan tot deze homogeen is. Dit is het X-gal / oxidatie buffer master mix.
  7. Voeg 20 ul van de X-gal / oxidatie buffer master mix elke originele gebied van 20 wormen. Inspecteer onder een dissectie scope te zorgen voor de master mix volledig bedekt alle dieren volledig. Kantel de microscoop dia naar de master mix bewegen over gebieden waar de dieren niet worden gedekt.
  8. Plaats het objectglaasje in een vochtige kamer gedurende 1-2,5 uur bij 20 ° C. Afbeelding dieren wanneer een donkerblauwe kleur aanwezig in de lichaamswand spieren controledieren is. Beoordelen controle dieren onder een dissectie scope om de 15 min om te bepalen wanneer de dieren moeten worden afgebeeld.

Figuur 2
Figuur 2: Beoordeling van de spier afbraak van eiwitten met behulp van β-galactosidase assays. (A) Dieren die een lacZ transgen worden vanaf de petrischalen 20 pl DDH 2 O op een microscopie schuif (B). Dieren zijn verdroogde en word gebroken (D). Zodra aceton verdampt het X-gal / oxidatie buffer master mix wordt toegevoegd (E). De ontwikkeling van blauwe kleur in controledieren wordt gesteld op 15 min intervallen (FL) vanaf t = 0 min (F) tot een donkerblauwe kleur wordt verkregen over de lengte van de dieren (L). Afbeeldingen van wormen worden genomen op 2.5x vergroting in AE en 8X in FL. Zoomt in C, D, F, G en L zijn 4x de oorspronkelijke vergroting.

Representative Results

Beweging Testen om Movement Gebreken Kwantificeren

Beweging daling is een goede voorspeller van de mortaliteit in C. elegans 16, met verlaagde percentages aangegeven problemen de neuromusculaire systeem. Veranderingen in beweging, zoals beoordeeld door beweging assays, kan resulteren RNAi van een specifiek gen of medicatie (figuren 3-5) of mutante dieren 13, 23. Een daling in beweging kan ontstaan ​​door veranderde ontwikkeling omdat bijvoorbeeld ontwikkelings- uitschakeling van genen die coderen voor elektronentransport complex I, III, IV of V 24. Daarnaast kunnen specifieke maatregelen worden getest alleen volwassen C. elegans om het effect op postontwikkelingsonderzoek fysiologie onderzoeken. Bijvoorbeeld, dieren behandeld met RNAi tegen unc-112, die codeert voor de C. elegans ortholoog van Kindlin-1 die is gelokaliseerd integrine bevattendspieraanhechting complexen (figuren 3 en 4) of gas-1, dat een onderdeel van complex I van de elektron transport keten (figuur 4) codeert, vertonen een geleidelijke vermindering van beweging versus controle 48-72 uur na volwassenheid. Dit kan wijzen op problemen met spierfysiologie zijn. Ook een verlies van beweging van 24 - 72 uur wordt waargenomen in respons op de behandeling van normaal ontwikkeld volwassenen met behandeling met de PI3K remmer LY-294002 (Figuur 5). Het is ook mogelijk het effect van een tweede RNAi behandeling, mutatie, of een geneesmiddel voor het herstel beweging in dieren met verminderde beweging in reactie op een eerste optreden testen. Bijvoorbeeld, Unc- 112 mutanten vertonen een meetbare vermindering van beweging ten opzichte van wildtype dieren die wordt verzwakt in aanwezigheid van een tweede mutatie in dim-1 13. Daarom kan de beweging assays beide interventies die neuromuscu veranderen identificerenlar ontwikkeling en / of functie als degenen die verbeteren en / of te herstellen neuromusculaire functie.

Beoordeling van sarcomeer Verstoring

Na het identificeren van een beweging defect, is het vaak wenselijk om te bepalen of de oorzaak van de beweging defect kan worden verklaard door problemen binnen zenuwen, spieren, of beide. Sarcomeres zijn de multi-eiwitcomplexen in spier die zorgen voor krimp en dus krachtgeneratie en beweging. Door gebruik dieren tot expressie myosine GFP fusie-eiwitten gelokaliseerd in het contractiele apparaat, kan de mate van verstoring van myosine filamenten en sarcomeren relatief niet-invasieve en prospectief worden waargenomen bij individuele dieren door ontwikkeling en / of volwassenheid. Wildtype dieren tonen gerangschikt sarcomeren die multiple groen evenwijdige rechte lijnen binnen elke instantie wand spier (figuur 3) weergegeven. Verstoring van deze normale arrays kunnen relatief kleine met zijngetooid sarcomeres verschijnen eerder fuseren dan nog in parallel. Dit fenotype, zichtbaar unc-112 RNAi bij t = 24 uur of 48 uur (figuur 3), vergelijkbaar met Z-lijn streaming van actine bevestigingsplaatsen in zoogdierspier. Evenzo kunnen kleine delen van de arrays instorten of ze kunnen volledig verdwijnen zoals behandeling met unc-112 RNAi bij t = 48 uur en t = 72 uur (Figuur 3). De aanwezigheid van sarcomeer gebreken binnen de spier van dieren die een beweging defect weergegeven (figuur 3) voldoende rekening te houden met de beweging defect maar niet noodzakelijkerwijs uitsluiten van andere problemen spier, zenuw, en / of andere weefsels in reactie op een interventie .

