Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Metoder for å vurdere subcellulære avdelinger av muskel i Published: November 13, 2014 doi: 10.3791/52043
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1MRC/ARUK Centre for Musculoskeletal Ageing Research, University of Nottingham

Summary

Skjelettmuskulatur er viktig for locomotion og er likene 'viktigste protein butikken. Muskelhygieniske målinger innenfor C. elegans er beskrevet. Potensielle endringer i muskelstruktur og funksjon er vurdert ved hjelp lokalisert GFP og kationiske fargestoffer.

Abstract

Muskel er et dynamisk vev som reagerer på endringer i ernæring, mosjon, og sykdomstilstanden. Tap av muskelmasse og funksjon med sykdom og alder er viktige folkehelse byrder. Vi har for tiden forstår lite om genetisk regulering av muskel helse med sykdom eller alder. Den nematode C. elegans er en etablert modell for forståelse av den genomiske regulering av biologiske prosesser av interesse. Denne ormen kropp veggen muskler vise en stor grad av homologi med musklene i høyere metazo arter. Siden C. elegans er en transparent organisme, tillater lokalisering av GFP til mitokondrier og sarcomeres visualisering av disse strukturene in vivo. På samme måte, foring av dyr kationiske fargestoffer, som akkumuleres basert på eksistensen av en mitokondriell membranpotensialet, kan vurderingen av mitokondriell funksjon in vivo. Disse metodene, samt vurdering av muskelprotein homeostasis, er kombinert med vurdering av hele dyremuskelfunksjon, i form av bevegelses assays, for å tillate at korrelasjon av sub-cellulære defekter med funksjonelle målinger av muskelyteevne. Dermed gir C. elegans en kraftig plattform som å vurdere effekten av mutasjoner, genet knockdown, og / eller kjemiske forbindelser på muskelstruktur og funksjon. Til slutt, som GFP, kationiske fargestoffer, og bevegelses assays blir vurdert ikke-invasiv måte, kan prospektive studier av muskelstruktur og funksjon bli utført på tvers av hele livsløpet, og dette i det foreliggende, kan ikke lett undersøkt in vivo i en hvilken som helst annen organisme.

Introduction

Muscle er en multifunksjonell vev, godt verdsatt for sin rolle i bevegelse, postural støtte og metabolisme. Utvikling og vedlikehold av sunn muskel krever koordinering av flere cellulære prosesser og komponenter. Enten gjennom skade eller sykdom, kan det oppstå feilregulering, noe som resulterer i endrede muskelstruktur og / eller funksjon. Age-forbundet nedgang i muskelfunksjon presenterer en betydelig belastning for helsebudsjettene i den vestlige verden, siden muskelmasse 1,2 og spesielt muskelstyrke og utholdenhet 3-5 er negativt korrelert med dødelighet. Målingen av forhold knyttet til forverret muskelfunksjon som for eksempel endret mitokondriefunksjon eller sarcomere avbrudd, kan gi større forståelse av mekanismene som ligger til grunn generelle muskel utvikling og helse.

C aenorhabditis elegans (C. elegans) er en mikroskopisk nematode best kjent fordi det var den første flercellede organismen til å ha hele sin genom sekvensert 6, den første som har gener forstummet hjelp RNAi 7, og den eneste metazoan å ha sine hele cellen avstamning 8 og nevroanatomi 9 bestemt. C. elegans ble først foreslått som en modell for studiet av den genetiske kontroll av atferd i 1974 av Sydney Brenner 10 og viktigheten av dette og etterfølgende arbeid ble anerkjent med den første av tre Nobelpriser tildelt C. elegans forskere. Omtrent 35% av C. elegans gener er identifisert orthologues hos mennesker, med C. elegans å være en nøkkel organisme som brukes til å forstå den genetiske styring av 11 muskelutvikling. Nesten hver genet i C. elegans genom kan bli slått ned gjennom RNAi 7,12. Således, ved å banke ned gener i fullt utviklet muskler, genetiske komponenter som bidrar til regulation av muskel helse kan bli undersøkt med relativ enkelhet 13.

Den kombinerte evne til å bruke RNAi, mutanter, og kjemiske forbindelser gjør C. elegans en ledende system for utforsking av genetisk regulering 7,14,15 av muskelstruktur og funksjon med alderen 16 og i sykdomsmodeller 17. Virkningen av genet knockdown, mutasjon, og / eller eksponering for kjemiske forbindelser ved muskelstruktur og / eller funksjon kan måles gjennom flere aspekter. Her beskriver vi kort enkle teknikker for å vurdere C. elegans muskelstruktur og funksjon, og mange av disse kan brukes i prospektive studier av muskel helse.

Utvikling av grønn fluorescerende protein (GFP) 18 har aktivert visualisering av både lokaliteten av spesifikke proteiner og den generelle strukturen av organeller i C. elegans. Her forklarer vi hvordan GFP uttrykk spesispesielt er innenfor kroppsveggen muskel mitokondrier, kan kjernene, eller sarcomeres bli brukt for å bestemme om dystrofi av disse sub-cellulære strukturer er til stede. Som struktur er ikke alltid en pålitelig surrogat for funksjon, vi også forklare hvordan bruk av kationiske fargestoffer in vivo tillater vurdering av nedsatt mitokondriemembranpotensialet innen muskel. Når de fargestoffer som anvendes i kombinasjon med GFP, tillater de studiet av arkitekturen og funksjon i en tidsmessig måte i hele levetiden. Til slutt, vi forklarer også hvordan proteinet homeostase i muskelen kan vurderes, og hvor alle disse tiltak kan brukes til å korrelere endringer i hele animalsk muskel tilstand ved bruk av bevegelses assays. Disse teknikkene kombinert med genet knockdown, mutasjoner og / eller kjemiske forbindelser tilveiebringe en kraftig arsenal for å studere hvordan spesifikke gener eller forbindelser som påvirker helsen muskel in vivo. Parallellene i struktur, metabolisme og brutto funksjon av muskler mellom C. elegans ogpattedyr mener C. elegans er en enestående modellorganisme for å forstå regulering av muskel i høyere organismer, inkludert mennesker.

