Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الفسيولوجية تسجيلات وRNA تسلسل الزوائد ذوقي من البعوض الحمى الصفراء Published: December 30, 2014 doi: 10.3791/52088
Automatic Translation
1, 1
1Agricultural Research Service, Henry A. Wallace Beltsville Agricultural Research Center, Plant Sciences Institute, Invasive Insect Biocontrol and Behavior Laboratory, United States Department of Agriculture

Summary

باستخدام طريقتين لتقدير التعبير الجيني في الزوائد الذوقية الرئيسية للبعوض Aedes aegypti، حددنا مجموعة من الجينات مزعومة الكامنة وراء الاستجابة العصبية لمركبات المريرة ومثير للاشمئزاز، على النحو الذي يحدده الفحص الكهربية.

Introduction

وقد أظهرت مركبات مثل DEET، Picaridin، Citronellal وIR3535 لصد البعوض بشكل فعال، بما في ذلك ناقلات الأمراض المهم الزاعجة المصرية 1،2. نسجل إمكانات العمل من الخلايا العصبية الحسية المرتبطة sensilla الذوقية محددة لتحديد الخلايا المشاركة مع البعوض صد. إلى جانب التسلسل المصب من الجينات التي أعرب عنها في هذه الأنسجة، ونحن قد التعرف على الجينات على الأرجح التوسط في ردود هذه الخلايا من أجل فحص مركبات جديدة لتحسين قدرات صد.

RNA وما يليها هو أداة قوية، لتصبح بسرعة قياسية لتتبع التغيرات الزمانية والمكانية في التعبير الجيني. يحلل RNA وما يليها من الزوائد حسي كيميائي الحشرات واستخدمت أجهزة للكشف عن مستقبلات الجزيئية في العديد من أنواع الحشرات 3-5، وتحسين كبير على التقليدي القائم على PCR البحث الجين بواسطة الجينات 6. الحشرات تمثل الطبقة الحيوان الأكثر تنوعا، قبلsenting العديد من الفرص لدراسة العلاقة بين الجينات والظواهر فريدة من نوعها. ويمكن استخدام تكنولوجيا RNA وما يليها على أي نوع من الأنسجة الحشرات الحية. وبالمثل، تسجيل الكهربية من الخلايا الحسية داخل sensilla الذوقية uniporous لا يمكن أن يتحقق في كثير من أنواع الحشرات المختلفة. الاقتران من هذه التقنيات اثنين يسمح للباحثين لتضييق الجينات مجموعة تشارك في النمط الظاهري حسي كيميائي لوحظ. سوف الأنواع المختلفة تشكل تحديات محددة، ولكن قد تبلغ العلاقة بين جينات مستقبلة حسي كيميائي والتكيف حسي كيميائي. حجم ومورفولوجية حسي كيميائي sensilla هو متغير واستكشاف الأخطاء وإصلاحها قد تتطلب واسعة النطاق عند تسجيل إمكانات العمل للحد من الضوضاء وتحديد إشارات متكررة. تشريح أجهزة حسي كيميائي قد تكون تافهة أو حساسة تستغرق وقتا طويلا، اعتمادا على التشكل وحجم الحشرة. انتعاش عالية الجودة RNA قد تتطلب بعض استكشاف الأخطاء وإصلاحها كذلك، مثل تجنب بعض أصباغ خلالجمع الأنسجة.

بينما يدل على آثار مركبات مضادة للمن خلال التجارب السلوكية غير المباشر والمفيد، وهذا النهج هو الوقت مكثفة واسعة فيما يتعلق بآلية العمل. الكهربية إلى جانب RNA-يليها تسمح للتحليلات أكثر تحديدا من ما يدفع السلوكيات تجنب في الحشرات. مرة واحدة وقد تم التعرف على "أدوات" التمييز الكيميائية في أنواع الحشرات، ومحاولات أكثر تحديدا لتحسين على المواد الطاردة للتعرف ممكنة. ويمكن التعبير عن مستقبلات والبروتينات المرتبطة بها في الخلايا الحسية المسؤولة عن هذه السلوكيات heterologously للفحص الكيميائي المباشر. وعلاوة على ذلك، يمكن النمذجة الجزيئية ويتوقع المواد الكيميائية والتي سوف تثير ردود قوية من هذه المستقبلات 7.

قد تكون لقطة من جميع الجينات النشطة في مجموعة ضيقة من الأنسجة حسي كيميائي مفيد أيضا في تحديد جينات مشابهة في الأنواع الأخرى. عن طريق التماثل تسلسل والتعبير سيmilarities، قد شكل الباحثون مجموعة من المستقبلات الجزيئية الأرجح التوسط الردود على المواد الطاردة التي هي فعالة على نطاق واسع على الحشرات. نقدم بروتوكول التالية لمساعدة الباحثين في تفكيك مسارات حسي كيميائي الحشرات وإقناع أكثر الخوض في neuroethology عدم نموذج والحشرات الهامة اقتصاديا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تربية عزت. الكبار بعوض

  1. يفقس البيض في حوالي ¾ بوصة المياه في صينية ضحلة. سوف الاكتظاظ تقليل حجم البالغين.
  2. اليرقات الخلفية عند 25 ° C (12-HL: 12-HD)، وإطعام الطعام الأسماك الأرض.
    ملاحظة: الإفراط في الغذاء قد يقلل من معدلات البقاء على قيد الحياة.
  3. إزالة الشرانق بشكل فردي عن طريق ماصة باستير يوميا ونقلها إلى أطباق البلاستيك (9 سم × 5.5 سم) داخل الدلاء الاحتواء صغيرة مع الأغطية شبكة غرامة، وبالتالي إنشاء 24 تجمعات سن ساعة.
  4. البعوض البالغ تغذية 10٪ محلول السكروز بواسطة كرة من القطن وضعت على جدران شاشة السكن قفص البعوض في غرفة البيئية في 27 ° C والرطوبة النسبية 70٪ تحت نفس الضوئية واليرقات.
  5. لالكهربية، استخدم 5-10 الحيوانات القديمة اليوم. بشكل عام، فإن الحيوانات الكبيرة تنتج نتائج أفضل. لعزل الحمض النووي الريبي، واستخدام الحيوانات التي تدخل في نطاق واحد 24 ساعة تجمع العمر في نطاق من العمر 5-10 يوم.

الحمار = "jove_title"> 2. إعداد مواد كيميائية

  1. تحديد تركيز مناسب من بالكهرباء (مثل 1-10 ملم) الذي يتسبب الحد الأدنى من النشاط من الخلايا العصبية الحسية المحدد. 10 ملي كلوريد الصوديوم أو 1MM بوكل هي الشوارد معقولة لاختبار النشاط الأساسي عند بداية التجربة.
  2. حل لكل مادة كيميائية تجريبية في مذيب مناسب (إن لم يكن الماء، واستخدام الإيثانول أو DMSO) الذي ليس له أثر يذكر أو معدومة على تصاعد النشاط بالمقارنة مع بالكهرباء وحدها. تركيزات النهائي من 10٪ من الإيثانول أو 1٪ DMSO هي تركيزات انطلاق معقولة.
  3. اختر المناسب (مثل الكينين للمرارة أو السكروز للالحلوة) المواد الكيميائية السيطرة التي تم وصفها جيدا ردع التغذية أو المنشطات في الحشرات.

3. الكهربية (تسجيل غيض 8؛ الشكل 1)

  1. أقطاب الزجاج شكل ميكانيكيا عن طريق سحب الزجاج الشعيرات الدموية. تحسين الحرارة وسحب إعدادات لسحب الزجاج لتشكيل recordi شكل بشكل مناسبأقطاب NG. كسر بعناية قبالة نهاية الزجاج الكهربائي باستخدام ملقط تشريح تحت المجهر لخلق قطب كهربائي طرف فتح التي هي واسعة بما يكفي لالمغلف Sensillum والهدف، ولكن صغيرة بما يكفي لتجنب الاتصال مع الهياكل المجاورة.
  2. تحت المجهر، وتحديد بصريا عن طريق التشكل ووضع الهدف sensilla / Sensillum وللتأكد من التكرار من تسجيل معلومات سرية. الحيوانات الإعدادية للسماح بالوصول الحر إلى sensilla من زاوية دخول القطب.
  3. الحشرات تخدير الكبار الباردة في الثلاجة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. تجنب الأضرار التي لحقت الخلايا العصبية الطرفية عن التعرض المفرط لدرجات الحرارة الباردة. قطع شرائط ضيقة من شريط السلوفان مع شفرة الحلاقة على شريحة زجاجية. شل حشرة كاملة على شريحة زجاجية باستخدام شرائط ضيقة.
  4. أدخل سلك التنغستن شحذ كيميائيا إلى القفص الصدري الظهري أو العين لتكون بمثابة مبال (الأرض) القطب.
  5. ملء الزجاج الكهربائي في الخطوة 3.1 مع حل محفزة للاهتمام. باستخدام حقنة إدراجها، وملء غطاءillary من نهاية سحبت لفظة نهاية. نفض الغبار من جميع فقاعات الهواء، وعقد نهاية سحبت إلى أسفل. إدراج الأسلاك الفضية (chloriding اختياري) في الزجاج الكهربائي في الخطوة 3.1 لتكون بمثابة تسجيل وتحفيز الكهربائي.
  6. توصيل الأقطاب الكهربائية إلى المضخم التي تم تصميمها لتسجيلات من الاتصال sensilla chemoreceptive في الحشرات. وهذا المضخم (300 هرتز، 3 كيلو هرتز ممر الموجة مرشح) تقليل الوقت تسوية للقبض على نشاط الخلايا العصبية أقرب إلى التحفيز مقدمة ممكن. جمع وتخزين وتحليل الإشارات الكهربائية باستخدام الحواسيب الصغيرة مجهزة برنامج تسجيل ارتفاع.
    ملاحظة: الأرضي الإعداد التسجيل بشكل صحيح قد يحسن بشكل كبير نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
  7. تحفيز sensilla مع حل التحكم (المنحل بالكهرباء فقط) لضمان الأداء الوظيفي. عدد المسامير ابتداء من 200 ميللي ثانية بعد قطعة أثرية التحفيز لجميع الاستعدادات.
  8. بطريقة عشوائية ترتيب المواد الكيميائية اختبار لجميع التجارب، باستثناء دراسات الجرعة والاستجابة،للقضاء على التحيز. للدراسات الجرعة والاستجابة، فضح sensilla إلى زيادة تركيزات هذه المادة الكيميائية التجريبية. سماح لا تقل عن 3 دقيقة بين التحفيز لضمان استرداد كاف.
    ملاحظة: قد تختلف هذا الشرط اعتمادا على الحشرات وsensilla. ويعرف عتبة كما أن التركيز الذي لا تتداخل مع الخطأ المعياري الخطأ المعياري للاختبار أقل تركيز.

4. عزل RNA وتسلسلها (الشكل 2)

  1. إعداد المناسب بإحكام المدقات خالية من ريبونوكلياز عن طريق التبريد لهم على الثلج الجاف قبل الأنسجة disruption.Prepare المرافق المدقات خالية من ريبونوكلياز التي تناسب أنابيب غطاء مبكرة بإحكام. حافظ على أنابيب جمع مغلقة ما لم تشريح بنشاط لتجنب تكاثف الزائد.
  2. باستخدام الشافطة تصفيتها، ضع 30 إلى 40 البعوض الباردة تخدير (15 ثانية في الثلاجة -20 درجة مئوية) على خشبة المسرح الباردة والفرز حسب الجنس. مكان الحيوانات الظهرية الجانب السلبي، واستيعاب أجنحة للا ضرر الزوائد الذوق.
  3. باستخدام اثنين من أزواج من ملقط غرامة، تشريح labella الموثوقة أو الرصغي من الذكور أو الإناث تحت المجهر تشريح والحد إدراج الأنسجة المجاورة.
    ملاحظة: 500 labella يقترن ينتج حوالي 800-1،000 نانوجرام من إجمالي مرنا. 400 الرصغي الفردي (5 شرائح لكل منهما) تسفر 1،200-1،800 نانوجرام من إجمالي مرنا.
  4. مع زوج واحد من يلهث-ملقط، فهم طفيفة خرطوم البعوض فقط القريبة إلى labella تعريض قلم دقيق الداخلية. استخدام زوج آخر من جمع-ملقط، إزالة labella وإضافة إلى الأنسجة الجانب من أنبوب جمع البارد.
  5. مع زوج واحد من ملقط، فهم طفيفة في الساق البعوض في تقاطع الساق وأول جزء الرصغي. استخدام زوج آخر من الملقط، وإزالة الرصغي وإضافة إلى الأنسجة الجانب من أنبوب جمع البارد.
    ملاحظة: خذ بعين الاعتبار أنواع الخلايا في واجهة من الأنسجة أراد وغير المرغوب فيها. في حين أنه من المهم للحد من إدراج الأنسجة المجاورة، من المهم أيضا أن لا حذف أجزاء من الأنسجة المطلوب. وفايعينة نال يجب أن تمثل بدقة الجهاز بأكمله من الفائدة. إنشاء حدود الدقيق مع ملقط استيعاب مثل هذا ملقط جمع يمكن تحرير بدقة عن طريق كشط أو الاستيلاء على الأنسجة المطلوب فقط.
  6. دوري، وتدور أسفل أنبوب جمع لفترة وجيزة في 0 ° C الطرد المركزي في 9،000 x ج للحفاظ على الأنسجة في الجزء السفلي من الأنبوب. إذا يتراكم الرطوبة في أنابيب جمع خلال تشريح، إضافة 50uL من كاشف Trizol البارد لتغطية الأنسجة التي تم جمعها.
  7. باستخدام المضادة للطخة مختبر علامة، تسمية بوضوح واحدة خالية من ريبونوكلياز 1.5 مل المفاجئة أنبوب غطاء لكل نوع الأنسجة لجمع. باستخدام 1.5 مل أنبوب رف والنيتروجين السائل، وتجميد ثم طحن الأنسجة الى مسحوق ناعم (القطع الجميلة إذا كان في Trizol). أكرر مرة واحدة. جلب إجمالي حجم Trizol إلى 1 مل و resuspend الأنسجة الأرض من قبل vortexing.
  8. إضافة 200 UL من الكلوروفورم وتخلط جيدا. بعد 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتدور عليها في أجهزة الطرد المركزي في 4 ° C و11،000 x ج لمدة 15 دقيقة. بعنايةإضافة طبقة مائية مباشرة إلى عمود مرشح الحمض النووي الجيني. تدور باستمرار في 11،000 ز س لمدة 5 دقائق. إضافة حجم مساو من ريبونوكلياز خالية الايثانول 70٪ في التدفق من خلال وتخلط بواسطة الماصة. نقل السائل إلى عمود جمع RNA ومواصلة استخراج الحمض النووي الريبي فقا للتعليمات المقدمة.
  9. قياس وتقييم نقاء من إجمالي RNA على معمل الدقة والمضي قدما مع أي وسيلة RNA تسلسل قياسي.

5. الكمي RT-PCR RNA التحقق من صحة التسلسل (الشكل 3)

  1. اختر العديد من الجينات ممكن لمقارنة مستويات التعبير الجيني النسبية على نطاق ديناميكي، سواء في توقع وفرة تسلسل ويفترض وظيفة الجين حسي كيميائي.
  2. أزواج التصميم التمهيدي لكل الجين المستهدف لتضخيم 100-180 basepair PCR منتج معين. استبعاد التضخيم gDNA غير محددة من خلال ضمان التمهيدي واحد على الأقل لكل مجموعة يمتد على الحدود إنترون. بدلا من ذلك، استخدم العلاج الدناز للحد من التلوث الجيني.
  3. جمعالأنسجة الحشرات كما هو موضح في القسم السابق. حساب مقدار الأنسجة هو مطلوب لتوفير ما يكفي من RNA لاستكمال جميع ردود الفعل QRT-PCR.
    ملاحظة: سوف ثلاث نسخ البيولوجي وردود الفعل ثلاث نسخ الفنية توفير أقصى قدر من الثقة في النتائج.
  4. حساب الكمي الجين النسبي كما X الهدف - (ط م [الهدف] -Ct [إشارة]) لكل جينة المستهدفة والمتوسط ​​لكل تكرار، سواء البيولوجية والتقنية. استخدام الجينات التدبير المنزلي (ق) لتطبيع القيم ط بين مكررات البيولوجية وللقضاء على نطاق وY-axis في مقارنات التعبير النسبي.
  5. تقييم تشابه RNA وما يليها ومجموعات البيانات QRT-PCR باستخدام القائمة على الانحدار، التمهيد إجراء التكافؤ 9، تطبيق تكرارا، إلى البيانات من كل الأنسجة.
    ملاحظة: يحدد هذا الإجراء أصغر "المنطقة التشابه" التي يمكن بناؤها حول البيانات RNA تسلسل وQRT-PCR الملحوظ، والسماح للالتعبير الجيني النسبي مقاسا qRT-PCR للنظر يعادل إحصائية لقياس التعبير الجيني النسبي التي كتبها RNA وما يليها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

التسجيلات أثر للإمكانات العمل من عزت. sensilla الذوقية بعوض (الشكل 1) تثبت فعالية التحفيز المباشر مع مجموعة من المواد الكيميائية. هذه التقنية يمكن استخدامها لقياس ردود على أي مادة كيميائية محفزة عن طريق عد المسامير من السعة معين ومدة على نطاق وزمنية معقولة (عادة أقل من 500 مللي ثانية). يجب أن يكون التسجيلات تتبع استنساخه بسهولة في ظل مجموعة معينة من الظروف التجريبية. خلاف ذلك، قد الاستجابات الفسيولوجية لاحظ تمثل الظواهر شائعة بين الأفراد من الأنواع الاختبار.

يتطلب بيانات RNA وما يليها الخام الترشيح ورسم دقيق قبل عرضها كما RPKM مدورة (عدد معين يقرأ في طول كيلو قاعدة من نسخة لكل مليون يقرأ معين) أو FPKM (عدد شظايا قراءة في طول كيلو قاعدة من نسخة لكل مليون يقرأ معين) القيم العددية (الشكل 2). التمييز بينوقد وصفت هذه الأساليب تطبيع يومين RNA وما يليها في عملين المنوية 10،11. ميزة واحدة من إجمالي تسلسل مرنا هي القدرة على الكشف عن التعبير عن الجينات الأسر كبيرة في وقت واحد. العرض المرئي للتعبير عن العديد من الجينات تسمح في آن واحد لفهم فريد من مجموعة أدوات الجزيئية للنسيج معين. مقارنات بين الجنسين، مراحل تطور أو أنواع الأنسجة ويمكن إجراء سريعا.

قد تكون مكررات البيولوجية لمجموعات البيانات-RNA وما يليها محدودة التكلفة أو صعوبة جمع الأنسجة. تقدم QRT-PCR القدرة على التحقق من صحة فرعية صغيرة من إجمالي التعبير الجيني بتكلفة أقل ويتطلب أقل مصدر RNA. جنبا إلى جنب مقارنات البيانات (الشكل 3A) السماح لمزيد من الثقة في النتائج RNA وما يليها، كما طريقتين تعتمد على كيمياء مختلفة لتقدير وفرة الجين. وظائف التكافؤ الإحصائية (الشكل 3B) تظهر حدود اليقين في كل حالة.

الشكل (1)
الشكل 1: التسجيلات الكهربية من sensillum والمتوسطة على labellum من عزت. إناث بعوض أو تعديل من العمل استشهد 12 وتظهر آثار الردود على 100 ​​ملي كلوريد الصوديوم، و 100 ملي السكروز، 1 ملم الكينين، 0.8٪ DEET، 0.8٪ Picaridin، 0.8٪ و 0.8٪ Citronellal IR3535. وصفت المسامير الثلاثة مع اختلاف سعة أو الأشكال أ، ب أو ج. هذه المسامير الثلاثة تتوافق مع ثلاثة أنواع فرعية الخلايا العصبية الحسية مع حساسيات مختلفة: الملح، والسكر، ومريرة، على التوالي.

الشكل 2
الشكل 2: جدول الذوقية التعبير مستقبلات الجينات على النحو الذي يحدده RNA-يليها لمدة 8 عينات الأنسجة، وتعديلها من العمل استشهد 13 خلايا فردية تقريرا القيم RPKM لكل الشرح الجين الذوقية والأنسجة الذكور (يسار) والأنسجة الإناث (يمين). يتم تقريب القيم العددية إلى أقرب عشر. توج للحرارة خريطة كثافة اللون في أعلى RPKM ويتم تحجيم منتصف لكل عائلة الجين بشكل فردي. هناك واحد فقط عائلة الجين هو مبين في هذه الحالة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: مقارنة بين البيانات QRT-PCR RNA والبيانات وما يليها، معدلة من العمل استشهد 13 (A) كل الجينات استقبال كيميائي من المحور الأفقي يمثله أعمدة البيانات اثنين. العمود الأيسر يمثل التعبير النسبي على النحو الذي يحدده-RNA يليها. تم تقسيم القيم RPKM من الجينات استقبال كيميائي من قبل أن من الجينات التدبير المنزلي Aaeg LAsP لتوليد النسب العددية في هذه الأنسجة. الحقالعمود يمثل التعبير النسبي على النحو الذي يحدده QRT-PCR. أولا، تم تطبيع تكرار البيولوجي القيم ط م للجينات labella باستخدام Aaeg LAsP كمعيار. ثانيا، تكرار القيم ط م للاستخدمت كل الجينات لحساب القيم التعبير النسبية (الهدف E - (ط م [الهدف] -Ct [إشارة])). وأشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري للقيم التعبير النسبي المحسوب على حدة. وتمت مقارنة (B) RNA وما يليها وQRT-PCR مجموعات البيانات في تحليل منفصل. المحاور العمودية تمثل وفرة الجين النسبية كما يتبين من البيانات RNA وما يليها، بقيمة 1 تنسب إلى الجينات التدبير المنزلي Aaeg LAsP وجميع التعبير الجيني الآخر يجري ذكرت النسبية لهذه القيمة. المحاور الأفقية تمثل وفرة الجين النسبية كما تنبأ QRT-PCR، بقيمة 1 تنسب إلى الجينات التدبير المنزلي Aaeg LAsP وجميع التعبير الجيني الآخر يجري ذكرت النسبية لهذه القيمة. الخطوط الحمراء تمثل التكافؤ المحدد. الخطوط المتقطعة تمثل حدود "المنطقة التشابه" لمنحدر، وتحسب على أساس خوارزمية التكافؤ الإحصائية 9. خطوط سوداء صلبة تمثل الانحدار المربعات الصغرى من QRT-PCR التكافؤ إلى RNA وما يليها الكمي للجينات المستهدفة 12 و Aaeg LAsP الجينات التدبير المنزلي، يمثل كل نقطة بيانات الدائرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الجانب الأكثر تحديا من إمكانات العمل تسجيل من sensilla ذوقي هو الذي يقرر الردود هي "طبيعية"، وعندما تستخدم Sensillum واحدة الذوقية غيض تسجيل أول مرة لأنواع الحشرات معين، فإن العدد الإجمالي والحساسيات من الخلايا العصبية المستقبلة الذوقية (GRNs) هي غير معروف على الأرجح. ويطلب العديد من التسجيلات الأولية لأول مرة لتحديد المدى وتركيزات المواد الكيميائية لاختبار. في هذا المثال، بدأنا مع ملاحظة أن GRN احد بالرد على تركيزات منخفضة من DEET (الشكل 1). وفي وقت لاحق، درسنا الاستجابات ضمن نفس Sensillum وإلى مجموعة من تركيزات المواد الكيميائية المعروفة لتكون مريرة أو مكره على الحشرات الأخرى، ولاحظ شكل ارتفاع مماثل والسعة (الشكل 1). وتشير هذه الملاحظات أن GRN نوع فرعي واحد يستجيب لهذه المركبات مكره. وعلى سبيل المقارنة، نحن اختبار المركبات السكرية المعروفة لتحفيز التغذية في mosquitoes لمعرفة ما إذا حدث ارتفاع مماثل. لاحظنا مختلفة، ارتفاع أكبر في هذه الحالة. وبالمثل، لاحظنا ذلك، ارتفاع متوسط ​​الحجم الثالث ردا على التحفيز الملح، ليصل بذلك إجمالي عدد GRN النوع الفرعي إلى ثلاثة.

الاستعدادات تسجيل الكهربية في الحشرات متغيرة بطبيعتها. الهدف sensilla الذوقية وعادة ما تكون صغيرة جدا ويجب وضعه في زاوية المناسبة للوصول مع القطب تسجيل دون لمس الزجاج للبشرة. لإنشاء جسر موصل للالخلايا العصبية الذوقية، يجب أن تكون المسام محطة للSensillum ومفتوحة للالليمفاوية الواردة لتأسيس اتصال مباشر مع بالكهرباء القطب تسجيل في. وقد لاحظنا انسداد فتحات sensilla إما عن طريق الحطام أجنبي أو تفرز والمجففة المواد من داخل sensillum والهدف. لتجنب هذه العوائق، يجب توخي الحذر عند التعامل مع وتربية الحشرات لتجنب الاتصال مع sensilla الهدف. بالإضافة إلى تشوالغناء التالفة والحشرات اختبار صحية، والعوامل البيولوجية مثل العمر، والتغذية الدولة، التزاوج يجب أخذها في الاعتبار عند وضع ضوابط للحد من التقلبات في التسجيلات الدولة وzeitgeber الوقت.

قد يكون من الصعب الحصول على إعداد استجابة باستمرار. قد يكون العديد من التجارب ضرورية لتحسين نسبة يكفي الإشارة إلى الضوضاء لحل المسامير على حدة. الاختلافات التجريبية على الاستعدادات المذكورة أعلاه قد يؤدي إلى نتائج أفضل. فإنه من المستحسن لإنشاء استجابة قوية على جهاز التسجيل الخاص بك لأنواع الاختبار الخاصة بك باستخدام المشترك ارتفاع elicitor الحشرات، مثل السكروز أو الكينين. مرة واحدة هو Sensillum والذوقية الاستجابة، وينبغي أن تكون هذه الاستجابات استنساخه. الحد الأدنى للطول الفترة الزمنية بين التحفيز وينبغي أن تحدد تجريبيا دراسة ديناميات ارتفاع في ظل القيود الزمنية المختلفة. وينبغي تجنب التحفيز المفرط للحفاظ على الصحة GRN ومنع تدهور الليمفاوية Sensillum و. في حالة ثاانخفاض حساسية ر استجابة بسرعة بعد التحفيز الأولى، يجب الحصول على عدد أكبر من محضرات لتوفير الثقة بأن هذه الاستجابات هي نموذجية من الناحية الفسيولوجية لنوع معين.

ذوبان بعض المواد الكيميائية اختبار يمكن أن تخلق صعوبة في تحفيز كهربائي، حيث أن بعض المذيبات قد تؤثر على النشاط GRN، وحتى بتركيزات منخفضة النهائية. ويمكن معالجة هذه الاعتبارات من خلال التجربة والخطأ ومع الضوابط المناسبة. يجب إضافة أي مذيب يستخدم لالمنحل بالكهرباء السيطرة وحلول اختبارات أخرى لضمان اتساق الاستجابات. الحشرات الصغيرة شل حركة، وبالتالي توفير إمكانية الوصول المباشر لاستهداف sensilla دون الإضرار الأنسجة الهشة، قد تتطلب التجربة والخطأ.

الحد الرئيسي للالكهربية هو فصل المؤسف الردود العصبية الملحوظة والاستجابات السلوكية المصب المحتملة. لذلك، فإنه من المفيد لاختبار الردود على المواد الكيميائية التي لبأظهرت التابعين لانتزاع استجابات سلوكية معينة من أجل مناقشة أهمية النتائج في سياق البيئي. تسجيلات تلميح تسمح لكشف دقيق جدا من النشاط الخلوي، مما يجعل هذه التقنية مثالية لتقييم الحيوانات المعدلة وراثيا أو تلك واظهار الاختلافات المظهرية في السلوك. كما تقدم هذه التسجيلات مزيد من المعلومات حول الاستجابات العصبية، مثل ديناميات الزمنية والسعة، من أنظمة الاعتماد على صحفيين البصري للنشاط الخلايا العصبية. في بعض الحالات، والاستجابات العصبية يمكن كميا بسهولة أكثر من البيانات السلوكية (12).

جمع الأنسجة لRNA وما يليها وQRT-PCR واضح ومباشر ولكنها تتطلب التركيز المستمر والانتباه إلى الحفاظ على المواد الخلوية من خلال التخزين البارد وتجنب الرطوبة الزائدة. النشاط ريبونوكلياز يمكن أن تؤثر على نوعية الحمض النووي الريبي. لذلك يجب الأنسجة فقط الاتصال السطوح النظيفة في جميع أنحاء جمع واستخراج الحمض النووي الريبي. على الرغم من أن استكشاف الأخطاء وإصلاحها مطلوب لQRT-PCR طق موثقة جيدا، تحدث مطبات على الأرجح في وقت مبكر من العملية عند تصميم الاشعال واختيار الهدف والتدبير المنزلي الجينات. الجينات التي تمثل متوقع نقاط متباعدة بشكل متساو على طول خط مستوى التعبير النسبي مفيدة لمقارنة الحمض النووي الريبي يليها ومجموعات البيانات QRT-PCR (الشكل 3). على سبيل المثال، اختيار الجينات لQPCR التي تظهر القيم RPKM 0، 10، 20، 30، الخ، على التوالي، وتقديم نظام يمكن التنبؤ به من وفرة لفحصها.

كان RNA-يليها ناجحة إلى تسليط الضوء على متواضع التعبير عن الجينات في استطلاعنا الأنسجة الذوقية (الشكل 2). وبناء الجين يمكن الاعتماد عليها لعزت. جعلت بعوض (AaegL1.3، http://aaegypti.vectorbase.org/GetData/Downloads/) واستقبال كيميائي مسبق الجين تحديد 14 سجل التعبير الجيني سهلة نسبيا. لهذه الأغراض، والحشرات مع شروح الجين المتاحة وعائلات الجينات التي تم تحديدها من الفائدة هي أنظمة نموذج القيمة. تحديد عتبة دقيقةللتعبير الجينات مقابل الضوضاء في الخلفية هو المضاربة، ولكن طرق تحديد انقطاع معقولة متاح 15-17. نحن هنا تحديد مستوى RPKM الثقة كاملة وعلى مستوى RPKM أقل من الثقة انخفض على أساس سابقة 9 ونحن هنا مؤطرة مناقشتنا للنتائج.

في المستقبل، فإننا نأمل أن تشريح الأنسجة حسي كيميائي أخرى في كل من البعوض وغيرها من الحشرات الهامة اقتصاديا لتوسيع معرفتنا الجينات التوسط الحشرات صد. وقد أقمنا عدة جينات الذوقية المرشح التي هي الأكثر احتمالا التوسط الردود على المركبات مكره بمقارنة تسلسل الجيني لأنواع البيانات الوظيفية المتاحة مع 13. نحن توليد خطوط المعدلة وراثيا من البعوض في عداد المفقودين هذه الجينات حسي كيميائي الفردية. سوف نستخدم تسجيلات تلميح إلى تقييم دور هذه الجينات على قدرة الحيوان للكشف عن المواد الطاردة للتعرف وتقييم الاستجابات السلوكية لهذه المسوخ لrepellents. في المثال أن هذه الجينات مرشح لا تؤثر بشكل كبير صد، قد تكون أكثر القرار اللازم لتحديد أكثر دقة التعبير الجيني أو وجود البروتين في sensillum واحد أو خلية. متواضع المستقبلات التي أعرب عنها قد تكون أهدافا حاسمة لفحص المواد الطاردة للرواية، جنبا إلى جنب مع وأعرب بتواجد مطلق شارك في مستقبلات. لسوء الحظ، الموقع التهجين وimmunolocalization في وقد ثبت من الصعب بشكل لا يصدق في الأنسجة الذوقية الحشرات 18.

بعد أن نكون قد أنشئت الجينات التي تتوسط هذه الاستجابات الفسيولوجية والسلوكيات، ونحن قد التعبير عن هذه الجينات في أنظمة الخلية التي هي قابلة للالإنتاجية العالية فحص المواد الطاردة للمرشح. في النهج سيليكون والتي تستخدم النمذجة الهيكلي 7 مايو أيضا أن تكون مفيدة في التنبؤ أي نوع من أنواع المركبات سوف تثير ردود قوية من مستقبلات محددة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass capillary A-M Systems 628000 Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4"
Silver wire A-M Systems 7875 .015" bare
Tungsten wire Alfa Products 369 0.127 mm diameter
Fine forceps Fine Science Tools 11252 #5SF Inox
Refridgerated stage BioQuip Products 1429 Chill Table
Preamplifier Syntech Taste Probe preamplifier
Software for electrophysiology Syntech Autospike software for electrophysiology
TetraMin fish food Tetra Tropical fish food granules fish food ground to fine powder
TRIzol Life Technologies 15596-026 RNA isolation reagent
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74136 includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns
Nanodrop spectrophotometer Nano Drop Products ND-1000 tabletop spectrometer
R statistics freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka) www.r-project.org Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment.
1.5 ml tube rack Evergreen 240-6388-030 Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue.
1.5 ml collection tubes with pestle Grainger 6HAX6 RNase free
Centrifuge Thermo Scientific 11178160 Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube.
Primer-BLAST Primer Designing tool NCBI n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klun, J. A., Khrimian, A., Debboun, M. Repellent and deterrent effects of SS220, picaridin, and DEET suppress human blood feeding by Aedes aegypti, Anopheles stephensi, and Phlebotomus papatasi. J. Med. Entomol. 43 (1), 34-39 (2006).
  2. Dickens, J. C., Bohbot, J. D. Mini review: Mode of action of mosquito repellents.Pestic. Biochem. Physiol. 106 (3), 149-155 (2013).
  3. Pitts, R. J., Rinker, D. C., Jones, P. L., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Transcriptome profiling of chemosensory appendages in the malaria vector Anopheles gambiae reveals tissue- and sex-specific signatures of odor coding. BMC Genomics. 12 (271), (2011).
  4. Zhou, X., Slone, J. D., Rokas, A., Berger, S. L., Liebig,, et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLOS Genet. 8 (8), e1002930 (2012).
  5. Shiao, M., Fan, W., Fang, S., Lu, M. J., Kondo, R., Li, W. Transcriptional profiling of adult Drosophila antenna by high-throughput sequencing. Zoological Studies. 52 (42), (2013).
  6. Bohbot, J., Pitts, R. J., Kwon, H. W., Rützler, M., Robertson, H. M., Zwiebel, L. J. Molecular characterization of the Aedes aegypti odorant receptor gene family. Insect Mol. Biol. 16 (5), 525-537 (2007).
  7. Kain, P., Boyle, S. M., Tharadra, S. K., Guda, T., Pham, C., et al. Odour receptors and neurons for DEET and new insect repellents. Nature. 502 (7472), 507-512 (2013).
  8. Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. The physiology of a primary chemoreceptor unit. Science. 122 (3166), 417-418 (1955).
  9. Robinson, A. P., Duursma, R. A., Marshall, J. D. A regression-based equivalence test for model validation: shifting the burden of proof. Tree Physiol. 25 (7), 903-913 (2005).
  10. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-seq. Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
  11. Trapnell, C., Williams, B. A., Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).
  12. Sanford, J. L., Shields, V. D. C., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Naturwiss. 100 (3), 269-273 (2013).
  13. Sparks, J. T., Vinyard, B. T., Dickens, J. C. Gustatory receptor expression in the labella and tarsi of Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 43 (12), 1161-1171 (2013).
  14. Kent, L. B., Walden, K. K. O., Robertson, H. M. The Gr family of candidate gustatory and olfactory receptors in the yellow-fever mosquito Aedes aegypti. Chem. Senses. 33 (1), 79-93 (2008).
  15. Ramsköld, D., Wang, E. T., Burge, C. B., Sandberg, R. An abundance of ubiquitously expressed genes revealed by tissue transcriptome sequence data. PLoS Comput. Biol. 5 (12), e1000598 (2009).
  16. Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. A model based criterion for gene expression calls using RNA-seq data. Theory Biosci. 132 (3), 159-164 (2013).
  17. Hart, T., Komori, H. K., LaMere, S., Podshivalova, K., Salomon, D. D. Finding active genes in deep RNA-seq gene expression studies. BMC Genomics. 14 (778), (2013).
  18. Isono, K., Morita, H. Molecular and cellular designs of insect taste receptor system. Front. Cellu. Neurosci. 4 (20), 1-16 (2010).

Tags

علم الأحياء الجزيئي، العدد 94، ذوق حاسة، الحشرات،
الفسيولوجية تسجيلات وRNA تسلسل الزوائد ذوقي من البعوض الحمى الصفراء<em&gt; الزاعجة المصرية</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sparks, J. T., Dickens, J. C.… More

Sparks, J. T., Dickens, J. C. Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (94), e52088, doi:10.3791/52088 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter