Physiologiques Recordings et ARN séquençage des annexes gustatives du Mosquito fièvre jaune Aedes aegypti

Résumé

L'utilisation de deux méthodes pour estimer l'expression des gènes dans les grands appendices gustatives de Aedes aegypti, nous avons identifié l'ensemble des gènes sous-jacents supposément les réponses neuronales à des composés amers et de répulsion, comme déterminé par l'examen électrophysiologique.

Résumé

L’enregistrement électrophysiologique des potentiels d’action des neurones sensoriels des moustiques donne aux chercheurs un aperçu de la perception chimique de ces vecteurs de maladies. Nous avons récemment identifié un neurone sensible amer dans le labelle d’Aedes aegypti femelle qui répond au DEET et à d’autres répulsifs, ainsi qu’à la quinine amère, par une investigation électrophysiologique directe. Ces réponses neuronales des récepteurs gustatifs ont incité notre séquençage de l’ARNm total à partir d’échantillons de labelles et de tarses mâles et femelles afin d’élucider les gènes chimiorécepteurs présumés exprimés dans ces tissus de chimioréception de contact. Les échantillons de tarses ont été divisés en sous-types pro-, méso- et métathoraciques pour les deux sexes. Nous avons ensuite validé notre ensemble de données en effectuant une qRT-PCR sur les mêmes échantillons de tissus et utilisé des méthodes statistiques pour comparer les résultats entre les deux méthodes. Les études portant sur la fonction moléculaire peuvent maintenant cibler des gènes spécifiques pour déterminer ceux impliqués dans la perception répulsive par les moustiques. Ces voies réceptrices peuvent être utilisées pour cribler de nouveaux répulsifs afin de perturber le comportement de recherche d’hôte afin de freiner la propagation de virus nocifs.

Introduction

Il a été démontré composés comme DEET, Picaridin, Citronellal et IR3535 pour repousser efficacement les moustiques, y compris les vecteurs de maladies importantes Aedes aegypti ^1,2. Nous enregistrons des potentiels d'action des neurones sensoriels associés à gustative sensilles spécifique pour déterminer les cellules impliquées avec moustiquaire répulsion. Couplé avec le séquençage aval des gènes exprimés dans ces tissus, nous pouvons identifier les gènes les plus susceptibles médiation des réponses de ces cellules afin de dépister de nouveaux composés pour l'amélioration des capacités de répulsion.

ARN-Seq est....

Protocole

1. Elevage Ae. aegypti adultes

1. Les œufs éclosent en environ ¾ pouce d'eau dans le bac peu profond. La surpopulation va réduire la taille des adultes.
2. Larves arrière à 25 ° C (12 hl: 12-HD) et nourrir avec de la nourriture du poisson de fond.
   NOTE: La suralimentation peut réduire les taux de survie.
3. Retirer pupes individuellement par pipette Pasteur quotidienne et transfert à des plats en plastique (9 cm x 5,5 cm) à l'intérieur de petits seaux de confinement avec de fines couvercles de maille, établissant ainsi 24 groupes d'âge h.
4. moustiques adultes Feed solution à 10% de saccharose par le coton ball....

Résultats

Les enregistrements des traces de potentiels d'action Ae. aegypti sensilles gustatives (Figure 1) démontrer l'efficacité de la stimulation directe avec une gamme de produits chimiques. Cette technique peut être utilisée pour quantifier les réponses à tout produit chimique stimulant en comptant les pointes d'une amplitude et la durée donnée sur une plage de temps raisonnable (généralement moins de 500 ms). enregistrements de trace doivent être facilement reproductibles dans un ensemble donné de .......

Discussion

L'aspect le plus difficile de potentiels d'action d'enregistrement de sensilles gustative est de décider lequel des réponses sont «normal». Lorsque l'on utilise seule pointe de sensille gustative l'enregistrement de la première fois pour une espèce d'insectes donnés, le nombre et la sensibilité des neurones récepteurs gustatifs totale (GRNS) sont probablement inconnu. De nombreux enregistrements préliminaires doivent d'abord décider de la gamme et les concentrations de produits chimiques à te.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Capillaire en verre	A-M Systems	628000	Standard, 1,5 mm X 0,86 mm, 4"
Fil argenté	A-M Systems	7875.015	»
Fil de tungstène	Alfa Products	369	0,127 mm de diamètre
Pince fine	Outils de science	fine 11252	#5SF Inox
Platine réfrigérée	BioQuip Products	1429	Chill
Préamplificateur	Préamplificateur Syntech	Taste Probe
Logiciel pour l’électrophysiologie	Logiciel Syntech	Autospike	pour l’électrophysiologie
TetraMin Nourriture pour poissons	Tetra	Tropical Nourriture pour poissons granulés Nourriture	pour poissons broyée en poudre fine
TRIzol	Life Technologies	15596-026	Réactif d’isolement d’ARN
RNeasy Plus Le Mini Kit	Qiagen	74136	comprend un éliminateur d’ADNg et des colonnes de spin RNeasy
Spectrophotomètre Nanodrop	Produits Nano Drop Spectromètre	table	ND-1000
R statistiques	freeware (créé par Robert Gentleman et Ross Ihaka)	www.r-project.org	Utilisez la fonction lm du package stats et la fonction equiv.boot du package d’équivalence dans l’environnement informatique R.
Support de tube de 1,5 ml	Evergreen	240-6388-030	Versez de l’azote liquide dans quelques puits vides pour congeler et broyer les tissus.
Tubes de prélèvement de 1,5 ml avec pilon	Grainger	6HAX6	Centrifugeuse sans RNase
	Thermo Scientific	11178160	Faites tourner le tissu congelé pour le conserver au fond du tube de 1,5 ml.
Primer-BLAST Primer Outil de conception	NCBI	n/a

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