Beoordeling van Mitochondriale netwerkstructuur

In aanwezigheid van een beweging defect is soms wenselijk om spieren andere beschadigingen die kunnen veroorzaken of bijdragen aan de beweging de onderzoekenfect. Mitochondriën nemen het grootste deel van de cellulaire energie en dalingen in beweging kan het gevolg zijn van een verminderde ATP bepaling, het verminderen van de energie die beschikbaar is voor het samentrekken van de spieren. Dus de structuur van mitochondriën kunnen worden onderzocht op afwijkingen. Het is belangrijk niet om dieren te verdoven met natriumazide omdat deze ertoe leidt snelle mitochondriale fragmentatie; dieren in deze experimenten werden geïmmobiliseerd door de door de dekglaasje toegepaste druk. Binnen wild-type C. elegans lichaamswand spier worden mitochondriën opgenomen in georganiseerde (figuur 4) en mitochondria er goed functionerende als reticulum 25. Verstoring van het netwerk van mitochondriën presenteert als fragmentatie van het netwerk (gas-1 RNAi, Figuur 4B) 26. Fragmentatie kan ernstig genoeg komen vast schijn van georganiseerde blijft zoals behandeling met unc-112 RNAi (Figuur 4B en C) 13. Als with storingen in sarcomeer structuur, kunnen defecten in spier mitochondriale structuur in dieren die een beweging defect weer voldoende rekening houden met de beweging defect maar dit betekent niet noodzakelijkerwijs uitsluiten van andere problemen spier, zenuw, en / of andere weefsels. Bijvoorbeeld, unc-112 mutanten 13 en behandeling met unc-112 RNAi (figuren 3 en 4) tonen zowel verstoord sarcomeren verstoorde mitochondriale structuur.

Beoordeling van de mitochondriale functie in vivo

De mitochondriale membraanpotentiaal bepaalt het vermogen van mitochondriën proton drijfkracht de mogelijkheid om mitochondriale membraanpotentiaal te evalueren in vivo maken en genereren ATP 27, dus geeft het vermogen van deze dieren om ATP te produceren. Als mitochondriale structurele storingen dan niet mitochondriale functionele capaciteit wijzigen kan desi zijnlijkbaar naar de mitochondriale functie in dieren met veranderde structuur van de mitochondriën te beoordelen. C 32 H 32 Cl 2 N 2 O accumuleert in mitochondria, alle celtypen, waarbij een membraanpotentiaal aanwezig en kleurt de mitochondria 28 (figuur 4C). Mitochondriale functie in spierweefsel te beoordelen, kan men gebruik C 32 H 32 Cl 2 N2O en GFP gemerkte mitochondriële om de effecten van interventie specifiek op mitochondriële (figuur 4C) tonen. Bijvoorbeeld, het verlies van mitochondriale membraanpotentiaal volgende behandeling met unc-112 RNAi voorkomt C 32 H 32 Cl 2 N2O betreden de matrix. De mitochondria vertonen ook weinig of geen rode kleuring van de mitochondriën naast het GFP etikettering van mitochondria (figuur 4C). Foto-bleken ook worden gebruikt om te bevestigen dat de waargenomenmitochondria name die in de spier (figuur 4C). Identificatie van een verminderde capaciteit voor het produceren ATP voldoende rekening te houden met een waargenomen beweging defect heeft maar niet binnen spier, zenuw sluiten andere problemen, en / of andere weefsels. Ongeacht, verminderd ATP productiecapaciteit wordt geassocieerd met ziekten bij mensen 29 en ouder 30 identificatie van een dergelijke storing in reactie op een interventie een platform voor het screenen op verbindingen en / of RNAi behandelingen die de ATP-productie te verbeteren en deze kan dan verder worden onderzocht voor therapeutisch potentieel.

Beoordeling van de afbraak van eiwitten

In aanwezigheid van een beweging defect en normale sarcomeren en mitochondriën is het soms wenselijk om spieren andere beschadigingen die kunnen veroorzaken of bijdragen aan de beweging defect onderzoeken. De mogelijkheid om proteïne homeostase is een handtekening van nochmal gezondheid, terwijl een verlaging van eiwitsynthese en / of een toename in eiwitafbraak is een gevolg van veroudering en 31 verschillende ziektetoestanden 32,33. Daarom kan het wenselijk zijn om de spieren van proefdieren met een beweging defect op gewijzigde proteïne homeostase. Dit kan worden bereikt door beoordeling van de niveaus van cytosolische spiereiwitten. Het gebruik van transgeen gecodeerde eiwitten kan een oordeel spierspecifieke proteostasis. Bijvoorbeeld, gebruik van dieren die β-galactosidase, gefuseerd aan een N-terminale gedeelte van myosine, dat wordt gesynthetiseerd onder de controle van een promoter en enhancer myosine maakt beoordeling van cytosolisch spier eiwitgehalte 19. De aanwezigheid van blauwe vlekken in wildtype volwassenen toont de aanwezigheid van actieve β-galactosidase en de afwezigheid van pathologische cytosolisch eiwitafbraak. Een verlies van kleuring in respons op de behandeling suggereert pathologische proteïne afbraak optreedt (figuur 5 13,14,19. Zo tonen onbehandeld wild type dieren een intense blauwe kleuring 72 uur na de volwassenheid, terwijl LY-249.002 behandelde dieren vertonen een gebrek aan kleuring (figuur 5). Zoals met defecten in sarcomeer structuur en mitochondriale functie, de aanwezigheid van pathologische spiereiwit degradatie voldoende rekening met een waargenomen beweging defect maar niet noodzakelijkerwijs uitsluiten van andere problemen spier, zenuw, en / of andere weefsels.