Protocol

1. Stammer, Kultur, og Mikros

  1. Håndtere og vedlikeholde stammer av C. elegans som tidligere beskrevet 19. Stammer er tilgjengelig fra Caenorhabditis Genetics Center (CGC).
    MERK: De stammene som ble brukt i disse forsøkene var CB5600 (ccIs4251 (Pmyo-3 :: Ngfp-lacZ; Pmyo-3 :: Mtgfp) Jeg, ham-8 (e1489 IV)) med GFP fusjonsproteiner lokalisert til mitokondrier og kjerner; PJ727 (jls01 (myo-3 :: GFP, rol-6 (su1006)); unc-54 :: lacZ V) med GFP fusjonsproteiner lokalisert til den kontraktile apparat og PD55 (ccIs55 (sup-7 (ST5); unc- 54 :: lacZ) V) med β-galaktosidase-fusjonsproteiner lokalisert til cytosol.
  2. Komplett RNAi eksperimenter som tidligere beskrevet for multigenerasjons RNAi eksperimenter 13 og få RNAi bakterier fra sekvensen verifisert ORF-RNAi bibliotek konstruert av Marc Vidal et al. 12.
  3. Konstruer stammer som inneholder <em> CCIS 4251, jls01 eller CCIS 55 ved hjelp av standard teknikker 20. Bruk disse transgener til å skape en belastning å vurdere mitokondrie nettverksstruktur, myosin organisasjon eller staten proteostasis hhv. Kryss stammer til en mutant der ute på ett av disse sub-cellulære avdelinger i alle dyr er ønsket.
  4. Bruk ptdins-3-kinase-inhibitor, LY-294002 (LY) som tidligere beskrevet 21. I korthet, LY-294002 legg til en sluttkonsentrasjon på 160 uM på toppen av tørre OP50 foret NGM platene.
  5. Fange opp alle bildene ved hjelp av en GFP filter for GFP-baserte eksperimenter og et mikroskop med en trippel-pass filter som tillater avbildning av røde, grønne og blå kanaler samtidig for å vurdere in vivo membranpotensialet med C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, vanligvis markedsført som MitoTracker Red CMXRos. Gjennomføre bildeanalyse og figur forberedelse i bildebehandling.

  1. Et minimum på 1 dag før det er nødvendig, gjør M9 buffer - 22,04 mM KH 2PO 4, 42.27 mM Na2 HPO 4, 85,56 mM NaCl (sluttkonsentrasjoner), og sterilisere ved autoklavering. Når avkjølt til 45 ° C, tilsett sterilt MgSO4 1 mm etter autoklavering for å hindre utfelling 22. Tillat M9 å avkjøle ved 4 ° C og alikvoter i 50 ml rør.
  2. På dagen for eksperimentet, tilsett 3 ml M9 buffer til en enkelt plate med 9 cm høye tall av L1 larver. Platen vaskes gjentatte ganger ved aspirering av væsken, og M9 pipettering mot overflaten av agaren med platen holdes i en vinkel.
  3. Vask L1 er fra plate og deretter overføre M9 til en 10 ml reagensrør ved hjelp av en pipette.
  4. La for 2,5 min for å tillate at større voksen og senere larvestadiet dyr til å falle til bunnen av prøverøret og de mindre L1 dyrene forblir i nærheten av top av M9 buffer.
  5. Fjern de 500 mL av M9 i reagensrør ved hjelp av en pipette. Deretter pipette M9 inneholder L1 larver til en ny NGM plate seeded med 500 ul OP50 under en dissekere omfang.
  6. Vanligvis tar sikte på å overføre ~ 200-300 L1 larver per plate. Overvåk plater daglig fra voksenlivet, og om nødvendig, plukke dyrene på å friske OP50 NGM plater for å hindre OP50 matkilde blir konsumert.
    MERK: Dette er vanligvis 1-3 dråper M9 ved hjelp av en pipette P1000, selv om dette varierer i stor grad avhengig av antallet av L1 er på den opprinnelige plate.
  7. Hvis prospektive studier i enkelt dyr er ønskelig, når dyrene når voksen alder, plukke enkeltdyr å skille seeded NGM plater. Overfør dyr hver 24-48 timer å skille fra larve dyr.

3. Movement Analyser 19

  1. Et minimum på 2 timer før man starter eksperimentering, å fjerne en 50 ml alikvot av M9 og la den ekvilibrere til romtemperaturlitteraturen.
  2. Plukk en eneste voksen dyr inn 50 mL M9 buffer på et objektglass.
  3. Tell antall av venstre og høyre-rettede kropps bend i 10 sek, hvor en venstrerettet og høyrerettet bøy ene er lik ett slag.
  4. Gjenta tellingen av kropps slag for å gi et totalt minst 5 målinger hvorfra en gjennomsnittlig kan tas. Multiplisere disse tallene med seks for å gi bevegelsen per min.
  5. Ved hjelp av en pipette, overføres dyret tilbake til petriskålen. Denne metoden gjør det mulig tidsmessig måling av bevegelsen gjennom hele levetiden i C. elegan s.

Figur 1
Figur 1: Movement analyser. Når ormer blir plukket inn i buffer, er en venstrerettet (A) og en mot høyre (B) bend lagt sammen for å gi en komplett bevegelses(Slag).

4. Imaging av Mitokondrielle Networks og Sarcomeres i Body Wall Muscle

  1. MERK: Den samme protokollen gjelder for avbildning av både mitokondrier og sarcomeres.
  2. Synkron ormer som tidligere beskrevet (punkt 1) og vokse i 48-60 timer ved 20 ° C når de vil nå ung voksen alder.
  3. Pick ormer (20 representative av platen) fra platene i 20 ul M9 på et objektglass.
  4. Påfør et dekkglass og gå videre til bildet ved hjelp av et fluorescerende mikroskop under en GFP filter (460-500 nm, blått lys eksitasjon) på 40X forstørrelse.

5. Vurdere membranpotensialet ved hjelp av en In Vivo Oppsamling analysen med MitoTracker Red CMXRos (C 32 H 32 Cl 2 N 2 O)

  1. Synkron CB5600 (§ 1), alle merket med GFP i mitokondriene av muskler, og vokse til tidlig voksen alder på NGM inneholder OP50 for 48-60 timer ved 20 ° C.
  2. Tilsett 100 ul DMSO til 50 ug porsjon av C 32 H 32 Cl 2-N 2 O for å lage en stamløsning av 940,692 uM.
  3. Ta en ul av 940,692 iM stamløsning og resuspender i 199 mL M9 å skape en fungerende løsning på 4,70 um (4,70346 mm). Forbered denne i brune 1,5 ml rør fordi C 32 H 32 Cl 2 N 2 O er fotosensitivt.
  4. Forbered 20 ul porsjoner av de 4,70 mikrometer arbeidsløsning (20 voksne ormer per 20 pl prøve).
  5. Plukk 20 voksne dyr i 20 mL av 4,70 mikrometer C 32 H 32 Cl 2 N 2 O i de brune 1,5 ml rør. Inkuber ved 20 ° C i 1 time.
  6. Etter 1 time inkubasjon, tilsett 1 ml M9 til de brune 1,5 ml rør som inneholder ormer, sentrifuger ved 2000 xg i 10 sek og fjern supernatanten. Gjenta dette vasketrinn før resuspending ormen pellet og overføre de resterende 20 μl (som inneholder ormer) til en sklie for bildebehandling.
  7. Ta bilder av mitokondrier med 40X forstørrelse ved hjelp av en trippel pass filter som tillater visualisering av både de røde, blå og grønne kanaler samtidig. Imaging bruker trippel-pass filter viser samlokalisering av C 32 H 32 Cl 2 N 2 O med GFP lokalisert til mitokondrier som fremstår som oransje.
  8. Etter å ha tatt et bilde av den oransje mitokondriene, foto-bleke dyret i 10 sek ved hjelp av lys med bølgelengde 540/25 nm på maksimale innstillinger med alle filter fjernet. Dette vil bleke røde innen mitokondriene og avsløre mitokondrie GFP alene for å bekrefte colocalization i muskel mitokondrier.

6. Vurdering av Muscle Protein Nedbrytning i C. elegans

  1. Synkronisere PD55s (eller noen belastning som inneholder lacZ transgenet) på å NGM plater seeded med OP50 (§ 1). Vokse til ung voksen alder for 48-60 timer ved 20 ° C.
  2. Plukk 20 voksne ormer i 20 mL DDH 2 O på et objektglass. Vær forsiktig med å prøve og plukke bare ormen og ikke eventuelle bakterier med hakke. Merke objektglass med blyant.
  3. Plasser i eksikator i 30 min for å tørke og knekke skjellaget av dyrene. Sikre en tett forsegling på eksikkator med fett rundt forseglingen.
  4. Sjekk uttørking har vært effektiv under en dissekere omfang (figur 2).
  5. Dyppe objektglass i iskald aceton i 3,5 min og deretter la objektglass på et papirhåndkle ved romtemperatur i 15 min for å tillate at aceton på lysbildet til å fordampe. På dette punkt tine X-gal og oksidasjon buffer og tillater ekvilibrering til romtemperatur.
  6. Tilsett 2 ul X-gal til 100 ul buffer oksydasjon og virvle forsiktig for å sikre at dette er homogent. Dette er den X-gal / oksydasjon-buffer konsentrat-blanding.
  7. Tilsett 20 pl av X-gal / oksydasjon-buffer konsentrat-blanding til hver original område på 20 ormer. Inspiser under en dissekere omfang for å sikre master mix dekker helt alle dyr totalt. Forsiktig vippe objektglass for å flytte master mix over områder der dyr ikke er dekket.
  8. Plasser objektglass i et fuktighetskammer etter 1-2,5 timer ved 20 ° C. Bilde dyr når en mørkeblå farge er til stede i kroppsveggen musklene i kontrolldyrene. Bedømme kontrolldyrene under et dissekerende omfang hver 15 min for å bestemme når dyr skal avbildes.

Figur 2
Figur 2: Vurdering av muskelproteindegradering ved hjelp β-galaktosidase-assay. (A) Dyr som inneholder en lacZ transgen er plukket fra petriskåler til 20 mL DDH 2 O på en mikros lysbilde (B). Dyr er desiccated og bli brukket (D). Når aceton fordamper på X-gal / oksydasjon-buffer masterblanding tilsettes (E). Utvikling av blå farge i kontrolldyrene blir vurdert ved 15 minutters intervaller (FL) fra t ​​= 0 min (F) til en mørk blå farge erholdes på tvers av lengden av dyrene (L). Bilder av ormer er tatt på 2,5x forstørrelse i AE og 8X i FL. Zoomer inn C, D, F, G og L er 4X den opprinnelige forstørrelse.

Representative Results

Movement Analyser å kvantifisere Movement Defekter

Movement nedgangen er en god prediktor for dødelighet i C. elegans 16, med redusert prisene indikerer problemer med det nevromuskulære systemet. Endringer i bevegelse, som vurdert av bevegelsesanalyser, kan resultere fra RNAi mot et spesifikt gen eller medikamentell behandling (figur 3-5) eller i muterte dyr 13, 23. En nedgang i bevegelse kan skyldes endrede utvikling for eksempel på grunn av utviklingsmessige knock down av elektrontransport gener som koder for kompleks I, III, IV eller V 24. I tillegg kan spesifikke intervensjoner testes på bare voksne C. elegans for å undersøke effekten på post-utviklings fysiologi. For eksempel, behandlet dyr med RNAi mot unc-112, som koder for C. elegans orthologue av Kindlin-1 som er lokalisert til integrin inneholdermuskel feste komplekser (figurene 3 og 4), eller gass-1, som koder for en komponent av komplekset I i elektrontransportkjeden (figur 4), vise en progressiv reduksjon i bevegelse mot kontroll 48-72 timer etter voksen alder. Dette kan være en indikasjon på problemer med muskelfysiologi. På samme måte, et tap av bevegelse fra 24 - 72 timer er observert i respons til behandling av normalt utviklede voksne med behandling med PI3K-inhibitor LY-294002 (figur 5). Det er også mulig å teste effekten av en andre RNAi behandling, mutasjon, eller et medikament i å gjenopprette bevegelse i dyr som viser redusert bevegelse i respons til en innledende inngrep. For eksempel unc- 112 mutanter vise en målbar reduksjon i bevegelse i forhold til vill-type dyr som blir dempet i nærvær av en andre mutasjon i dim-1 13. Derfor kan bevegelsesanalyser identifisere både intervensjoner som endrer neuromuscuLar utvikling og / eller funksjon samt de som forbedre og / eller gjenopprette nevromuskulær funksjon.

Vurdering av sarcomere Forstyrrelse

Etter å ha identifisert et bevegelses defekt, er det ofte ønskelig å bestemme om årsaken til bevegelsen defekten kan forklares ved problemer i nerver, muskler, eller begge deler. Sarcomeres er de multiproteinkomplekser innen muskel som gir mulighet for sammentrekning og således tvinge generering og bevegelse. Ved å benytte dyr som uttrykker GFP myosin fusjonsproteiner lokalisert til den kontraktile apparat, kan omfanget av avbrudd i myosin filamenter og sarcomeres observeres relativt ikke-invasiv og fremadrettet i individuelle dyr ved utvikling og / eller voksen. Wild-type dyr vise oppstilt sarcomeres som vises som flere grønne parallelle rette linjer innenfor hver body-vegg muskel (figur 3). Avbrudd i disse normale matriser kan være forholdsvis små medkledd sarcomeres vises til å flette i stedet igjen i parallell. Dette fenotype, synlig med unc-112 RNAi ved t = 24 timer eller 48 timer (figur 3), kan sammenlignes med Z-line streaming av aktin feste steder i pattedyr muskel. Likeledes kan små deler av de matriser kollapse eller de kan forsvinne helt, slik som behandling med unc-112 RNAi ved t = 48 timer eller t = 72 timer (figur 3). Tilstedeværelsen av sarcomere defekter i muskelen av dyr som viser en bevegelses defekt (figur 3) er tilstrekkelig til å ta hensyn til bevegelsen defekten, men ikke nødvendigvis utelukke andre problemer med muskel, nerve, og / eller andre vev som svar på en intervensjon .

Vurdering av mitokondrie-nettverksstruktur

I nærvær av en bevegelse defekten er det noen ganger ønskelig å undersøke muskel for andre defekter som kan forårsake eller bidra til bevegelsen dekomne. Mitokondrier utgjør brorparten av mobilnettet energi og avtar i bevegelse kan være et resultat av redusert ATP bestemmelse, reduseres behovet for energi tilgjengelig for muskelkontraksjon. Således strukturen i mitokondriene kan bli kontrollert for abnormaliteter. Det er viktig ikke å anaesthetize dyr med natriumazid som det fremkaller hurtig mitokondrie fragmentering; dyr i disse eksperimentene ble immobilisert ved trykket som utøves av dekkglass. Innenfor villtype C. elegans kroppsveggen muskel, er inneholdt i mitokondriene organisert nettverk (figur 4) og mitokondrier og eksisterer som en funksjon 25 retikulum. Forstyrrelse av nettverket av mitokondrier som presenterer fragmentering av nettverket (gass-RNAi 1, Figur 4B) 26. Fragmentering kan bli alvorlig nok til at ingen skinn av organiserte nettverk forblir så som behandling med unc-112 RNAi (figur 4B og C) 13. Som with forstyrrelser i sarcomere strukturen kan defekter i muskelmitokondriestruktur hos dyr som viser en bevegelse defekt være tilstrekkelig til å gjøre rede for bevegelsen defekt, men dette betyr ikke nødvendigvis utelukke andre problemer med muskel, nerve og / eller andre vev. For eksempel, UNC-112 mutanter 13 og behandling med UNC-112 RNAi (figur 3 og 4) skjerm både forstyrret sarcomeres og forstyrret mitokondriestruktur.

Vurdering av mitokondriefunksjon In Vivo

Mitochondrial membranpotensialet bestemmer kapasiteten av mitokondrier å skape proton drivkraft og generere ATP 27, derfor evnen til å vurdere mitokondriemembranpotensialet in vivo indikerer at kapasiteten til dyret for å frembringe ATP. Som mitokondrie strukturelle forstyrrelser kan eller ikke kan endre mitokondrie funksjonsevne, kan det være desirable for å vurdere mitokondrienes funksjon hos dyr som viser endrede mitokondriestruktur. C 32 H 32 Cl 2 N 2 O akkumuleres i mitokondriene, i alle celletyper, hvor en membranpotensialet er til stede og flekker mitokondriene 28 (Figur 4C). For å vurdere spesifikt mitokondriefunksjon i muskel, kan man bruke C 32 H 32 Cl 2-N 2 O og GFP-merket muskel mitokondrier å demonstrere effekten av en intervensjon spesielt ved muskel mitokondrier (Figur 4C). For eksempel tap av mitokondriemembranpotensialet følgende behandling med unc-112 RNAi forhindrer C 32 H 32 Cl 2-N 2 O fra å komme inn i matriksen. Mitokondriene viser derfor liten, om noen rød farging av mitokondriene i tillegg til GFP merking av mitochondria (figur 4C). Foto-bleking kan også anvendes for å bekrefte at den observertemitokondrier er spesielt de i muskelen (figur 4C). Identifisering av en redusert evne til å produsere ATP er tilstrekkelig til å gjøre rede for en observert bevegelse defekten, men utelukker ikke andre problemer innen muskel, nerve, og / eller i andre vev. Uansett, som ATP redusert produksjonskapasitet er forbundet med sykdomstilstander hos mennesker 29 og aldrende 30, identifisering av en slik defekt i respons til en intervensjonstilveiebringer en plattform for screening av forbindelser og / eller behandlinger som forbedrer RNAi ATP produksjonskapasitet, og disse kan deretter bli ytterligere utforsket for terapeutisk potensial.

Vurdering av protein degradering

I nærvær av en bevegelse defekt og normale sarcomeres og mitokondrier er det noen ganger ønskelig å undersøke muskel for andre defekter som kan forårsake eller bidra til bevegelsen defekten. Evnen til å opprettholde homeostase protein er en signatur for hellermal helse, mens en reduksjon i proteinsyntese og / eller en økning i proteinnedbrytning er en konsekvens av aldring 31 og flere sykdomstilstander 32,33. Derfor kan det være ønskelig å undersøke muskler av dyr med en bevegelse defekt for endrede protein homeostase. Dette kan utføres via vurdering av nivåer av muskel cytosoliske proteiner. Bruken av transgent kodede proteiner tillater vurdering av muskel bestemt proteostasis. For eksempel, bruken av dyr inneholdende β-galaktosidase, fusjonert til et N-terminale del av myosin, som syntetiseres under kontroll av en promoter og enhancer myosin tillater vurdering av cytosolisk muskelproteininnhold 19. Tilstedeværelsen av blå flekk i villtype voksne demonstrerer nærværet av aktiv β-galaktosidase og fravær av patologiske cytosolisk protein degradering. Et tap av fargings i respons til behandlingen antyder patologisk proteindegradering finner sted (Figur 5 13,14,19. For eksempel ubehandlede vill-type dyr viser en intens blå flekk 72 timer etter at voksen alder, mens LY 249002-behandlede dyr viser en mangel på farging (figur 5). Som med defekter i sarcomere struktur og mitokondriell funksjon, er nærværet av patologiske muskelproteindegradering er tilstrekkelig til å står for en observert bevegelse defekten, men ikke nødvendigvis utelukke andre problemer med muskel, nerve, og / eller i andre vev.

Figur 3
Figur 3: (A) unc-112 RNAi forårsaker en betydelig bevegelse defekt ved t = 72 timer (B) Vurdering av oppstilt A-båndstruktur i kroppsveggen muskel.. I wt, A-band i muskelen vises som rette linjer på ung voksen alder (t = 0 t) og fortsatt i stor grad uniform før utover 72 timer i voksen alder (se wt zoom). unc-112 RNAi forårsaker sarcomeres å miste arkitektur i små områder av muskelen (t = 24 timer), kollapset og mangler sarcomeres (t = 48 t), aggregering (t = 72 timer toppanelet og zoom) og tap av linearitet sarcomeres (t = 72 timer bunnpanelet og zoom). Skala barer representerer 25 mikrometer og zoomer er 2,5x.

Figur 4
Figur 4: (A) unc-112 eller en RNAi-gass bevirker en bevegelse defekt (B) Vurdering av mitokondriell struktur innenfor kroppsveggen muskel.. Mitokondrier i muskel vises som nettverks rette linjer på ung voksen alder (vekt). Behandling av dyr med unc-112 RNAi resulterer i mitochondrial fragmentering som tidligere observert mellom 24 timer og 72 timer i voksenlivet (zoomer og pil) 13. Likeledes, RNAi mot gass -1 resulterer i fragmentering av mitokondrie nettverkene som tidligere observert 26. Disse er til stede som små hull i mitokondrie nettverket ved t = 24 timer og fremdrift til utbredt uorden på 72 timer (se zoom og pil). (C) Vurdering av mitokondriemembranpotensialet in vivo. Hos dyr også inneholder GFP lokalisert til mitokondriene, C 32 H 32 Cl 2 N 2 O akkumuleres i kroppen vegg muskel mitokondrier og synes oransje under en trippel-pass filter fra ung voksen alder (t = 0 t) inntil 72 timer etter voksenlivet. Behandling med unc-112 RNAi fører til et progressivt tap av membranpotensialet, som vist ved 72 timer, der de resterende mitokondrier vis mindre akkumulering av C 32 H 32 Cl 2-N 2 O vs. vekt. Fotobleking i 10 sec hjelp 540/25 nm lys bleker den røde fra MitoTracker og avslører GFP lokalisert til muskel mitokondrier (+ Photo blekemiddel). Skala barer representerer 25 mikrometer og zoomer inn er 2,5x.

Figur 5
Figur 5: (A) Behandling med LY-294002 dyr induserer en bevegelse defekt (B) Bestemmelse av proteindegradering ved hjelp av en β-galaktosidase-assay.. Alder synkronisert wt L1 larver er vokst til ung voksen alder ved 20 ° C (t = 0 t) før du overfører til NGM seeded med OP50 (vekt kontroll) eller NGM sådd med LY-294002 (PI3K hemmer behandling) i 24 timer ved 20 ° C . I A, er omtrent 20-30 dyr farget for β-galaktosidase-aktivitet (blått) ved t = 0 timer og etter 24 timer, 48 timer og 72 timer.

Discussion

Disse fremgangsmåter tillater utforskning av muskel fra den macrophysiology av bevegelsen for å identifisere subcellulære defekter som er tilstrekkelig til å forårsake en bevegelse defekt. Når det kombineres disse metodene tillater detaljert analyse av muskel. Den innsikten gjør at ytterligere testing av muskelorienterte hypoteser som gjelder for generell fysiologi, patofysiologi og aldring.

Movement Analyser

En bevegelse feilen viser en forstyrrelse av normal nevromuskulær funksjon. Dette kan være spesifikke for nerver eller muskel, eller det kan være vanlig mellom flere vev. De vanskeligste stadiene av fullbevegelsesanalyser velger ormer som er representative for befolkningen og / eller behandling, og også sørge for at eksperimentator ikke skade dyret ved overføring til M9. Det er viktig å ha et stort prøvestørrelse for å oppnå en representativ og nøyaktig vurdering av bevegelse. Når analysering svært pennetrant virkninger, for eksempel som ofte sett i mutanter, en prøvestørrelse på ti dyr hver vurderes for bevegelse ti ganger er tilstrekkelig til å finne et statistisk signifikante forskjeller versus villtype. Imidlertid enkelhet av bevegelses assays og letthet av dyrknings C. elegans bety at hundrevis av ormer kan raskt bli vurdert for å sikre kvantitativt robuste resultater. Når analysere effektene som vises til stede i bare en del av en befolkning er det viktig å finne ut hvor stor andel av befolkningen ser ut til å bli påvirket, samt alvorlighetsgraden av feil i de mest berørte dyrene. I slike situasjoner kan et større antall dyr, bør vurderes for å tilveiebringe data for den minimale andel av befolkningen påvirkes. Ofte både narkotika og RNAi behandlinger vil produsere alvorlige bevegelsesfeil i en liten andel av befolkningen. I noen tilfeller øke dosen av behandlingen eller fremgangsmåten, og for levering vil øke andelen av affected dyr og løpedoseresponskurver kan være nyttig for å bestemme den optimale konsentrasjonen av et medikament eller RNAi. En andre begrensning av denne bevegelsen er at analysen ormer er manipulert for å vurdere bevegelse. Således er både ormer stimulert og underkastes en viss grad av osmotisk stress når plukket inn i væsken. Graden av osmotisk stress kan begrenses ved hjelp av M9 eller BU buffer 19 i motsetning til vann. Noen av disse begrensningene er lindres ved å måle vanlig bevegelse på plater ved hjelp av kommersielt tilgjengelige sporingssystemer 34 eller gratis plug ins for ImageJ 35. Måle bevegelsen rate av et dyr kan gi viktig informasjon om generelle muskel helse, herunder endringer i funksjon som kan måles gjennom hele levetiden, og den ikke-invasivitet av denne metoden er nøkkelen for potensielle livslang studier av muskelfunksjon.

Avbildning av den kontraktile Apparat

<p class = "jove_content"> Ormen belastning brukes her til bilde kontraktile apparat strukturen var PJ727 36 som uttrykker en myosin GFP fusjonsprotein som er lokalisert til sarcomeres innenfor kroppen veggen muskler. Bruk av denne belastningen muliggjør visualisering av sarcomere strukturen i levende dyr. I likhet med bevegelsen analysen beskrevet ovenfor, kan en viktig fordel med å bruke GFP-merket sarcomeres å vurdere sarcomere strukturen er at fremgangsmåten er relativt ikke-invasiv og derfor kan brukes til å prospektivt følge sarcomere strukturen i de enkelte dyr gjennom hele levetiden. Den største vanskeligheten med denne metoden er at ormer som blir fotografert er fortsatt i live og derfor i bevegelse, noe som gjør det vanskelig å få godt fokuserte bilder. Flere metoder kan benyttes for å redusere bevegelse og gjøre bildebehandling enklere; disse inkluderer bedøvelse eller lammende ormer og immobilisering via trykk, sug, eller bruk av en høy viskositet løsning. Hver av disse metodene for immobiliserteasjon har den ulempe at det kan forandre seg neuromuskulær funksjon. Derfor er det essensielt å inkludere egnede ubehandlede kontroller i analyser. Det kan også være aktuelt å benytte minst to uavhengige metoder for immobilisering for å bekrefte resultatene ikke skyldes problemer med det immobiliserende metode, avhengig av hvor mye brukt metode for immobilisering er valgt for spørsmålet under studien. Her har vi brukt enkle press fra dekkglass på ormen å indusere redusert bevegelighet. Etter å ha plassert dekkglass, vil væsken under dekk fordampe og dekkglass vil dermed begynne å produsere mer press på de ormer, typisk dette tar 2-5 minutter å produsere nok redusert bevegelse for å aktivere enkel bildebehandling.

Det er viktig å overvåke ormer tett etter at dekkglass er blitt innført som trykket vil etter hvert øke nok til å forårsake ormer å briste fra for høyt trykk, typisk 10-15 min etter koverslip tillegg. Ytterligere buffer kan bli innført ved hjelp av en pipettespiss rundt kantene av dekkglass for å unngå klemskade til ormer. Neglelakk kan brukes til å forsegle kantene av dekkglass og hindre fordampning, selv om dette hindrer uttak av dyrene fra under dekkglass, hvis ønskelig. Likeledes kan bruken av silikonperler i oppløsningen bidra til å redusere mengden av trykkdekkglass på de steder ormer.

Akkurat som med å vurdere for en bevegelse defekt, er det viktig å vurdere pene effekt. Pene kan vurderes høyt hvis 80-100% dyr viser en fenotype på NGM plate, delvis hvis 21-79% og lav hvis ≤20% av skjermbildet befolkningen en innvirkning. For svært penetrant effekter, kan mindre utvalgsstørrelser brukes til å produsere betydelige kvantitative data om sarcomere defekter. I tilfeller hvor effekten har en lav penetrans, utvalg av dyr som viser en klar bevegelse defekt i respons til medikamenteller RNAi behandling kan være nyttig i å analysere sarcomere defekter hos dyr er mest berørt av behandlingen. Det er imidlertid ikke nødvendigvis tilfelle at omfanget av behandlingseffekt på bevegelse og subcellulære struktur er den samme. Således kan det være ønskelig å undersøke omfanget av defekter som er tilstede i en stor populasjon, for eksempel 100 dyr. Dette gjør det mulig for forståelsen av fordelingen av defekter gjennom en populasjon. Det kan også være ønskelig å undersøke omfanget av defekter i de mest alvorlig angrepne dyr og / eller undersøke sammenhengen mellom utstrekningen av sarcomere defekt og utstrekningen av bevegelsen defekt. Potensielle problemer til side, er denne metoden raskere og enklere enn andre metoder for å vurdere sarcomere struktur. Dette hastighet og brukervennlighet er imidlertid underlagt en viktig begrensning, sarcomeres inneholder GFP fusjonsproteiner er ikke helt normal 37 og derfor vurdering av forstyrret sarcomeres bør bekreftes ved hjelp av ytterligere flere arbeidsintensive metoder.Disse fremgangsmåter omfatter bruk av polarisert lys 38, phalloidin beising 39, 40 og indirekte immunfluorescens. Av disse metoder, er bare polarisert lys relativt ikke-invasive; de andre metodene krever fiksering og kan derfor ikke brukes i prospektive studier av de enkelte dyr, heller de bare kan brukes for å bekrefte, krysser seksjonsvis, resultater fra slike studier.

Avbildning av Mitokondrielle Networks

Ormen stammen benyttes for de mitokondrielle avbildnings eksperimenter var CB5600 7 som uttrykker GFP et fusjonsprotein lokalisert til mitokondriene og et GFP β-galaktosidase-fusjonsprotein lokalisert til kjernen, både i kroppen veggen muskler. Som med bruk av PJ727 for bildebehandling sarcomeres, bruk av denne belastningen muliggjør visualisering av mitokondriell nettverksstruktur i levende dyr. Således kan denne stamme brukes til å vurdere dynamiske endringer som oppstår, for eksempel redusert mitochondrial fusjon og / eller økt mitokondriell fisjon 41. Også som for bildebehandling sarcomeres, den største vanskeligheten med denne metoden er at ormene blir fotografert er fortsatt i live og i bevegelse, noe som gjør det vanskelig å få godt fokuserte bilder. Selv om flere fremgangsmåter, som diskutert i større detalj ovenfor, kan anvendes for å redusere bevegelse, mitokondrier vises spesielt følsomme for intervensjoner som induserer redusert bevegelse. For eksempel mest brukte anestesi målet komponenter av mitokondrie respiratoriske kjeden og er derfor må brukes med forsiktighet i studier av normal mitokondrie struktur og funksjon. Likeledes må de fleste lammelse midlene brukes med forsiktighet i studier av normal mitokondrie struktur og funksjon, som de fleste lammelse midler føre til mindre signal å passere gjennom nevromuskulære krysset og funksjonell denervering av muskelen er tilstrekkelig til å indusere mitokondrie fragmentering. Forsøkene i denne studien benyttet press for å immobilisere dyrs men andre har med hell brukt levamisole 42, selv om det er viktig å avbilde dyr umiddelbart.

Til slutt, ulike bakterielle forurensninger i kulturer, for eksempel B. subtilis, kan indusere mitokondrie fragmentering; Derfor er det viktig å inkludere egnede ubehandlede kontroller i analyser. For svært penetrant effekter, kan mindre utvalgsstørrelser brukes til å produsere betydelige kvantitative data om mitokondrielle nettverksfeil. Imidlertid, på grunn av utbredelsen av mindre defekter i mitokondrie nettverk, er dette lite antall dyr sannsynlig å være dobbelt så mange som trengs for vurdering av sarcomere struktur. I tilfeller hvor effekten har en lav penetrans, kan utvalg av dyr tydelig viser en bevegelse defekt respons på narkotika eller RNAi behandling være nyttig i analysering av mitokondrie defekter i dyr er mest berørt av behandlingen. Imidlertid, som nevnt ovenfor, er det ikke nødvendigvis slik at denGraden av behandlingseffekt på bevegelse og subcellulære struktur er den samme. Således kan det være ønskelig å undersøke omfanget av defekter som er tilstede i en stor populasjon, for eksempel 150 til 200 dyr, så vel som den grad av forstyrrelse i de mest alvorlig angrepne dyr og nærvær eller fravær av graden av forstyrrelse med utstrekning bevegelse defekt. Andre stammer med fluorescensmerket mitokondriene kan brukes for å bekrefte resultatene oppnådd i CB5600, kan imidlertid bruken av forskjellige fluorescerende proteiner påvirke grunnlinjen nettverk av mitokondrier. For eksempel vises bruken av en tomm RFP-20-fusjonsprotein for å visualisere mitokondrier å bevirke øket baseline mitokondriell fragmentering versus bruk av mitochondrially lokaliserte GFP 17. Mens andre metoder som immunfluorescens og elektronmikroskopi kan anvendes for å vurdere mitokondriell struktur, har de ikke tillater in vivo vurdering av mitokondrielle dynamikk fordi en fikseringstrinn er kreved. Andre metoder slik som bruk av mitochondrially lokaliserte fargestoffer kan anvendes uten fiksering og kan derfor også brukes i stedet for bruk av mitochondrially lokalisert GFP. Som omtalt i neste avsnitt, anvendelsen av slike fargestoffer som også tillater råolje vurdering av in vivo-mitokondriell funksjon.

Vurdere mitokondriemembranen Potential in vivo i C. elegans

En rekke farvestoffer er tilgjengelige for merking 28 mitokondrier. Disse fargestoffer gir en alternativ metode for å visualisere mitokondrienettverksstruktur i levende C. elegans. Mange av disse fargestoffer også tillate urene vurdering av mitokondriell funksjon in vivo, fordi de hoper seg opp i mitokondriene basert på den mitokondriemembranpotensialet. Her har vi brukt C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, som inntas gjennomfordøyelseskanalen, med noen tillegg inn i ormen via skjellaget på grunn av permeabilization gis ved å bli oppløst i 0,5% DMSO. Etter inntreden i cellen C 32 H 32 Cl 2-N 2 O blir oksydert og sekvestrert av mitokondriene, hvor det binder svovelholdige aminosyrer (f.eks metionin og cystein). Dannelsen av disse fargestoff-peptid-komplekser betyr C 32 H 32 Cl 2-N 2 O forblir i mitokondriene når merket 28. En viktig vanskelighet med bruken av mitokondrielle fargestoffer er at de vil merke alle mitokondrier i dyret. Derfor har vi utført merking i CB5600, den samme stamme som er beskrevet ovenfor for å vurdere muskel mitokondriell nettverksstruktur. Ved å bruke en rød mitokondrie fargestoff, en stamme av ormer som uttrykker GFP i muskel mitokondrier, og en trippel pass filter, er det relativt enkelt å avbilde bare mitokondrier i muskel ved å finne mitokondrier som er ospekter av colocalization av rødt fargestoff og GFP merkede mitokondrier. Den vanskeligste skrittet i å utføre denne colocalization tilnærmingen er bildebehandling fordi fargestoffet er foto-bleket i løpet av sekunder under høyt intensitet fluorescerende lys. Denne effekten kan være begrenset ved å holde fluorescens på lav effekt inntil eksperimentator er klar til bilde og deretter justere fluorescens intensitet tilsvarende. Når man har erfaring med bruk av fargestoffer annen tilnærming er å anvende konfokal mikroskopi med Z-stabler til bilde bare mitokondrier i riktig vev; mitokondrie nettverk i muskelen er ganske tydelig i forhold til andre vev. Uheldigvis betyr den manglende evnen C 32 H 32 Cl 2-N 2O til å forlate mitokondrier 28 som, i motsetning til sarcomere og mitokondrielle bildedannende teknikker nevnt ovenfor, kan den ikke brukes til å prospektivt følge tap av mitokondriefunksjon med tiden, med mindre C 32 H 32 Cl 2 N 2 Otilsettes ved diskrete tidspunkter for å separere dyrebestander. Denne begrensning kan overvinnes ved hjelp av fargestoffer som JC-10 som gjør forlater mitokondrier ved sammenbrudd av membranpotensialet 43. Mitokondrier kan også bli isolert fra C. elegans 30 for påfølgende biokjemiske analyser. Slike uttrekk tillater kvantifisering av mitokondriemembranpotensialet ved å kvantifisere graden av lipofile kationiske fargestoffet opptak ved hjelp av flowcytometri eller en fluorescerende plateleser 44. Etter å ha etablert en svekket mitokondriemembranpotensialet, er det også mulig å fastslå om tap av proton-gradient oversettes til et tap av ATP-produksjon ved hjelp av en følsom bioluminometric luciferase-basert metode 45.

Vurdering av protein degradering i C. elegans

Ormen stamme anvendes her for å vurdere muskelproteindegradering ble PD55, som inneholder en bestemt muskel β-galaktosidase som kontinuerlig syntetisert gjennom hele utviklingen til voksen alder er nådd, og som forblir stabil i cytosol for neste 72-96 hr 19. Således måling av β-galaktosidase-nivåer under utvikling overveiende indikerer virkningen av intervensjoner på syntese fra myosin-promotoren, mens tapet av β-galaktosidase i voksen alder indikerer en intervensjon har utløst øket cytosolisk protein degradering 19. Nøkkelen skritt i å vurdere β-galaktosidase aktiviteten er å sikre effektiv uttørking. Unnlatelse av å effektivt desiccate dyrene resulterer i dårlig bestemmelse av X-gal-substratet, og derfor dårlig blå farge i kroppen-veggen muskler av dyrene. For å sikre god uttørking forseglingen på eksikkator bør sjekkes og prøven bør sjekkes på 5-10 min intervaller i hele uttørking å vurdere fremgangen (dvs. 20 mL prøve burde ha tørket innen 10 min og de ​​resterende 20 miner å sikre en helhetlig uttørking). Den β-galaktosidase-assay er et aktivitetsanalyse derfor en hensiktsmessig kontroll er viktig. I tillegg, redusert farging av voksne i en behandlingstilstand i forhold til å kontrollere beviser ikke at nedbrytningen skjer; heller det angir nedsatt enzymatisk aktivitet i respons til behandlingen. For å bekrefte degradering, må mer arbeidskrevende western blot analyse være ferdig mot β-galaktosidase 13 og dette gjør at kvantifisering protein nedbrytning i små populasjoner av telte ormer. Western blot bandet tettheter kan kvantifiseres ved hjelp ImageJ 46. En annen begrensning ved denne metode er at bruken av transgene proteiner ikke informerer om fysiologiske mål for nedbrytning og om slike svar proteomic og / eller målrettede hypotese drevet Western blots som anvendes må være 13. Til slutt, som syntesen av den transgene proteinet som anvendes i disse undersøkelser slås av i tidlig voksen alder 19 C. elegans muskel; for eksempel, stabile eller radioaktive isotopen metoder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O) Invitrogen M-7512 Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential
DMSO Thermo Scientific 67-63-5
KH2PO4 Sigma 7778-77-0
Na2HPO4 BDH 301584L
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
MgSO4 Sigma M-7506
Microscopy Slides Starfrost K220
Microscopy Cover Slips VW2 International 631-0124
1.5 ml Eppendorph Tubes Fisher Scientific FB74031
Dessicator Nalgene D2672
Nikon Microscope Nikon H600L Nikon H600L microscope with proprietary software
Nikon Camera Nikon DS-Fi1 Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera 
Zeiss Microscope Zeiss Ax10 Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter
Plates 9 cm Starstedt 82-1473
Plates 6 cm Gosselin BP53-01
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich 14459-95-1 
MgCl2 Sigma-Aldrich 7786-30-3
Na3PO4 Sigma-Aldrich 7601-54-9
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside Sigma-Aldrich 7240-90-6 
N,N-dimethylformamide Sigma-Aldrich 68-12-2 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wannamethee, S. G., Shaper, A. G., Lennon, L., Whincup, P. H. Decreased muscle mass and increased central adiposity are independently related to mortality in older men. The American Journal of Clinical Nutrition. 86, 1339-1346 (2007).
  2. Marquis, K., et al. Midthigh Muscle Cross-Sectional Area Is a Better Predictor of Mortality than Body Mass Index in Patients with Chronic Obstructive Pulmonary Disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166, 809-813 (2002).
  3. Metter, E. J., Talbot, L. auraA., Schrager, M., Conwit, R. Skeletal Muscle Strength as a Predictor of All-Cause Mortality in Healthy Men. Journal of Gerontology: Biological Sciences. 57, 359-365 (2002).
  4. Hairi, N. N., et al. Loss of Muscle Strength, Mass (Sarcopenia), and Quality (Specific Force) and Its Relationship with Functional Limitation and Physical Disability: The Concord Health and Ageing in Men Project. JAGS. 58, 2055-2062 (2010).
  5. FitzGerald, S. J., et al. Muscular Fitness and All-Cause Mortality: Prospective Observations. Journal of Physical Activity and Health. 1, 7-18 (2004).
  6. Consortium, C. eS. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
  7. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854-854 (1998).
  8. Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode. Caenorhabditis elegans Dev Biol. 56, 110-156 (1977).
  9. White, J. The Anatomy. In The nematode C. elegans. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory. New York. (1988).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  11. Moerman, D. G., Williams, B. D. Sarcomere assembly in C. elegans muscle. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
  12. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).
  13. Etheridge, T., et al. Calpains Mediate Integrin Attachment Complex Maintenance of Adult Muscle in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 8, 1002471 (2012).
  14. Shephard, F., Adenle, A. A., Jacobson, L. A., Szewczyk, N. J. Identification and Functional Clustering of Genes Regulating Muscle Protein Degradation from amongst the Known C. elegans Muscle Mutants. PLoS ONE. 6, e24686 (2011).
  15. Lehmann, S., Bass, J. J., Szewczyk, N. J. Knockdown of the C. elegans Kinome identifies Kinases required for normal protein Homeostasis, Mitochondrial network structure, and Sarcomere structure in muscle. Cell Communication & Signaling. 11, (2013).
  16. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing. C. elegans. Nature. 419, 808-814 (2002).
  17. Munoz-Lobato, F., et al. Protective role of DNJ-27/ERdj5 in Caenorhabditis elegans models of human neurodegenerative diseases. Antioxid Redox Signal. 5, 5 (2013).
  18. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
  19. Zdinak, L. A., et al. Transgene-coded chimeric proteins as reporters of intracellular proteolysis: starvation-induced catabolism of a lacZ fusion protein in muscle cells of Caenorhabditis elegans. J Cell Biochem. 67, 143-153 (1997).
  20. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J Vis Exp. 18, e833 (2008).
  21. Szewczyk, N. J., Peterson, B. K., Barmada, S. J., Parkinson, L. P., Jacobson, L. A. Opposed growth factor signals control protein degradation in muscles of Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 26, 935-943 (2007).
  22. Stiernagle, T. The C. elegans Research Community, WormBook. , 1551-8507 (2006).
  23. Gaud, A., et al. Prednisone reduces muscle degeneration in dystrophin-deficient Caenorhabditis elegans. Neuromuscular Disorders. 14, 365-370 (2004).
  24. Dillin, A., et al. Rates of Behavior and Aging Specified by Mitochondrial Function During Development. Science. 298, 2398-2401 (2002).
  25. Bakeeva, L., Chentsov, Y., Skulachev, V. Mitochondrial framework (reticulum mitochondriale) in rat diaphragm muscle. Biochimica et Biophysica Acta. 501, 349-369 (1978).
  26. Ichishita, R., et al. An RNAi screen for mitochondrial proteins required to maintain the morphology of the organelle in Caenorhabditis elegans. J Biochem. 143, 449-454 (2008).
  27. Mitchell, P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. Nature. 191, 144-148 (1961).
  28. Chazotte, B. Labeling mitochondria with MitoTracker dyes. Cold Spring Harb Protoc. 1, 990-992 (2011).
  29. Seo, A. Y., et al. New insights into the role of mitochondria in aging: mitochondrial dynamics and more. J Cell Sci. 123, 2533-2542 (2010).
  30. Brys, K., Castelein, N., Matthijssens, F., Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. Disruption of insulin signalling preserves bioenergetic competence of mitochondria in ageing Caenorhabditis elegans. BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).
  31. Dorrens, J., Rennie, M. J. Effects of ageing and human whole body and muscle protein turnover. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 13, 26-33 (2003).
  32. Rennie, M. J., et al. Depressed protein synthesis is the dominant characteristic of muscle wasting and cachexia. Clinical Physiology. 3, 387-398 (1983).
  33. Mitch, W. E., Goldberg, A. L. Mechanisms of muscle wasting. The role of the ubiquitin-proteasome pathway. N Engl J Med. 335, 1897-1905 (1996).
  34. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C. The C. elegans Research Community, WormBook. , 1551-8507 (2012).
  35. Kawano, T., et al. An imbalancing act: gap junctions reduce the backward motor circuit activity to bias C. elegans for forward locomotion. Neuron. 72, 572-586 (2011).
  36. Fostel, J. L., Benner Coste, L., Jacobson, L. A. Degradation of transgene-coded and endogenous proteins in the muscles of Caenorhabditis elegans. Biochemical and Biophysical Research Communications. 312, 173-177 (2003).
  37. Meissner, B., et al. An integrated strategy to study muscle development and myofilament structure in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 5, (2009).
  38. Rogalski, T. M., Gilbert, M. M., Devenport, D., Norman, K. R., Moerman, D. G. DIM-1, a novel immunoglobulin superfamily protein in Caenorhabditis elegans, is necessary for maintaining bodywall muscle integrity. Genetics. 163, 905-915 (2003).
  39. Gieseler, K., Grisoni, K., Segalat, L. Genetic suppression of phenotypes arising from mutations in dystrophin-related genes in Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1092-1097 (2000).
  40. Wilson, K. J., Qadota, H., Benian, G. M. Immunofluorescent localization of proteins in Caenorhabditis elegans muscle. Methods Mol Biol. 798, 171-181 (2012).
  41. Chan, D. C. Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 79-99 (2006).
  42. Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model. Cell Death Dis. 9, 513 (2014).
  43. Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50, 98-115 (2011).
  44. Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76, 469-477 (1999).
  45. Wibom, R., Hagenfeldt, L., von Döbeln, U. Measurement of ATP production and respiratory chain enzyme activities in mitochondria isolated from small muscle biopsy samples. Analytical Biochemistry. 311, 139-151 (2002).
  46. Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry. Electrophoresis. 30, 1845-1855 (2009).

Tags

Developmental Biology fysiologi, Muskel mitokondrier sarcomeres aldring
Metoder for å vurdere subcellulære avdelinger av muskel i<em&gt; C. elegans</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gaffney, C. J., Bass, J. J.,… More

Gaffney, C. J., Bass, J. J., Barratt, T. F., Szewczyk, N. J. Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans. J. Vis. Exp. (93), e52043, doi:10.3791/52043 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter