Larvali interferenza RNA nella Red Farina Beetle, Published: October 13, 2014 doi: 10.3791/52059

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David M. Linz*¹, Courtney M. Clark-Hachtel*¹, Ferran Borràs-Castells*¹, Yoshinori Tomoyasu¹

¹Department of Biology, Miami University

* These authors contributed equally

Summary

RNA interference (RNAi) tecniche di gene knockdown basati sono al centro della ricerca Tribolium. Qui, forniamo una panoramica della nostra tecnica larvale RNAi in Tribolium castaneum. Larvale RNAi è una tecnica semplice, ma potente che consente di accedere rapidamente alla perdita-di-funzione di fenotipi, consentendo ai ricercatori di studiare le funzioni del gene in contesti diversi.

Abstract

Il coleottero farina rossa, Tribolium castaneum, offre un repertorio di strumenti sperimentali per studi genetici e di sviluppo, tra cui una sequenza completamente annotata del genoma, la transgenesi base trasposone-, e l'interferenza dell'RNA efficace (RNAi). Tra questi vantaggi, le tecniche di gene knockdown a base di RNAi sono al centro della ricerca Tribolium. T. castaneum mostrano una robusta risposta sistemica RNAi, rendendo possibile l'esecuzione RNAi in ogni fase della vita, semplicemente iniettando RNA a doppio filamento (dsRNA) nel corpo della cavità del coleottero.

In questo rapporto, forniamo una panoramica della nostra tecnica larvale RNAi in T. castaneum. Il protocollo comprende (i) isolamento della corretta fase di T. castaneum larve per l'iniezione, (ii) la preparazione per l'impostazione di iniezione, e (iii) iniezione di dsRNA. Larvale RNAi è una tecnica semplice, ma potente, che ci fornisce un rapido accesso a phenotyp perdita-di-funzionees, tra cui più geni fenotipi smontabile come pure una serie di fenotipi hypomorphic. Poiché praticamente tutti T. tessuti castaneum sono suscettibili di dsRNA extracellulare, la tecnica larvale RNAi permette ai ricercatori di studiare una vasta gamma di tessuti in contesti diversi, tra cui la base genetica delle risposte organismal per l'ambiente esterno. Inoltre, la semplicità di questa tecnica stimola più coinvolgimento studente nella ricerca, rendendo T. castaneum un sistema genetico ideale per l'utilizzo in un ambiente di classe.

Introduction

Il coleottero farina rossa, Tribolium castaneum, sta guadagnando popolarità in vari campi della biologia dovuta in parte alla facilità di esecuzione RNA interference (RNAi) ^1-3. Gene knockdown tecniche basate RNAi-permettono agli scienziati di effettuare perdita-di-funzione analizza senza utilizzare metodi genetici complessi. T. castaneum mostrano una robusta risposta sistemica RNAi, rendendo possibile l'esecuzione RNAi in qualsiasi momento attraverso la semplice iniezione di RNA a doppio filamento (dsRNA) nel corpo della cavità del coleottero ^4-6. Knockdown simultanea di più geni è anche fattibile in T. castaneum iniettando due o più differenti molecole di dsRNA contemporaneamente ^7,8. Inoltre, una serie di fenotipi hypomorphic può essere generato da ridurre la concentrazione di dsRNA iniettato ^8. Queste caratteristiche fanno di tecniche di genetica inversa basata RNAi-interessanti alternative ai tradizionali genetica diretta a T. castaneum. Dal momento che praticamentetutti T. tessuti castaneum sono suscettibili di molecole dsRNA extracellulare ^9, questa tecnica permette ai ricercatori di studiare una vasta gamma di tessuti in contesti diversi. Inoltre, anche se questa relazione si concentra sull'esecuzione di RNAi in T. castaneum, molte procedure qui descritte sono applicabili ad altri insetti. Pertanto, questo protocollo è utile per coloro che desiderano eseguire la perdita-di-funzione analizza nei loro contesti di interesse a T. castaneum, nonché per i ricercatori che intendono applicare una tecnica basata RNAi ad altri insetti.

Iniettare dsRNA in larve permette l'analisi funzionale in una varietà di fasi della vita, tra cui il coleottero larvale, pupa e adulto fasi ^4,5,10. Abbiamo già segnalato il nostro protocollo di RNAi larvale complessivo, comprese le procedure di biologia molecolare ^11. Nella presente relazione, ci si concentra sulla descrizione delle procedure di iniezione dsRNA, che sono meglio spiegati con aiuti visivi. Forniamostep-by-step procedure dettagliate di iniezione così come buoni e cattivi esempi di iniezione. Questo protocollo visuale completa la nostra precedente protocollo, e se combinati, forniscono una visione più completa delle procedure larvali RNAi in T. castaneum. Inoltre, discutiamo i parametri per le molecole dsRNA che potrebbero influenzare il successo di RNAi, applicazione di test basati su RNAi per la ricerca fisiologica, nonché l'applicabilità del protocollo RNAi larvale in un laboratorio didattico.

Protocol

1 T. Azioni castaneum e coltura

1. Decidere su un T. ceppo castaneum da utilizzare per l'esperimento.
   NOTA: Diversi T. lab-stabilita ceppi castaneum sono disponibili. Ga-1 (Georgia-1) è il ceppo parentale di Ga-2 che è stato utilizzato per il sequenziamento del genoma ^3. Dal Ga-1 parti la maggior parte dei polimorfismi del DNA (come polimorfismi a singolo nucleotide, SNPs) con Ga-2, ed è più sana di Ga-2 a causa di meno consanguineità, è ideale per esperimenti di RNAi. Pu-11 è un altro ceppo comodo da usare , come il suo unico maggiore proteina fluorescente gialla (EYFP) espressione in futuro primordi ala ci permette di distinguere l'ultima instar larve di altri stadi (vedi Figura S4 di Clark-Hachtel et al. 2013 ^12). E 'importante documentare che scarabeo ceppo è stato utilizzato nell'esperimento, come sfondi genetici sembrano significativamente AFFect l'RNAi fenotipi ^13.
2. Preparare T. castaneum farina cultura con l'aggiunta di 5% (in peso) di lievito di birra pre-setacciato alla farina di grano intero organico (dopo la miscelazione, memorizzare la farina cultura a -20 ° C). Aliquota la farina cultura (a temperatura ambiente) in 6 bottiglie di Drosophila archivi di plastica once (circa 40 g / bottiglia).
3. Cultura T. castaneum a 30 ° C con 70% di umidità. Utilizzare un incubatore umidità controllata, se possibile. Aggiungere 30-40 adulti per bottiglia cultura (rapporto maschi: femmine 1: 1) per avviare la cultura.
   NOTA: Anche se la muffa è raramente un problema a 30 ° C, temperature più basse (ad esempio 25 ° C) con il 70% di umidità può causare la crescita di muffe nella farina cultura. Abbassare l'umidità se questo si verifica.
4. Trasferire gli adulti ad una nuova cultura bottiglia ogni due settimane per subcoltura (vedere il passaggio 5,2-5,5 per come isolare adulti di farina cultura).
   NOTA: Ci vogliono circa tre settimane per ottenere l'ultimo larve instar. Alternativavamente, T. culture castaneum possono essere mantenuti ad una temperatura inferiore (20-25 ° C), anche se con un periodo più lungo coltura (tempo di sviluppo a 25 ° C è circa il doppio di quella a 30 ° C).

2. preparazione di soluzioni e strumenti per larvale dsRNA iniezione

1. Sintetizzare molecole di dsRNA omologo al gene bersaglio mediante trascrizione in vitro. Conservare a -80 ° C. Per le procedure di biologia molecolare dettagliate, vedere Filippo e Tomoyasu 2011 ^11. Si veda anche la discussione di una serie di parametri che devono essere considerati nella progettazione di molecole di dsRNA.
2. Rendere 10 ml di tampone fosfato 0,1 M di sodio (pH 7,6 a 25 ° C) miscelando 8,5 ml di 1 M Na ₂ HPO ₄ con 1,5 ml di 1 M NaH ₂ PO _4. Controllare il pH con un pHmetro e regolare di conseguenza.
3. Effettuare 1 ml di tampone 10x iniezione miscelando 10 ml di tampone fosfato 0,1 M di sodio (pH 7,6 a 25 ° C), 100 _6, l 0,5 M KCl, 100 ml di colorante alimentare verde, e 790 ml di acqua bidistillata (DDH ₂ O). Diluire il buffer 10x iniezione per rendere buffer di iniezione 2x (200 microlitri di buffer 10x iniezione + 800 ml DDH ₂ O). Conservare entrambe 10x e 2x iniezione buffer a 4 ° C fino al momento dell'uso.
4. Preparare Slides Vetro Sticky.
   1. Coprire un intero vetrino con una forma di colla riposizionabile per preparazioni iniettabili larvali. Per le iniezioni adulti o pupa, fare due sottili strisce di colla lungo i bordi più lunghi della diapositiva.
   2. Lasciare asciugare la colla per diversi giorni, che assicura che la colla rimane abbastanza di cattivo gusto per aderire coleotteri alla diapositiva, pur rimanendo abbastanza flessibile per facilitare la loro rimozione dopo l'iniezione.
      NOTA: Se la colla rimane troppo appiccicoso, utilizzare un dito e toccare la colla, che ridurrà il cattivo gusto. Ogni diapositiva può contenere fino a 40 o 50 coleotteri, e può essere riutilizzata fino a quando non riesce a tenere saldamente gli animali. Alterntivamente, nastro biadesivo può anche essere utilizzato, anche se il nastro adesivo non è talvolta sufficiente per contenere le larve.
5. Fare un eterizzazione Basket.
   1. Rimuovere lo stantuffo di una siringa monouso 10 ml, e tagliare la siringa a metà intorno alla linea 6 ml.
   2. Eliminare la metà inferiore della siringa. Brevemente riscaldare la superficie di taglio della parte superiore della siringa con un bruciatore a gas, e spingere rapidamente la plastica fusa su un pezzo di maglia di nylon per incollare la maglia sulla siringa. Tagliare via maglie in eccesso una volta che la plastica si indurisce.
6. Preparare la bottiglia di etere. Aggiungere 30 ml di etere in una stretta bocca della bottiglia di vetro 100 o 250 ml. Aggiungere diversi pezzi di carta velina per migliorare l'evaporazione dell'etere.
   NOTA: Ether presenta un pericolo di incendio ed è anche dannoso. Maneggiare sempre l'etere sotto una cappa aspirante. Chiudere il coperchio saldamente quando non in uso.
   NOTA: ghiaccio può essere utilizzata come alternativa più sicura (ad esempio in classe), anche se il sedation è meno efficace.