Figuur 3
Figuur 3: (A) unc-112 RNAi veroorzaakt een significante beweging defect op t = 72 uur (B) Beoordeling van array A-band structuur binnen het lichaam muur spier.. In wt, A-bands in de spieren worden weergegeven als een rechte lijn op de jongvolwassenheid (t = 0 uur) en blijven grotendeels uniform tot voorbij 72 uur van de volwassenheid (zie wt zoom). unc-112 RNAi zorgt ervoor dat de sarcomeres om architectuur te verliezen in kleine gebieden van de spier (t = 24 uur), ingestort en ontbrekende sarcomeres (t = 48 uur), aggregatie (t = 72 uur bovenpaneel en zoom) en verlies van lineariteit van sarcomeren (t = 72 uur onderste paneel en zoom). Schaalbalken vertegenwoordigen 25 uM en zooms zijn 2.5X.

Figuur 4
Figuur 4: (A) unc-112 of een gas-1 RNAi veroorzaakt een beweging defect (B) Beoordeling van mitochondriale structuur binnen het lichaam muur spier.. Mitochondria in de spieren verschijnen als genetwerkte rechte lijnen bij jonge volwassenheid (wt). Behandeling van dieren met unc-112 RNAi resulteert in mitochondrial fragmentatie zoals eerder waargenomen tussen 24 uur en 72 uur van de volwassenheid (zooms en pijl) 13. Ook RNAi tegen gas -1 resulteert in fragmentatie van de mitochondriale netwerken zoals eerder waargenomen 26. Deze zijn aanwezig als kleine gaten in het mitochondriale netwerk op t = 24 uur en de voortgang tot wijdverbreide desorganisatie bij 72 uur (zie zoom en pijl). (C) het beoordelen van de mitochondriale membraanpotentiaal in vivo. Bij dieren ook met GFP gelokaliseerd aan mitochondriën, C 32 H 32 Cl 2 N 2 O zich ophoopt in het lichaam muur spieren mitochondria en lijkt oranje onder een triple-pass filter van de jonge volwassenheid (t = 0 uur) tot 72 uur na de volwassenheid. Behandeling met unc-112 RNAi veroorzaakt een progressief verlies van membraanpotentiaal zoals getoond bij 72 uur wanneer de resterende mitochondria tonen minder ophoping van C 32 H 32 Cl 2 N2O vs. gew. Photobleaching voor 10 sec het gebruik van 540/25 nm licht bleekt het rood van de Mitotracker en onthult de GFP gelokaliseerde spier mitochondria (+ Foto bleekwater). Schaalbalken vertegenwoordigen 25 urn en zoomt in zijn 2.5X.

Figuur 5
Figuur 5: (A) De behandeling met LY-294002 dieren induceert een beweging defect (B) Beoordeling van de afbraak van eiwitten met behulp van een β-galactosidase-assay.. Leeftijd gesynchroniseerde gew L1 larven worden gekweekt tot volwassenheid bij 20 ° C (t = 0 uur) alvorens naar NGM geënt met OP50 (wt controle) of NGM geënt met LY-294002 (PI3K remmer) gedurende 24 uur bij 20 ° C . In A worden ongeveer 20-30 dieren gekleurd β-galactosidase activiteit (blauw) op t = 0 uur en na 24 uur, 48 uur en 72 uur.

Discussion

Deze methoden kan de verkenning van de spieren van de macrophysiology van beweging om het identificeren van subcellulaire gebreken die voldoende is om een ​​beweging defect veroorzaken. Toen combineerde deze methoden is het mogelijk een gedetailleerde analyse van de spier. Het inzicht verworven laat verder testen van spier-georiënteerde hypothesen die betrekking hebben op de algemene fysiologie, pathofysiologie en veroudering.