3 Preparazione di larvale Apparato di iniezione

1. Inserire un palcoscenico meccanico XY su un microscopio da dissezione.
   NOTA: XY meccanica sono disponibili presso grandi aziende microscopio. In alternativa, le fasi microscopio economici possono essere utilizzati anche per la maggior parte dei microscopi dissezione con alcune modifiche (vedere la tabella Materiali per esempio).
2. Inserire un ago manipolatore meccanico vicino al palco meccanico XY.
3. Montare una siringa per iniezione. Utilizzare un rubinetto a quattro vie (con attacchi Luer) per collegare una siringa monouso 30 ml di un porta-aghi di vetro, permettendo la manipolazione della siringa senza influenzare la pressione nel ago di iniezione (vedere Filippo e Tomoyasu 2011 ¹¹ per la siringa di iniezione dettagliata assemblaggio).

4. Pulling aghi per iniezione

1. Tirare aghi di vetro borosilicato (B100-50-15, OD: 1 mm, ID: 0,5 mm 15 cm di lunghezza) da unestrattore ago.
   NOTA: Per Sutter P-87 o P-97, utilizzare l'impostazione "Calore = 70, Pull = 45, Vel = 75, Tempo = 90" o seguire il Capitolo 2 della pipetta Cookbook: cellulari aderenti, C. elegans, Drosophila, e Zebrafish - Programmi consigliati. Le impostazioni ottimali variano a seconda del modello di estrattore ago. L'impostazione per un generico ago per l'iniezione Drosophila è un buon punto di partenza.
2. Conservare tirato aghi in una custodia di plastica (ad esempio, un caso di CD in plastica) e fissare con mastice di montaggio rimovibile.

5 Isolamento e selezione di larve

1. Posizionare un 25 # setaccio su un ricevitore setaccio.
2. Inserire il contenuto del flacone cultura (coleotteri e farina cultura) sul setaccio e setacciare immediatamente il contenuto. Non lasciare il contenuto del setaccio, senza vagliatura, come larve rapidamente cercare di scavare attraverso il setaccio e si blocca. Aggressivamente vagliare i contenuti per far cadere la farinaattraverso e lasciare le larve più anziani (in genere 6 ^° e 7 ^° instar larve), pupe e adulti (con le loro cuticole del cast-off, esuvie) dietro in cima al setaccio.
3. Trasferire i materiali che rimangono sul setaccio (coleotteri e esuvie) alla padella seme. Toccare ripetutamente la padella per evitare che i coleotteri di fuggire.
4. Rimuovere il esuvie e le particelle di farina rimanenti sulla superficie dei coleotteri soffiando delicatamente sopra la padella seme.
5. Premere il pan seme per spostare il contenuto al fondo della padella. Poi, lasciare il pan inutilizzato per alcuni secondi. Attendere che per gli adulti, che sono più mobili rispetto ad altre fasi, di uscire dal mucchio. Rimuovere adulti utilizzando un pennello arte (es, larghezza 1 cm).
6. Pupe separata battendo delicatamente la padella seme, mantenendo la bocca della padella leggermente verso il basso, come pupe tendono a rotolare velocemente verso la bocca. Utilizzare un pennello per rimuovere le pupe, lasciando solo le larve sul piatto seme.
7. Plasso le larve isolato in un piatto pulito Petri. Selezionare un adeguato livello di larve per l'iniezione e metterli in una capsula di Petri separata.
   NOTA: All'inizio dello scorso larve instar (1-2 giorni dopo la muta larvale finale) sono spesso adatti quando si analizza l'effetto RNAi su morfologie adulti, così come su metamorfosi. E ', tuttavia, a volte necessario per eseguire RNAi al penultimo (o anche prima) fase per valutare la funzione del gene precoce (ad esempio, figure 3E-3H. Vedere anche Clark-Hachtel et al. 2013 ^12). Utilizzare pupe come riferimento per identificare il formato di instar larve. L'ultimo larve instar sono leggermente più lungo di pupe. Alternativamente, pu-11 può essere utilizzato per identificare l'ultimo larve instar nonché per determinare l'andamento nel tempo dello sviluppo di larve instar ultimo (Figura S4 di Clark-Hachtel et al. 2013 ^12).
8. Mantenere le larve selezionato in una capsula di Petri fino eterizzazione. Posizionare il restodi larve e di altri stadi di coleotteri (come pupe e adulti) di nuovo in una bottiglia cultura con farina e restituirlo al incubatore.

6 Preparazione di aghi per iniezione

1. Posizionare un ago di vetro precedentemente tirato su un vetrino da microscopio in vetro utilizzando tack adesivo o nastro biadesivo. Utilizzando pinze, testare la fine tirato dell'ago, mentre guardando attraverso il microscopio da dissezione per vedere dove le curve punta. Afferra l'area leggermente verso il lato punta dove le curve ago con il forcipe e torsione di rompere.
2. Mantenere buoni aghi e scartare gli altri. Si consideri un buon ago come avente un'apertura che non è né troppo grande né troppo piccolo (circa 0,05 mm di diametro. Figure 1A e 1B), ed è angolato per rendere la penetrazione della cuticola larvale facile (Figure 1B e 2A-2B). Si consideri un cattivo ago come (i) troppo piccolo, rendendo l'assorbimento della soluzione di dsRNA nell'ago difficulto (punto 7) (Figure 1D e 2D), (ii) troppo grande, causando lesioni larvale e possibile letalità a seguito di iniezione (figure 1C e 2F), (iii) schietto, rendendo la penetrazione della cuticola difficile e aumentando lesioni.
3. Inserire l'ago nel porta-aghi.
   1. In primo luogo, svitare la punta del supporto dell'ago e posizionare l'estremità posteriore dell'ago nella punta titolare. Quindi, posizionare la guarnizione di gomma sotto la punta titolare (almeno 1 cm dall'estremità posteriore del ago di vetro).
   2. Inserire la parte posteriore dell'ago nel supporto, con la guarnizione di gomma completamente inserito nell'apertura del supporto dell'ago. Avvitare la punta di nuovo sul supporto.
4. Posizionare il supporto dell'ago montato sul manipolatore ago. Tenere il porta-aghi vicino a orizzontale. Regolare la posizione del manipolatore, in modo che la punta dell'ago si trova nel centro della vista quando si cerca attraverso il microscope.

7 Soluzione prealimentazione dsRNA nel Needle

1. Preparare la soluzione iniettabile dsRNA appena prima dell'iniezione, regolando la concentrazione con DDH ₂ O e miscelare la soluzione dsRNA con uguali volumi di tampone di iniezione 2x (punto 2.3). Mantenere la soluzione mista su ghiaccio. Si veda la discussione per quanto riguarda la concentrazione dsRNA.
2. Tagliare la punta di un 20 microlitri punta della pipetta monouso. Pipettare 10 ml della soluzione nella punta della pipetta tagliato. Rimuovere con cautela la punta della pipetta dalla pipetta mantenendo il liquido sulla punta fornendo contropressione. In alternativa, rimuovere con attenzione la punta e quindi spostare la soluzione alla fine della punta fornendo pressione con un dito.
3. Posizionare la punta della pipetta con la soluzione dsRNA sul palco microscopio utilizzando appiccicosa aderenza con l'apertura rivolta verso la punta dell'ago.
4. Guardando attraverso il microscopio, spostare lentamente la punta carica verso l'ago fino a che la punta delago è appena dentro la punta della pipetta caricato e nella soluzione.
5. Guardando attraverso il microscopio, delicatamente tirare indietro lo stantuffo della siringa per estrarre lentamente la soluzione dsRNA nell'ago.
   NOTA: Non sovraccaricare l'ago. Come la fine della soluzione dsRNA avvicina alla punta dell'ago, rallentare la velocità di trazione e interrompere il caricamento della soluzione prima della punta dell'ago raggiunga aria. Se l'aria raggiunge la punta, la soluzione sarà rapidamente disegnato nel porta-aghi, causando seri problemi di contaminazione. Procedure di pulizia dettagliate dei porta-aghi sono descritte in Filippo e Tomoyasu 2011 ^11.
6. Togliere la pressione dalla siringa di iniezione e porta-aghi aprendo il rubinetto. Quindi, spostare la punta della pipetta di distanza dalla punta dell'ago. Sollevare l'ago dal palco per evitare di danneggiare accidentalmente l'ago mentre si posiziona il larve sul palco. Rimuovere la punta della pipetta svuotato dal palco.
8 dsRNA iniezione
1. Posizionare le larve nel cestino eterizzazione. Utilizzare meno di 10 larve se l'apprendimento della tecnica. Utilizzare 30-40 larve in un round, una volta agio con la tecnica.
2. Posizionare il cestello con larve in bottiglia nell'etere e chiudere il coperchio.
   NOTA: Ether presenta un pericolo di incendio ed è anche dannoso. Eseguire questo passaggio sotto una cappa aspirante.
3. Larve Etherize per circa 3 min. Controllare le larve di movimento dopo 3 min. Metterli nella bottiglia nell'etere per altri 30 secondi se sono ancora in movimento. Non Etherize per più di 5 minuti in quanto ciò può aumentare la mortalità.
   NOTA: Il momento ottimale eterizzazione può variare a seconda della temperatura e dell'umidità.
4. Trasferire le larve eterizzò dal cestello al bordo antiaderente di un vetrino di vetro appiccicoso. Utilizzando una pinza e guardando attraverso il microscopio, raccogliere ognuno larve per uno e metterli sul vetrino. Lay loro lateralmente e delicatamente toccare i loro corpi ftesta rom a coda con le pinze, un po 'di stretching come si va, per assicurarsi che essi siano fissati sul vetrino.
5. Posizionare il vetrino appiccicosa con larve sul palco microscopio.
6. Inserire l'ago caricato dsRNA dolcemente verso il lato dorsale delle larve per evitare di danneggiare il sistema nervoso centrale. Evitare anche la linea mediana dorsale, come il cuore larvale si trova qui. In questo e in successive fasi, utilizzare sempre la fase di spostare le larve all'ago (invece di utilizzare il manipolatore ago per spostare l'ago).
   NOTA: Il sito di iniezione specifico non importa come RNAi in T. castaneum sembra essere sistemica. Tuttavia, di solito è più facile da iniettare nel lato dorsale dei segmenti toracici o addominali.
7. Dopo aver inserito l'ago nel larve, estrarre l'ago leggermente indietro per lasciare spazio per il dsRNA per entrare nella cavità del corpo larvale.
8. Premere delicatamente sulla siringa per iniezione fino a che il verde larve turno (o il colore del tampone iniezione) e guardare stretched e pieno.
   NOTA: Se l'apprendimento della tecnica, cercare di iniettare il più possibile per determinare la quantità di soluzione che può essere iniettato in una larva senza significative letalità. Si tratta generalmente di circa 0,5-0,7 ml.
9. Rimuovere l'ago dalla larve. Durante la rimozione dell'ago, tirare leggermente indietro sulla siringa iniezione per evitare la perdita di dsRNA (essere anche attenzione a non tirare in aria).
10. Iniettare tutte le larve sulla diapositiva. Assicurarsi di rimuovere le larve che non sono stati iniettati con successo. Iniezione completa prima di larve di svegliarsi (in circa 10 min).
11. Rimuovere il vetrino con larve iniettata dal microscopio di iniezione e lasciare la diapositiva per ulteriori 5 minuti fino a che tutte le larve riprendersi dalla eterizzazione.
12. Con una pinza e sotto un microscopio da dissezione, sollevare delicatamente le larve dalla testa alla coda di liberarli dalla diapositiva appiccicoso. Posizionare le larve appena rilasciata in un piatto pulito Petri. Lasciare le larve sulla piastra di Petri per 10-15 minuti per consentire l'iniezione wound di coagulo.
13. Inserite le larve in un nuovo flacone con farina pulito ed etichetta adeguatamente compreso il nome del ceppo, il tipo di dsRNA iniettato, la concentrazione di dsRNA, numero di larve iniettato, e la data.
14. Cultura le larve iniettato a 30 ° C con 70% di umidità. Osservare le larve di RNAi fenotipi regolarmente.
    NOTA: L'ultima pupate instar larve entro 7 giorni. Poi, le pupe si Eclose in adulti dopo 7 giorni (se non vi è nessuna anomalia nei tempi causata da RNAi).

9 Conferma della Knockdown e fenotipica analisi

1. Considerare valutare l'efficienza di RNAi abbattere da vari differenti tecniche di biologia molecolare, quali quantitativa di trascrizione inversa-PCR (qRT-PCR) e Western Blotting. Vedere Miller et al. 2012 ⁷ e Filippo e Tomoyasu 2011 ¹¹ per informazioni dettagliate qPCR e Western Blot protocollo, rispettivamente.
2. Analizzare RNAi fenotipi correlati.
   NOTA: RNAi correlatefenotipi possono essere osservati in diverse fasi diverse e in diverse condizioni di coltura, a seconda dei geni che erano mirati. RNAi può influenzare il coleottero morfologia, metamorfosi, della fisiologia e del comportamento. Quanto spesso la presenza di fenotipo viene controllato e in quali condizioni i coleotteri sono allevati devono essere adattati alle specifiche domande indagati attraverso RNAi.

Representative Results

Uno dei passaggi chiave per iniezione di successo è quello di fare un buon ago. Come descritto al punto 6, la punta dell'ago deve essere spezzato prima di iniettarlo T. castaneum. Esempi di aghi positive e negative sono mostrati in Figura 1. Un buon dell'ago ha una punta affilata e rigido, con un'apertura di diametro circa 0,05 mm (Figura 1B).

La figura 2 presenta una iniezione di successo (figure 2A e 2B), nonché diversi casi di iniezioni falliti (Figure 2C-2F). Con un ago per iniezione adeguatamente dimensionato, la punta dell'ago penetra la cuticola larvale con una resistenza minima (Figura 2A), e la soluzione dsRNA (verde) sfocia nel larve senza perdite (Figura 2B). Non over-inject, in quanto causerà la fuoriuscita della soluzione dsRNA anche con una di dimensioni adeguate ago per iniezione (Figura2C). Se la punta dell'ago è troppo sottile, la punta dell'ago spesso non riesce a penetrare la cuticola larvale e curve, rendendo difficile l'iniezione (Figura 2D). Se questo accade, taglio la punta dell'ago a volte aiuta. Aghi più grandi sono spesso ancora utilizzabili, anche se con qualche difficoltà nel penetrare la cuticola larvale (Figura 2E). Tuttavia, una grande quantità della soluzione di dsRNA è facilmente spinto fuori dall'ago anche con una leggera pressione sulla siringa per iniezione, spesso causando un overflow della soluzione dsRNA (Figura 2F).

Quando si esegue RNAi, è importante avere un controllo positivo per valutare che RNAi funziona correttamente, e un controllo negativo per verificare che l'effetto osservato non è un effetto non specifico di dsRNA o una conseguenza delle procedure di iniezione (come pregiudizio causato per iniezione, o anormalità da eterizzazione). L'iniezione di dsRNA EYFP di targeting può servire come unbuon controllo positivo quando si utilizza il pu-11 ceppo ^5,7. Quando EYFP dsRNA viene iniettato nell'ultima fase larvale, una significativa riduzione del segnale EYFP in futuro primordi ala può essere osservata fin dal giorno dopo una sola iniezione (Figura 3A). L'atterramento di EYFP è completa due giorni dopo l'iniezione del EYFP dsRNA (Figura 3B) e questo atterramento persiste attraverso l'(3C Figure e 3D) stadio di pupa e per tutta la vita del coleottero se la concentrazione dsRNA è abbastanza alta (ad esempio 1 mg / mL) ^7. EYFP dsRNA può anche essere usato come controllo negativo in quanto si tratta di una sequenza di geni non-endogeno e non dovrebbe causare interruzioni morfologiche o fisiologiche (Figure 3A-3D).

Abbiamo fornito le immagini di larvale RNAi per vestigiali (VG), un'ala gene critico ^12, come un altro esempio di come efdifettoso questa tecnica RNAi basata iniezione è in T. castaneum. Quando dsRNA per VG viene iniettato in larve penultima tappa (una tappa prima dell'ultimo stadio larvale), una perdita completa delle strutture alari può essere osservata nella fase di pupa (Figure 3E e 3F). L'adulto risulta inoltre manca completamente strutture alari (Figure 3G e 3H). Il risultato RNAi per vg esemplifica sia per la robustezza e la natura sistemica di RNAi in T. castaneum.

Figura 1: (A) Esempi di aghi ininterrotte, buoni e cattivi (B) La punta di un buon ago ben spezzato (C) La punta di un ago rotto che è troppo grande e smussato (D) La punta... di un rotto n ago che è troppo sottile. Barre di scala (rosso) sono 0,05 millimetri. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2:... (A) di dimensioni adeguate ago per iniezione inserito l'ultima larva instar (B) Larva opportunamente iniettato con la soluzione verde dsRNA (C) Overflow della soluzione dsRNA nel punto di iniezione causato da un eccesso di iniezione (D ) Un ago sottile non riuscendo a penetrare la cuticola larvale. (E) Una grande ago per iniezione inserita l'ultima larva instar. (F) Larva iniettato con un grosso ago, con conseguente trabocco e la fuoriuscita della soluzione dsRNA. Le frecce indicano gli aghi.ove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Esempi di successo RNAi in T. castaneum. (AD) Ultima iniezione larvale dei risultati EYFP dsRNA in una riduzione di espressione EYFP. (A) Larve un giorno dopo l'iniezione. (B) Larve due giorni dopo l'iniezione. (C) Controllo pupe. (D) Pupae derivanti da larvale EYFP dsRNA iniezione. I controlli negativi sono tampone di iniezione (A, B) e DsRed dsRNA iniezione (C, D). Frecce e frecce indicano espressione EYFP o la loro mancanza nel primordi ala e gli occhi, rispettivamente. (EH) Penultimo larvale RNAi per vg. (E) Selvaggio-tipo pupa. (F) VG RNAi pupa. La mancanza di strutture alari è già visibile allo stadio di pupa (freccia). G) Wild-tipo adulto. (H) VG RNAi adulto. Strutture Ala correlate sono completamente mancanti (freccia). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Ci sono una serie di questioni importanti che devono essere considerati per garantire il successo di RNAi, tra cui la lunghezza e la concentrazione delle molecole di dsRNA, la concorrenza tra le diverse molecole di dsRNA (quando tenta multipla abbattere), e la possibilità di off-target effetti (OTE).

dsRNA Lunghezza

La lunghezza delle molecole di dsRNA influisce sull'efficienza della risposta sistemica RNAi, con un dsRNA essendo più efficiente per innescare RNAi ^7,14,15 (se il limite più di dsRNA è attualmente nota). La lunghezza dsRNA deve essere più lungo di 50 bp per indurre efficace RNAi in T. castaneum ^7. dsRNA tra 150 bp e 500 bp sembra essere l'ideale per esperimenti di RNAi. Anche se le molecole più lunghi dsRNA possono anche essere utilizzati, essi avranno una maggiore probabilità di OTE e il passo-gene clonazione diventerà sempre più difficile.

dsRNA Concentrazione

ve_content "> differenti gradi di gene knockdown possono essere realizzati in funzione della concentrazione di dsRNA. 1 mg / mL sembra essere una concentrazione iniziale ragionevole, che spesso produce un fenotipo pressoché nullo (possono variare a seconda del gene (s) di interesse ). RNAi può essere eseguita con una concentrazione più elevata (ad esempio, 7-8 mg / mL) per ottenere un forte RNAi fenotipo. RNAi con una diluizione seriale di dsRNA a volte può essere utile per produrre una serie di fenotipi hypomorphic (Dati supplementari di Tomoyasu et al. 2009 ^8, e Borràs-Castells dati non pubblicati).

RNAi Concorso

Multipla knockdown gene può essere realizzato in T. castaneum iniettando varie molecole dsRNA diversi contemporaneamente. Tuttavia, è anche noto che avere diverse molecole dsRNA differenti presenti nell'organismo si traduce spesso in concorrenza tra le dsRNAs per l'accesso ai componenti RNAi (ad esempio, Tomoyasu et al., 2005 ^16, Tomoyasu et al. 2009 ^17, e Yang et al. 2009 ^18). Anche se fattibile, quadruple RNAi (o più) potrebbe essere difficile, in quanto dovrebbe provocare una significativa riduzione di efficienza RNAi per tutti e quattro i geni bersaglio.

Off-targeting

OTE è una preoccupazione inerente per gli approcci basati su RNAi. Un modo per ridurre al minimo OTE è quello di identificare le regioni del gene bersaglio che condividono sequenze simili con altri geni ed evitare queste regioni durante la progettazione dsRNA. Una semplice analisi BLAST contro il T. castaneum set gene predetto in grado di identificare tali regioni. Diversi strumenti online permettono anche la valutazione del potenziale di OTE (ad esempio, E-RNAi ^19). Esecuzione di RNAi per due regioni non sovrapposte del gene bersaglio è un modo semplice ed efficiente per eliminare la possibilità che osservano fenotipi sono causati da OTE. La possibilità di OTE è ridotto al minimo se RNAi per due regioni non sovrapposte producono gli stessi fenotipi (a meno che le due regioni non sovrapposti condividono una sequenza simile).

Valutare gene knockdown con mezzi diversi fenotipica analisi è spesso critico efficacemente presenti i dati relativi RNAi. Due modi principali per valutare gene knockdown sono qRT-PCR e Western Blot. qRT-PCR è un modo conveniente per misurare il livello di mRNA bersaglio, ed è stato utilizzato in molti studi RNAi connesse comprese quelle in T. castaneum (vedi Miller et al. 2.012 ⁷ per esempio). Carner, cautela deve essere presa, come abbiamo visto di recente alcuni casi in cui il livello di mRNA è up-regolato da RNAi (anche se il prodotto proteico è down-regolato) (Borràs-Castells dati non pubblicati). Non è noto se questo mRNA RNAi indotto up-regolazione può essere diffusa o unico per alcuni geni. Western blot è un altro modo per confermare gene knockdown. Questo metodo è abbastanza affidabile come misura la quantità del prodotto finale proteina. Il requisito di un anticorpo specifico contro il prodotto proteico del gene bersaglio è un aspetto negativo di questo approccio. Utilizzando misurazioni multiple indipendenti oltre ad analisi fenotipica aumenterà la fiducia dei dati fenotipici ottenuti con l'analisi basata su RNAi.

Fin dalla sua concezione nel T. castaneum, RNAi è stato utilizzato principalmente per studiare la funzione dei geni nello sviluppo e formazione di pattern. Questi T. studi sullo sviluppo castaneum hanno avuto molto successo in caratterizing funzioni evolutivamente conservati e divergevano di geni (rivisto nel Denell 2008 ¹ e Klingler 2004 ^2). Studi Tuttavia, a base di RNAi in T. castaneum non sono limitati a biologia dello sviluppo. Ad esempio, RNAi può essere utilizzato per studiare la funzione dei geni in una vasta gamma di risposte fisiologiche e comportamentali, tra cui la tolleranza allo stress, predazione, l'aggressività, scelta del compagno, modelli di attività, e meccanismi di difesa.

Una difficoltà di applicare RNAi di questi contesti è la probabilità di effetti pleiotropici. Spesso, geni di interesse avranno una varietà di ruoli in tutto il T. castaneum ciclo di vita, rendendo così la rimozione di geni senza effetti fenotipici indesiderate difficili. Tuttavia, la capacità di eseguire facilmente RNAi in una varietà di fasi spesso può essere una strategia efficace per evitare questi effetti pleiotropici. Ad esempio, l'esecuzione di RNAi negli adulti, invece di larve o pupe potrebbe consentire di aggirare unincurato letalità causata dal gene knockdown durante lo sviluppo precoce. La flessibilità della risposta RNAi in T. castaneum rende quindi questo modello una scelta interessante per adattare RNAi per esperimenti di funzione del gene in risposte fisiologiche e comportamentali.

Il T. sistema castaneum è ideale anche per l'uso in un laboratorio didattico. T. castaneum può essere facilmente coltivate su una farina / lievito miscela a temperatura ambiente (25 ° C) senza frequenti subcoltura, e tecniche di RNAi in T. castaneum sono abbastanza semplici da essere adattato ad un laboratorio con i giovani, scienziati di apprendimento. Come RNAi sta diventando una tecnica essenziale in una varietà di campi biologici, è fondamentale che gli studenti sono esposti a questa tecnica. La natura straight-forward della tecnica larvale RNAi in T. castaneum incoraggia inoltre più studenti da coinvolgere nella ricerca, rendendo T. castaneum un ottimo candidato per una classe orientata al sistema genetico. </ P>

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Organic whole wheat flour	Heartland Mill Inc. Kansas	G1
Brewer’s yeast	MP Biomedicals	2903312	Sift yeast with #35 stainless sieve before use. Wear protective mask and cover the sieve with plastic wrap, as the sifted yeast is a fine particle and respiratory hazardus.
6 oz plastic Drosophila stock bottles	Fisher Scientific	11-888
Sieve	Fisher Scientific	04-881N	8 in. dia. x 2 in.D. Use #25 (Nominal opening 710 µm) for larvae, pupae, and adults.
Sieve	Fisher Scientific	04 881 10P	8 in. diameter #35 (Nominal seive opening: 600 µm)  Stainless Steel Sieves, 8 in. dia. x 2 in.D. This sieve is ideal to remove clumps from yeast powder.
Sieve receiver	Fisher Scientific	04-866B	8 in. diameter
1.5 Quart spouted sample pan	Seedburo Equipment Co.	Model 33	collection pan
Incubator	BioCold Environmental Inc	BC26-IN	Keep it 30 °C with 70% humidity.
Na2HPO4	Fisher Scientific	S374500
NaH2PO4	Fisher Scientific	S397-500
KCl	Fisher Scientific	P217-500
Food dye	Kroger		green, blue, or red preferable
Microscope glass slide	Fisher Scientific	22-038-103
Tack-It Over&Over	Aleene's		Repositionable glue for sticky slides. Double sided tape can be used as an alternative, however, we found that the adhesiveness varies.
Plastic CD case	Amazon
Boroslilicate glass capillary	Sutter Instrument	BF100-50-15	O.D. 1 mm, I.D. 0.5 mm, 15 cm. Without filament
Needle puller	Sutter Instrument	P-87 or P-97
Removable mounting putty	Loctite Fun-Tak
Compressed gas duster	OfficeMax	OM96091
Forceps	Fine Science Tool	11231-30	Dumoxel #3 (to manipulate beetles)
Forceps	Fine Science Tool	11252-20	INOX #5 (to break needle tips)
Ethyl ether, anhydrous	Fisher Scientific	E138-500
Nylon mesh	Flystuff/Genessee Scientific	57-102	120 µm pore size/49% open area
Media bottle, 100 ml	VWR	89000-926
Stereomicroscope	Zeiss		SteREO Discovery V12. Injection microscope.
Stereomicroscope	Fisher/Zeiss	12-070-513	Stemi2000. Use to break the needle and place larvae onto the sticky slide.
X-Y mechanical stage	Zeiss	4354600000000000
X-Y mechanical stage	Microscopenet.com	A512	Inexpensive alternative
Manipulator	Narishige	M-152
Magnetic stand	Narishige	GJ-1
Glass capillary holder	Narishige	IM-H1
30 ml Disposable syringe	BD syringe	309650	BD Luer-Lok Tip
Four-way stopcock	Cole-Parmer Instrument Co.	EW-30600-03	Stopcocks with Luer connections; 4-way; male slip
Art paint brush	Amazon	Art Advantage Oil and Acrylic Brush Set, 24-Piece	Any general paint brush will work.