Beweging Testen

Een beweging defect duidt op een verstoring van de normale neuromusculaire functie. Dit kan specifiek zenuwen of spieren of kan gemeenschappelijk zijn tussen verschillende weefsels. Het moeilijkste fasen van de voltooiing van de beweging testen worden selecteren wormen die representatief zijn voor de bevolking en / of de behandeling zijn, en zorgen dat de onderzoeker het dier niet verwonden bij overdracht naar M9. Het is belangrijk om een ​​grote steekproef een representatieve en nauwkeurige vaststelling van de beweging te verkrijgen zijn. Bij het testen van zeer penetrant effecten, bijvoorbeeld zoals vaak gezien in mutanten, een steekproefomvang van tien dieren per getoetst beweging tienmaal voldoende om statistisch significante verschillen ten opzichte van wild-type vinden. Echter, de eenvoud van beweging assays en het gemak van het kweken van C. elegans betekenen dat honderden wormen snel kunnen worden beoordeeld om kwantitatief robuuste resultaten te garanderen. Bij testen effecten die in slechts een gedeelte van een bevolking blijken is het belangrijk te bepalen welk deel van de bevolking blijkt ook worden beïnvloed als de ernst van defecten in de getroffen dieren. In dergelijke situaties grotere aantallen dieren moeten worden beoordeeld met het oog op de minimale gegevens voor deel van de getroffen bevolking. Vaak zowel geneesmiddel als RNAi behandelingen hevige beweging defecten produceren een klein deel van de bevolking. In sommige gevallen verhogen van de dosis van de behandeling en of de wijze van levering zal het aandeel van AFF vergrotenecteerd dieren lopen dosis respons curves kan nuttig zijn om de optimale concentratie van een geneesmiddel of RNAi zijn. Een tweede beperking van deze beweging assay is dat de wormen worden gemanipuleerd om beweging te beoordelen. Dus de wormen stimuleerde en onderworpen aan enige mate van osmotische stress geplukt in vloeistof. De mate van osmotische stress kan worden beperkt door gebruik M9 of BU buffer 19 in plaats van water. Sommige van deze beperkingen worden verlicht door het meten van gewone beweging op platen met behulp van commercieel beschikbare volgsystemen 34 of gratis plug ins voor ImageJ 35. Het meten van de bewegingssnelheid van een dier kan belangrijke informatie over algemene gezondheid spier, waaronder veranderingen in functie die kan worden gemeten gedurende de levensduur en de niet-invasieve Deze methode sleutel voor toekomstige levenslange onderzoeken van spierfunctie verschaffen.

Beeldvorming van de Contractiele Apparatus

<p class = "jove_content"> De worm stam hier gebruikt om het contractiele apparaat structuur was PJ727 36 die een myosine GFP fusie-eiwit dat is gelokaliseerd aan sarcomeren in het lichaam muur spieren uitdrukt. Het gebruik van deze stam maakt visualisatie van sarcomeer structuur in levende dieren. Vergelijkbaar met de beweging bovenbeschreven bepaling een belangrijk voordeel van GFP gemerkte sarcomeren aan sarcomeer structuur beoordelen is dat de werkwijze relatief niet-invasief en kan daarom worden gebruikt om prospectief volgen sarcomeer structuur in individuele dieren gedurende de levensduur. Het grootste probleem met deze methode is dat de wormen die wordt afgebeeld nog in leven en daarom bewegen, waardoor het moeilijk doelgerichte beelden krijgen. Verschillende methoden kunnen worden gebruikt om beweging te verminderen en beeldvorming eenvoudiger; deze omvatten verlamming of verlammende werking op de wormen en immobilisatie via druk, zuiging, of het gebruik van een hoge viscositeit oplossing. Elk van deze methoden immobilizatie heeft het nadeel dat het kan zich neuromusculaire functie veranderen. Daarom is het essentieel om passend onbehandelde controles in de analyse. Het kan ook verstandig om ten minste twee onafhankelijke methoden van immobilisatie gebruiken resultaten te bevestigen zijn niet te wijten aan problemen de immobilisatie methode, afhankelijk van hoe de immobilisatie gebruikte methode gekozen voor de vraag onder studie. Hier hebben we eenvoudige druk gebruikt van het dekglaasje op de worm tot verminderde beweging veroorzaken. Na het plaatsen van het dekglaasje, zal de vloeistof onder het dekglaasje verdampen en het dekglaasje zal daardoor gaan meer druk produceren van de wormen, meestal is dit duurt 2-5 minuten voldoende verminderde beweeglijkheid produceren gemakkelijk beeldvorming mogelijk.

Het is essentieel om de wormen nauwlettend nadat het dekglaasje werd geïntroduceerd als de druk uiteindelijk stijgen genoeg om de wormen delen barsten van overdruk, gewoonlijk 10-15 minuten na coverslip toevoeging. Extra buffer kan worden ingebracht met behulp van een pipet tip rond de randen van het dekglaasje aan verbrijzelingsletsel de wormen te voorkomen. Nagellak kan worden gebruikt om de randen van het dekglaasje dichten en verdamping te voorkomen, hoewel dit voorkomt het ophalen van dieren onder dekglas, indien gewenst. Evenzo kan het gebruik van siliconen kralen in de oplossing te helpen de druk het dekglaasje plaatsen op de wormen verminderen.

Net als bij de beoordeling van een beweging defect, is het belangrijk om de penetratie van effect overwegen. Penetrantie kan hoog worden overwogen als 80-100% dieren vertonen een fenotype op de NGM plaat, gedeeltelijke of 21-79% en laag indien ≤20% van het display bevolking een invloed. Voor zeer penetrant effecten, kunnen kleinere steekproefomvang worden gebruikt om belangrijke kwantitatieve gegevens over sarcomeer defecten te produceren. Wanneer het effect een lage penetrantie, selectie van dieren met een duidelijke beweging defect weergegeven in reactie op het geneesmiddelof RNAi behandeling kan nuttig zijn bij het bepalen van sarcomeer afwijkingen bij dieren het meest beïnvloed door de behandeling. Het is echter niet noodzakelijkerwijs het geval dat de mate van behandelingseffect verplaatsing en subcellulaire structuur is hetzelfde. Aldus kan het gewenst zijn, worden de mate van afwijkingen in de grote populatie, bijvoorbeeld 100 dieren. Hierdoor begrip van de verdeling van defecten gedurende een populatie. Het kan ook wenselijk zijn om de omvang van de afwijking onderzoeken de zwaarst getroffen dieren en / of onderzoekt de correlatie tussen de mate van sarcomeer gebrek en bewegingsafstand defect. Potentiële problemen terzijde, deze methode is sneller en gemakkelijker dan andere wijze te sarcomeer structuur. Deze snelheid en het gemak is echter onderhevig aan een belangrijke beperking, sarcomeres met GFP fusie-eiwitten zijn niet helemaal normaal 37 en dus de beoordeling van de verstoorde sarcomeres moet worden bevestigd met behulp van extra meer arbeidsintensieve methoden.Deze methoden omvatten het gebruik van gepolariseerd licht 38, phalloidin kleuring 39, en indirecte immunofluorescentie 40. Van deze methoden, maar gepolariseerd licht is relatief niet-invasieve; de andere methoden vereisen fixatie en bijgevolg niet kunnen worden gebruikt in prospectieve studies van individuele dieren, liever ze kunnen alleen worden gebruikt om te bevestigen, steken doorsnede, de resultaten van deze studies.

Beeldvorming van mitochondriale Networks

De worm virusstam die bij de mitochondriale imaging experimenten was CB5600 7 die een GFP-fusie-eiwit gelokaliseerd in de mitochondriën en een GFP β-galactosidase-fusie-eiwit gelokaliseerd in de kern uitdrukt, zowel in de lichaamswand spieren. Zoals met gebruik van PJ727 voor beeldvorming sarcomeres gebruik van deze stam maakt visualisatie van mitochondriale netwerkstructuur in levende dieren. Aldus kan deze stam gebruikt worden om dynamische veranderingen die optreden beoordelen, bijvoorbeeld verminderde mitochondrial fusion en / of verhoogde mitochondriale kernsplijting 41. Ook voor beeldvorming sarcomeres de grootste problemen met deze methode is dat de wormen te beelden nog in leven en bewegen, waardoor het moeilijk doelgerichte beelden krijgen. Hoewel verschillende werkwijzen, zoals hieronder in meer detail beschreven, kunnen worden gebruikt om beweging te verminderen, mitochondria blijken bijzonder gevoelig voor interventies verminderde beweging veroorzaken. Bijvoorbeeld meest gebruikte anesthetica doelwitcomponenten van de mitochondriale ademhalingsketen en derhalve moet worden gebruikt bij studies van normale mitochondriale structuur en functie. Op dezelfde manier moeten de meeste verlamde agenten met voorzichtigheid worden gebruikt in studies van de normale mitochondriale structuur en functie, zoals de meeste verlamde agenten veroorzaken minder signaal via de neuromusculaire overgang en functionele denervatie van de spier door te geven is voldoende om mitochondriale fragmentatie veroorzaken. De experimenten in deze studie toegepaste druk dierlijke immobiliserens maar anderen hebben met succes gebruik levamisol 42, maar het is van essentieel belang om het dier onmiddellijk.

Tenslotte verschillende bacteriële verontreinigingen in kweken, bijvoorbeeld B. subtilis, kan mitochondriale fragmentatie induceren; Daarom is het noodzakelijk om geschikte onbehandelde controles in de analyse. Voor zeer penetrant effecten, kunnen kleinere steekproefomvang worden gebruikt om belangrijke kwantitatieve gegevens over mitochondriale netwerk defecten te produceren. Vanwege de prevalentie van kleine defecten in het mitochondriaal netwerk dit kleine aantal dieren waarschijnlijk aan tweemaal het aantal nodig voor de beoordeling van sarcomeer structuur. Wanneer het effect een lage penetrantie kan selectie dieren duidelijk weergeven van een beweging defect in reactie op geneesmiddelen of RNAi behandeling nuttig testen mitochondriale aandoeningen bij dieren zwaarst door de behandeling. Zoals hierboven vermeld, is het niet noodzakelijk zo dat deomvang van behandelingseffect verplaatsing en subcellulaire structuur is hetzelfde. Aldus kan het gewenst zijn, worden de mate van afwijkingen in de grote populatie, bijvoorbeeld 150-200 dieren, alsmede de mate van verstoring van de zwaarst aangetaste dieren en de aanwezigheid of afwezigheid van mate van verstoring met mate beweging defect. Andere stammen met fluorescent gelabelde mitochondriën kan worden gebruikt om de resultaten verkregen CB5600 bevestigen, is het gebruik van verschillende fluorescente eiwitten de basislijn netwerken van mitochondria beïnvloeden. Zo wordt het gebruik van een TOMM RFP-20 fusieproteïne mitochondriën visualiseren veroorzaken verhoogde basislijn mitochondriale fragmentatie versus het gebruik van mitochondriaal gelokaliseerd GFP 17. Terwijl andere methoden zoals immunofluorescentie en elektronenmicroscopie worden gebruikt om mitochondriale structuur bepalen, behoeven derhalve niet in vivo beoordeling van mitochondriale dynamiek mogelijk omdat fixatie stap vereisend. Andere werkwijzen zoals het gebruik van mitochondriaal gelokaliseerde kleurstoffen kunnen zonder fixatie worden gebruikt en dus kunnen worden gebruikt in plaats van gebruik van mitochondriaal gelokaliseerd GFP. Zoals besproken in de volgende sectie, gebruik van deze kleurstoffen maakt ook ruwe beoordeling van in vivo mitochondriale functie.

Het beoordelen van mitochondriale membraan Potentiële In Vivo in C. elegans

Verschillende kleurstoffen beschikbaar voor etikettering mitochondria 28. Deze kleurstoffen een alternatieve visualiseren mitochondriale netwerkstructuur in levende C. elegans. Veel van deze kleurstoffen eveneens mogelijk ruwe beoordeling van mitochondriale functie in vivo, omdat zij accumuleren in mitochondria basis van de mitochondriale membraanpotentiaal. Hier hebben we gebruikt C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, die wordt ingenomen doorhet spijsverteringskanaal, met enkele extra invoeren van de worm via de cuticula vanwege de permeabilisatie geboden door opgelost in 0,5% DMSO. Na binnenkomst in de cel C 32 H 32 Cl 2 N2O geoxideerd en afgezonderd door de mitochondriën, waar het bindt zwavelhoudende aminozuren (bijvoorbeeld methionine en cysteine). De vorming van deze kleurstof-peptidecomplexen betekent C 32 H 32 Cl 2 N 2 O blijft de mitochondria eenmaal gelabelde 28. Een belangrijk probleem bij het gebruik van mitochondriale kleurstoffen is dat ze allemaal mitochondriën zullen etiketteren in het dier. Daarom hebben we uitgevoerd etikettering CB5600, dezelfde stam hierboven beschreven voor de beoordeling spier mitochondriale netwerkstructuur. Door een rode mitochondriale kleurstof, een stam van wormen die GFP in mitochondriële en een triple pass filter, is het relatief eenvoudig om het alleen mitochondria in spieren door het vinden mitochondriën die obereik door colocalization van rode kleurstof en GFP gelabelde mitochondriën. De moeilijkste stap in het uitvoeren van deze colocalization aanpak is beeldvorming, omdat de kleurstof is foto-gebleekt binnen enkele seconden onder hoge intensiteit TL-licht. Dit effect kan worden beperkt door het houden van de fluorescentie op laag vermogen totdat de onderzoeker is klaar te en dienovereenkomstig aanpassen van de fluorescentie-intensiteit. Zodra men ervaren met het gebruik van kleurstoffen andere benadering is om confocale microscopie met Z-stapels alleen beeld mitochondria in het juiste weefsel te gebruiken; de mitochondriale netwerken spieren zijn zeer verschillend in vergelijking met andere weefsels. Helaas, het onvermogen van C 32 H 32 Cl 2 N 2 O mitochondria 28 verlaten betekent dat, in tegenstelling tot het sarcomeer en mitochondriale beeldvormingstechnieken hierboven besproken, kan het niet worden gebruikt om prospectief volgen verlies van mitochondriale functie, tenzij C 32 H 32 Cl 2 N2Otoegevoegd op discrete tijdstippen dierlijke populaties scheiden. Deze beperking kan worden overwonnen door kleurstoffen zoals JC-10 doen verlaten de mitochondriën bij uitschakeling van membraanpotentiaal 43. Mitochondriën kunnen ook worden geïsoleerd van C. elegans 30 voor verdere biochemische analyse. Dergelijke extractie maakt kwantificering van de mitochondriale membraanpotentiaal door het kwantificeren van het tarief van de lipofiele kationische kleurstof opname met behulp van flowcytometrie of een fluorescerende plaat lezer 44. Een gemeenschappelijk Europees verminderde mitochondriale membraanpotentiaal, is het ook mogelijk om te bepalen of het verlies van proton gradiënt betekent een verlies van ATP productie gebruik van een gevoelige bioluminometric-luciferase gebaseerde methode 45.

Het beoordelen van eiwitafbraak bij C. elegans

De worm stam hier gebruikt voor de beoordeling van spiereiwit degradatie was PD55, die een spier specifieke β bevatgalactosidase dat continu gesynthetiseerd tijdens de ontwikkeling tot volwassenheid bereikt welke stabiel in het cytosol blijft voor de volgende 72-96 uur 19. Zo meten van β-galactosidase niveaus tijdens de ontwikkeling voornamelijk geeft de impact van interventies op de synthese van de myosine promotor, terwijl het verlies van β-galactosidase tijdens de volwassenheid geeft een interventie heeft geleid tot toegenomen cytosole eiwitafbraak 19. De belangrijkste stap om β-galactosidase activiteit effectieve uitdroging waarborgen. Niet effectief drogen dieren resulteert in een slechte levering van het X-gal-substraat en derhalve slechte kleur in lichaam muur spieren van de dieren. Om een goede uitdroging zorgen voor de afdichting op de exsiccator moet worden gecontroleerd en wordt het monster bij 5-10 min tijden worden gecontroleerd gedurende uitdroging om de voortgang te beoordelen (dat wil zeggen, de 20 ul monster moet zijn binnen 10 min en de resterende 20 min gedroogdis uitgebreide uitdroging verzekeren). De β-galactosidase assay een activiteit assay derhalve een passend is essentieel. Daarnaast verminderde kleuring van volwassenen in een behandeling toestand ten opzichte van de controlegroep niet bewijzen dat bodemaantasting optreedt; veeleer geeft verminderde enzymatische activiteit in reactie op de behandeling. Degradatie bevestigen, moeten meer arbeidsintensieve western blot analyse voltooid tegen β-galactosidase 13 en dit maakt kwantificering eiwitafbraak bij kleine populaties getelde wormen. Western Blot band dichtheden kan worden gekwantificeerd met behulp van ImageJ 46. Een andere beperking van deze werkwijze is dat het gebruik van transgene eiwitten niet informeren over fysiologische doelen van afbraak en voor het antwoorden proteomics en / of gerichte hypothesegedreven Western blots worden gebruikt 13. Ten slotte moet de synthese van het transgene eiwit toegepast in deze studies sluit in vroege volwassenheid 19 C. elegans spier; bijvoorbeeld stabiele of radioactieve isotoop methoden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O) Invitrogen M-7512 Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential
DMSO Thermo Scientific 67-63-5
KH2PO4 Sigma 7778-77-0
Na2HPO4 BDH 301584L
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
MgSO4 Sigma M-7506
Microscopy Slides Starfrost K220
Microscopy Cover Slips VW2 International 631-0124
1.5 ml Eppendorph Tubes Fisher Scientific FB74031
Dessicator Nalgene D2672
Nikon Microscope Nikon H600L Nikon H600L microscope with proprietary software
Nikon Camera Nikon DS-Fi1 Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera 
Zeiss Microscope Zeiss Ax10 Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter
Plates 9 cm Starstedt 82-1473
Plates 6 cm Gosselin BP53-01
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich 14459-95-1 
MgCl2 Sigma-Aldrich 7786-30-3
Na3PO4 Sigma-Aldrich 7601-54-9
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside Sigma-Aldrich 7240-90-6 
N,N-dimethylformamide Sigma-Aldrich 68-12-2 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wannamethee, S. G., Shaper, A. G., Lennon, L., Whincup, P. H. Decreased muscle mass and increased central adiposity are independently related to mortality in older men. The American Journal of Clinical Nutrition. 86, 1339-1346 (2007).
  2. Marquis, K., et al. Midthigh Muscle Cross-Sectional Area Is a Better Predictor of Mortality than Body Mass Index in Patients with Chronic Obstructive Pulmonary Disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166, 809-813 (2002).
  3. Metter, E. J., Talbot, L. auraA., Schrager, M., Conwit, R. Skeletal Muscle Strength as a Predictor of All-Cause Mortality in Healthy Men. Journal of Gerontology: Biological Sciences. 57, 359-365 (2002).
  4. Hairi, N. N., et al. Loss of Muscle Strength, Mass (Sarcopenia), and Quality (Specific Force) and Its Relationship with Functional Limitation and Physical Disability: The Concord Health and Ageing in Men Project. JAGS. 58, 2055-2062 (2010).
  5. FitzGerald, S. J., et al. Muscular Fitness and All-Cause Mortality: Prospective Observations. Journal of Physical Activity and Health. 1, 7-18 (2004).
  6. Consortium, C. eS. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
  7. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854-854 (1998).
  8. Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode. Caenorhabditis elegans Dev Biol. 56, 110-156 (1977).
  9. White, J. The Anatomy. In The nematode C. elegans. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory. New York. (1988).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  11. Moerman, D. G., Williams, B. D. Sarcomere assembly in C. elegans muscle. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
  12. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).
  13. Etheridge, T., et al. Calpains Mediate Integrin Attachment Complex Maintenance of Adult Muscle in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 8, 1002471 (2012).
  14. Shephard, F., Adenle, A. A., Jacobson, L. A., Szewczyk, N. J. Identification and Functional Clustering of Genes Regulating Muscle Protein Degradation from amongst the Known C. elegans Muscle Mutants. PLoS ONE. 6, e24686 (2011).
  15. Lehmann, S., Bass, J. J., Szewczyk, N. J. Knockdown of the C. elegans Kinome identifies Kinases required for normal protein Homeostasis, Mitochondrial network structure, and Sarcomere structure in muscle. Cell Communication & Signaling. 11, (2013).
  16. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing. C. elegans. Nature. 419, 808-814 (2002).
  17. Munoz-Lobato, F., et al. Protective role of DNJ-27/ERdj5 in Caenorhabditis elegans models of human neurodegenerative diseases. Antioxid Redox Signal. 5, 5 (2013).
  18. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
  19. Zdinak, L. A., et al. Transgene-coded chimeric proteins as reporters of intracellular proteolysis: starvation-induced catabolism of a lacZ fusion protein in muscle cells of Caenorhabditis elegans. J Cell Biochem. 67, 143-153 (1997).
  20. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J Vis Exp. 18, e833 (2008).
  21. Szewczyk, N. J., Peterson, B. K., Barmada, S. J., Parkinson, L. P., Jacobson, L. A. Opposed growth factor signals control protein degradation in muscles of Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 26, 935-943 (2007).
  22. Stiernagle, T. The C. elegans Research Community, WormBook. , 1551-8507 (2006).
  23. Gaud, A., et al. Prednisone reduces muscle degeneration in dystrophin-deficient Caenorhabditis elegans. Neuromuscular Disorders. 14, 365-370 (2004).
  24. Dillin, A., et al. Rates of Behavior and Aging Specified by Mitochondrial Function During Development. Science. 298, 2398-2401 (2002).
  25. Bakeeva, L., Chentsov, Y., Skulachev, V. Mitochondrial framework (reticulum mitochondriale) in rat diaphragm muscle. Biochimica et Biophysica Acta. 501, 349-369 (1978).
  26. Ichishita, R., et al. An RNAi screen for mitochondrial proteins required to maintain the morphology of the organelle in Caenorhabditis elegans. J Biochem. 143, 449-454 (2008).
  27. Mitchell, P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. Nature. 191, 144-148 (1961).
  28. Chazotte, B. Labeling mitochondria with MitoTracker dyes. Cold Spring Harb Protoc. 1, 990-992 (2011).
  29. Seo, A. Y., et al. New insights into the role of mitochondria in aging: mitochondrial dynamics and more. J Cell Sci. 123, 2533-2542 (2010).
  30. Brys, K., Castelein, N., Matthijssens, F., Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. Disruption of insulin signalling preserves bioenergetic competence of mitochondria in ageing Caenorhabditis elegans. BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).
  31. Dorrens, J., Rennie, M. J. Effects of ageing and human whole body and muscle protein turnover. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 13, 26-33 (2003).
  32. Rennie, M. J., et al. Depressed protein synthesis is the dominant characteristic of muscle wasting and cachexia. Clinical Physiology. 3, 387-398 (1983).
  33. Mitch, W. E., Goldberg, A. L. Mechanisms of muscle wasting. The role of the ubiquitin-proteasome pathway. N Engl J Med. 335, 1897-1905 (1996).
  34. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C. The C. elegans Research Community, WormBook. , 1551-8507 (2012).
  35. Kawano, T., et al. An imbalancing act: gap junctions reduce the backward motor circuit activity to bias C. elegans for forward locomotion. Neuron. 72, 572-586 (2011).
  36. Fostel, J. L., Benner Coste, L., Jacobson, L. A. Degradation of transgene-coded and endogenous proteins in the muscles of Caenorhabditis elegans. Biochemical and Biophysical Research Communications. 312, 173-177 (2003).
  37. Meissner, B., et al. An integrated strategy to study muscle development and myofilament structure in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 5, (2009).
  38. Rogalski, T. M., Gilbert, M. M., Devenport, D., Norman, K. R., Moerman, D. G. DIM-1, a novel immunoglobulin superfamily protein in Caenorhabditis elegans, is necessary for maintaining bodywall muscle integrity. Genetics. 163, 905-915 (2003).
  39. Gieseler, K., Grisoni, K., Segalat, L. Genetic suppression of phenotypes arising from mutations in dystrophin-related genes in Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1092-1097 (2000).
  40. Wilson, K. J., Qadota, H., Benian, G. M. Immunofluorescent localization of proteins in Caenorhabditis elegans muscle. Methods Mol Biol. 798, 171-181 (2012).
  41. Chan, D. C. Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 79-99 (2006).
  42. Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model. Cell Death Dis. 9, 513 (2014).
  43. Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50, 98-115 (2011).
  44. Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76, 469-477 (1999).
  45. Wibom, R., Hagenfeldt, L., von Döbeln, U. Measurement of ATP production and respiratory chain enzyme activities in mitochondria isolated from small muscle biopsy samples. Analytical Biochemistry. 311, 139-151 (2002).
  46. Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry. Electrophoresis. 30, 1845-1855 (2009).

Tags

Developmental Biology Fysiologie, Spier mitochondria sarcomeres veroudering
Methoden om subcellulaire compartimenten van Muscle beoordelen<em&gt; C. elegans</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gaffney, C. J., Bass, J. J.,… More

Gaffney, C. J., Bass, J. J., Barratt, T. F., Szewczyk, N. J. Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans. J. Vis. Exp. (93), e52043, doi:10.3791/52043 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter