Summary
الهدف من هذا العرض هو إظهار المجراة في تقنيات المختبر للتربية النيماتودا الممرضة للحشرات. في الجسم الحي أساليب تعتبر تربية هذه الديدان الخيطية مع مضيف الحشرات، في حين أن وسائل الإعلام تستخدم في المختبر أجار الغنية.
Abstract
النيماتودا الممرضة للحشرات (EPN) (Steinernematidae وHeterorhabditidae) لديها شراكة المنفعة المتبادلة مع سلبية الغرام غاما Proteobacteria في الأسرة ترتبط البكتيريا المعوية. Xenorhabdus مع steinernematids النيماتودا بينما Photorhabdus هي المتكافلة من heterorhabditids. معا الديدان والبكتيريا تشكل مجمع الحشرات قوي أن يقتل مجموعة واسعة من أنواع الحشرات في شراكة حميمة ومحددة. هنا، علينا أن نظهر في الجسم الحي وتقنيات المختبر التي يشيع استخدامها في تربية هذه الديدان الخيطية تحت ظروف المختبر. وعلاوة على ذلك، هذه التقنيات تمثل الخطوات الأساسية لإنشاء الناجح الثقافات EPN وتشكل أيضا الأساس لاختبارات بيولوجية الأخرى التي تستخدم هذه الكائنات للبحث. إنتاج aposymbiotic الديدان الخيطية (خالية من المتكافل) هو أمر حاسم لمتعمق ونهج متعدد الأوجه لدراسة التعايش في كثير من الأحيان. هذالا يتطلب بروتوكول إضافة المضادات الحيوية ويمكن تحقيقه في فترة قصيرة من الوقت مع المعدات المختبرية القياسية. الديدان الخيطية تنتج في هذه الطريقة غير قوية نسبيا، على الرغم من البقاء على قيد الحياة في التخزين قد تختلف تبعا للأنواع المستخدمة. التقنيات بالتفصيل في هذا العرض تتوافق مع تلك التي وصفها العديد من الكتاب وصقلها من قبل مختبر P. المالية، وجامعة أريزونا (توكسون، أريزونا، الولايات المتحدة الأمريكية). هذه التقنيات تختلف من الجسم من التقنيات التي تستخدم في الإنتاج الضخم من هذه الكائنات لأغراض إدارة الآفات.
Introduction
النيماتودا الممرضة للحشرات (EPN) Steinernema وHeterorhabditis النيابة. وتعتبر (Steinernematidae، Heterorhabditidae) والمتكافلة تلك البكتيريا، Xenorhabdus وPhotorhabdus النيابة (المعوية) نموذج الأرضي الناشئة من الحيوانات ميكروب العلاقات التكافلية 2-4،6،10،19. Xenorhabdus وPhotorhabdus النيابة. وآوى والمتكافلة في الأمعاء للمرحلة الحرة الحية الوحيدة من الديدان الخيطية، والمعروف أيضا باسم الأحداث عدوى (IJ) أو المرحلة الثالثة 3 المعدية الأحداث 8،10،13. الزوج بكتيريا-النيماتودا الممرضة هو لمجموعة واسعة من الحشرات وتمت بنجاح تم تنفيذها في المكافحة البيولوجية وبرامج الإدارة المتكاملة للآفات في جميع أنحاء العالم 6،8.
هنا نعرض مجموعة مختارة من المجراة في تقنيات المختبر التي كثيرا ما تمارس لتربية EPN تحت ظروف المختبر. Iن الأساليب فيفو تفكر مضيف الحشرات للتربية من الديدان الخيطية. عادة، تعتبر مراحل غير ناضجة من مختلف أوامر الحشرات (أي قشريات الجناح، مغمدات الأجنحة، ذوات الجناحين، الخ.) تستضيف مناسب. في الجسم الحي عادة ما تعتبر وسائل لصيانة الثقافات الخيطية في المختبر. هذه الطريقة قد لا تكون مناسبة عند النظر في الإنتاج الضخم من الديدان الخيطية. قد تكون هناك حاجة كميات كبيرة من المضيفين الحشرات لهذا الغرض تطالب بالمزيد من الوقت والتكاليف الإضافية المتعلقة تربية الحشرات.
ويمكن أيضا النيماتودا الممرضة للحشرات يتم تربيتها في المختبر على عدة وسائل الاعلام. اعتمادا على الهدف من الدراسة؛ في أساليب المختبر أو قد ينظر في إدراج البكتيريا التكافلية في وسائل الإعلام. في هذا العرض، ونحن تصف طريقتين تستخدم عادة لنشر EPN. المكونات وسائل الإعلام توفر مصدرا من المواد المغذية للبكتيريا التكافلية لالثانية مصدر للستيرول الديدان الخيطية. في المختبر أساليب توفر ميزة تربية EPN دون مضيف الحشرات.
في الأصل، تم استخدام العديد من وسائل الإعلام المتقدمة في المختبر لتكاثر الحشرات EPN عندما يستضيف مناسبة غير متوفرة. ومع ذلك، على مدى السنوات الماضية، وأصبحت في المختبر أساليب تربية المستخدمة على نطاق واسع في الأبحاث التي تهدف إلى فهم العلاقة بين المنفعة المتبادلة EPN والبكتيريا التكافلية 17،19.
التقنيات بالتفصيل في هذا العرض تتوافق مع تلك التي وصفها العديد من الكتاب وصقلها من قبل مختبر المالية، جامعة أريزونا (توكسون، أريزونا، الولايات المتحدة الأمريكية). هذه التقنيات تختلف من الجسم من التقنيات التي تستخدم في الإنتاج الضخم من هذه الكائنات لأغراض إدارة الآفات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. في الجسم الحي من تربية الديدان الخيطية الممرضة مع البكتيريا التي Symboitic
- عكس 100 × 15 مم البلاستيك طبق بتري ووضع قرصين من ورق الترشيح (90 ملم) في غطاء الطبق.
- بالتساوي توزيع 1 مل من IJ (الأحداث المعدية) تعليق الماء (بتركيز 1،000-2،000 IJ / مل) على ورقة الترشيح.
ملاحظة: نقابة الصحفيين العراقيين لا تحتاج إلى أن تكون تعقيم السطح. - إضافة 10 مشاركة الطور اليرقات من أكبر waxmoth غاليريا mellonella إلى الطبق. الهدف هو توفير حوالي 100-200 نقابة الصحفيين العراقيين / يرقة.
- تغطية غطاء مع الجزء السفلي من طبق بيتري (الشكل 1) وتسمية طبق بيتري. ذكر المعلومات التالية: اسم الأنواع الخيطية (إذا كان معروفا). عزل كود / التعيين. تم تعيين فخ الإصابة التاريخ.
- وضع الطبق داخل كيس من البلاستيك مختوم فضفاضة (للحفاظ على الرطوبة) وابقائه في الظلام إما في درجة حرارة الغرفة أو في حاضنة بين 20-25 ° C. تحقق من الأطباق يوميا
ملاحظة: الظلام يسهل عدوى الديدان الخيطية، لأنه يحاكي ظروف العدوى الطبيعية في التربة. - بعد 3-5 أيام، وإزالة الجثث مع وجود علامات للعدوى الديدان الخيطية إلى فخ أبيض تعديل 7.
ملاحظة: إذا كانت الجثث رائحة عفنة، وهذا قد يكون مؤشرا على أن زراعة لم تكن ناجحة و / أو كانت هناك تلوث. وضع غرفة عدوى جديدة مع دفعة جديدة من الديدان والحشرات.
2. في المختبر تربية الديدان الخيطية الممرضة مع البكتيريا التكافلية التي
- الكبد الكلى آجار الطريقة 9،19
- ختم الكبد والكلى الى قطع صغيرة (2 سم 3 أو أصغر) ومكان في الخلاط مع كلوريد الصوديوم، أجار و 300 مل من الماء ويمزج حتى يصبح اللحم اللب السائل ومعجون سميك أو هريس. ثم، ونقل الخليط إلى قارورة 1 لتر مخروطي.
- إضافة النهائية 200 مل من الماء في وعاء الخلاط وصب أي وسائط المتبقية فيقارورة مخروطي. الأوتوكلاف لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية. بعد التعقيم تسمح أجار لتهدئة لمسة قبل صب.
ملاحظة: لا ينصح pipetting لمتوسطة المتوسطة لأن هذا يميل إلى أن يكون قطع من اللحم. - صب ~ 20 مل من أجار على (5 أو 6) سم أطباق بتري مع التحريك باليد أو يحوم قارورة مخروطي بين يصب لوسائل الإعلام أكثر تجانسا. السماح للأجار ليصلب وأطباق تخزينها في 4 درجة مئوية لحين الحاجة إليها
ملاحظة: استخدام ملعقة معدنية تعقيم اللهب لتفريق أي أجزاء كبيرة من اللحوم تصب في طبق بتري.
- الدهون آجار الطريقة 9،19
- تعد الدهون أجار المتوسطة عن طريق خلط معا مرق المغذيات، وأجار مستخلص الخميرة ويسكب المزيج في قارورة 2 لتر مخروطي. إضافة المقطر H 2 O وMgCl 2 • 6H 2 O والأوتوكلاف لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية.
- إضافة مزيج عقيمة من الذرة مزيج النفط وشراب الذرة ويحرك أو دوامة بقوة وغالبا لتفريق قطرات النفط بالتساوي.
- صب ~ 20 مل أجار على بعد 5 (أو 6) سم أطباق بتري والسماح أجار ليصلب وأطباق تخزينها في 4 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.
- سلسلة انتصارات المطلوب البكتيريا التكافلية على طبق الدهون أجار واحتضان لوحات عند 28 درجة مئوية لمدة 24-48 ساعة.
ملاحظة: انتشار 100-200 ميكرولتر من بين عشية وضحاها (12-16 ساعة) LB ثقافة فرعية. - في اليوم التالي، تضيف نحو 0.4 مل من سطح تعقيمها الخيطية تعليق (البيض أو الأحداث المعدية)، واحتضان لوحات في درجة حرارة الغرفة في الظلام أو في حاضنة عند 22 ± 3 درجة مئوية.
ملاحظة: عدم إضافة أكثر من 0.4 مل من الديدان الخيطية تعليق لأنها يمكن أن تخلق بيئة رطبة بشكل مفرط التي هي غير مواتية لنمو النيماتودا. - مراقبة الثقافات يوميا. يجب الثقافات إنتاج جيل جديد من نقابة الصحفيين العراقيين في حوالي 12 يوما (الشكل 2).
- نقل الطبق السفلي مع أجار عندما ينظر الديدان الخيطية الزحف جانبي الطبق (الشكل 3A) إلى فخ أبيض تعديل (انظر أوروزكو وآخرون 12) لحصاد نقابة الصحفيين العراقيين (الشكل 3B). تنفيذ هذه الخطوة تحت غطاء تدفق الصفحي للحد من التلوث من وسائل الإعلام.
- جمع نقابة الصحفيين العراقيين من فخ أبيض تعديل على ظهور وشطف IJ تعليق لإزالة أي حطام المتوسط. متجر IJ في الماء المقطر المعقم في 10 ° C (في حاضنة درجة الحرارة الباردة أو غرفة باردة) أو استخدامها على الفور إذا لزم الأمر.
ملاحظة: اعتمادا على الهدف من الدراسة، البذور لوحات مع المستعمر إما المتكافل أو aposymbiotic الديدان الخيطية.
3. في المختبر تربية Aposymbiotic (خالية من المتكافل) نيماتودا الممرضة
- تصيب 10-20 G. mellonella اليرقات مع نقابة الصحفيين العراقيين من الأنواع الخيطية المطلوب (انظر القسم 1). بعد 3 أو 4 أيام (في هذا الوقت يجب أن نقابة الصحفيين العراقيين قد نضجتللبالغين الجيل الأول) جمع الجثث.
ملاحظة: حان الوقت لنضج وعدد الإناث اللازمة للحصول على عدد كاف من البيض سوف تختلف حسب الأنواع. تصيب أكثر G. mellonella اليرقات إذا لزم الأمر والبدء في تشريح في وقت مبكر من 48 ساعة بعد العدوى لتقييم ما إذا كانوا في مرحلة التطوير المناسبة. - وضع كل جثة على حدة في طبق بيتري مع محلول ملحي (M9 عازلة 18). تشريح الجثة عن طريق سحب الرأس مع ملقط غيض غرامة.
- جمع لا يقل عن 20 حبلي (مع البيض داخل) إناث مع إبرة رفيعة (L-شكل يفضل) ووضعها في كوب الساعات تحتوي على 10 مل من M9 عازلة (الشكل 4A).
- إعداد الحل axenizing من خلال النظر في المكونات التالية: 6.75 مل من الماء المقطر، 1.25 مل 5 N هيدروكسيد الصوديوم، و 2.25 مل من محلول التبييض المخفف متوفرة تجاريا إلى 3٪ هيبوكلوريت.
ملاحظة: هيدروكسيد الصوديوم هو جزء أساسي حل قفازات ونظارات واقية وغيرها من التدابيروينبغي ارتداء الملابس.
ملاحظة: يعد حل axenizing جديدة في كل مرة، كما يحط التبييض في الضوء. إعداد عدة دفعات من حل axenizing وإجراء التعقيم السطحية وحصاد البيض في الساعات النظارات متعددة. - شطف الإناث على الأقل ثلاث مرات مع العازلة M9 ملء الزجاج ووتش مع حل العازلة وامتصاص ما يصل عازلة مع ماصة. تأكد تبقى الإناث في الزجاج ساعة. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين.
- على الفور إضافة محلول axenizing والسماح للإناث بالبقاء في هذا الحل لمدة لا تتجاوز 10-15 دقيقة. مراقبة الأنسجة الخيطية بدأت تتفكك بينما تبقى البيض (التي تقاوم الحل axenizing) سليمة.
- تعطيل يدويا أجساد النساء لتسريع هذه العملية، بالقص مع إبرة أو مشرط (الشكل 4B، C). إزالة البيض من قبل pipetting لهم في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge، وتجنب إضافة أي أنسجة غير منحل.
ملاحظة: استخدام ومأي أنابيب microcentrifuge عند الضرورة لجمع البيض ويعمل بسرعة، حيث أن صلاحية البيض سينخفض على مدى فترة طويلة من التعرض للحل axenizing. - دوامة الأنابيب لمدة 15 ثانية باستخدام "إعداد سرعة عالية" لمواصلة إزالة الأنسجة الخيطية التي تعلق على البيض. بدلا من ذلك، إذا دوامة غير متوفرة، الماصة صعودا وهبوطا الحل عدة مرات.
- البيض بيليه بواسطة الطرد المركزي في حوالي 18،000 ز لمدة 2 دقيقة. زيادة السرعة إذا لم تفعل البيض بما فيه الكفاية بيليه. إزالة حل axenizing وشطف مرتين عن طريق ملء أنبوب microcentrifuge مع الماء المقطر المعقم وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 900 x ج لمدة 1 دقيقة.
- بعد غسل الماضي، و resuspend البيض في 300-500 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم ووضعها في العقيمة 3 سم طبق بتري أو المشاهدة زجاج معقمة. تذكر أن البيض هي الآن تعقيم السطح، وذلك باستخدام ماصات معقمة و / أو نصائح pippetter والمياه للحفاظ على نظافة البيض.
- فحص البيض تحت مجهر تشريح (30-50X التكبير) لتأكيد أنها سليمة (الشكل 4D) ونقلها الى 5 سم لوحة مع أجار الكبد الكلى (انظر القسم 2.1)
ملاحظة: عدم إضافة أكثر من 400 ميكرولتر من تعليق بيضة على لوحات لأنها سوف تجعل آغار الرطب بشكل مفرط. - لوحات التسمية مع المعلومات المناسبة وتخزينها تستقيم في الظلام عند 28 درجة مئوية. يجب الفقس من البيض يكون بين عشية وضحاها واضح.
ملاحظة: قد تتكثف المياه على غطاء الطبق ولكنها سوف تتبخر بعد 1 أو 2 يوما. في هذا الوقت، وضع الطبق في كيس من البلاستيك على الاحتفاظ بالرطوبة من أجار وتجنب التجفيف لها. - مراقبة أطباق دوري وتجاهل أي الأطباق التي تظهر علامات فطرية أو التلوث الجرثومي. مرة واحدة وتعتبر نقابة الصحفيين العراقيين المهاجرة يصل جدار طبق بيتري، وإزالة الغطاء ونقل الطبق السفلي مع أجار إلى فخ أبيض تعديل 12. النظر في ظروف معقمة عند نقل الطبق في modifieد فخ الأبيض لتجنب تلوث وسائل الإعلام تتعرض لها.
- مواصلة رصد الفخاخ الابيض والحصاد IJ حسب الحاجة.
ملاحظة: سوف تستمر الديدان الخيطية Aposymbiotic للهجرة في الماء من فخ الأبيض لعدة أيام وحتى أسابيع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يستخدم في الجسم الحي طريقة تربية الحشرات الحية بصفتها الدولة المضيفة للنمو وتكاثر الديدان الخيطية. غرف العدوى هي وسيلة فعالة لتعريض الحشرات نقابة الصحفيين العراقيين. هذه هي المرحلة الوحيدة في دورة حياة الديدان الخيطية "التي ناقلات للالمتكافلة البكتيرية من المضيف حشرة واحدة إلى أخرى. يبين الشكل 1 وانشاء لغرفة العدوى وكذلك المواد اللازمة لبناء هذه القاعة. في المختبر أساليب تربية تسمح EPN أن ينمو دون مضيف الحشرات ولكن يتم تنفيذها أيضا لتربية aposymbiotic الديدان الخيطية (خالية من المتكافل). الشكل 2 يظهر لوحة أجار الدهون مع مراحل مختلفة النيماتودا. ويمكن أيضا النظر لوحات أجار الدهون في الاختبارات عبر التهجين وهي مطلوبة للتحقق من صحة هوية النيماتودا على أساس مفهوم النوع البيولوجي. طريقة أجار الكلى الكبد وصفت في الأصل من قبل Poinar وتوماس (1966) 14. هذا الأسلوب يسمح للالنيماتودا إلى أن تنضج وreproducالبريد دون مضيف الحشرات ويمكن استخدامه لالديدان الخيطية الخلفية دون البكتيريا التكافلية لهم (أي إنتاج الديدان الخيطية aposymbiotic). عيوب هذه الطريقة هو أنه عرضة للتلوث بسبب طبيعتها الغنية، مما يسمح للبكتيريا أو الفطريات غير المرغوب فيها لتنمو. ويبين الشكل 3A لوحات أجار الكبد الكلى مع نقابة الصحفيين العراقيين الزحف على جانب من اللوحة. في هذه المرحلة يمكن تحويل الجزء السفلي من طبق بيتري إلى فخ أبيض تعديل. الشكل 3B يدل على لوحة الكبد الكلى مع الديدان الخيطية Steinernema في فخ أبيض تعديل لحصاد نقابة الصحفيين العراقيين ذرية الشكل 4A. يظهر الزجاج ووتش مع حبلي الإناث Steinernema قبل axenization بهم. يعرض الشكل 4B تعطل الإناث مع إبرة تشريح. الشكل 4C معارض تعطلت الإناث في حل axenizing. الشكل 4D معارض بيضة سليمة من الديدان الخيطية Steinernemوcarpocapsae.
الرقم 1. مجموعة تتكون من حجرة العدوى في الجسم الحي لتربية EPN. الصف العلوي يظهر ورقة 5 سم طبق بتري والتصفية. يعرض الصف السفلي طبق ورقة فلتر 10 سم بيتري. عدد إشعار يرقات الحشرات تضاف إلى كل غرفة العدوى.
الشكل 2. الدهون طريقة للأجار في المختبر تربية EPN. تظهر الصورة على المتابعة وثيق (20X التكبير) من صحن مع الديدان الخيطية الكبار النامية على المدى المتوسط.
الرقم 3. الكبد، الكلى أجار لوحة ويظهر صورة وعلى اليسار طبق مع النمو الناجح من الديدان الخيطية. تلاحظ الديدان الخيطية الزحف على جانب الطبق. صورة B يظهر لوحة أجار الكبد الكلى وضعها في فخ أبيض تعديل لحصاد الديدان الخيطية IJ.
الرقم 4. الزجاج ووتش مع الإناث الحاملة للبيض في axenizing الحل. يظهر صورة والإناث الحاملة للبيض في حل axenizing. صورة B يظهر طحن الإناث مع إبرة تشريح. يعرض صورة C عطلت الإناث. يظهر صورة D بيضة سليمة من الديدان الخيطية Steinernema carpocapsae.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
باستخدام مجموعة مناسبة هو عامل رئيسي للنجاح في تربية الجسم الحي من EPN. عادة، يمكن أن كلا steinernematids وheterorhabditids إنتاج وبنجاح إكمال دورة حياتها في يرقات فراشة الشمع الكبيرة، غاليريا mellonella (قشريات الجناح: Pyralidae). ومع ذلك، يمكن اعتبار أنواع الحشرات الأخرى من الأسر و / أو أوامر مختلفة. ومن المعروف أن هناك عدد قليل من الأنواع الخيطية وصف حاليا لدينا خصوصية لمجموعة الحشرات معين. على سبيل المثال، S. kushidai وS. scarabaei ليست ضراوة جدا ليرقات lepidopteran، وتحتاج اليرقات coleopteran مثل يرقات خنفساء الجعل (Scarabaeidae) لتربية ناجحة في المختبر. نوع آخر، S. scapterisci، يفضل orthopteran الحشرات مثل الصراصير أو الصراصير الخلد.
عندما المضيف مناسب ليست متاحة أو عندما تتطلب الظروف التجريبية ذلك، في المختبر يمكن استخدام أساليب لتربية EPN. هذه الطرق استخدام وسائل الإعلام التي تقدم مصدرا غنيا من المواد الغذائية لالنيماتودا والمتكافلة بهم البكتيرية. في هذا العرض وصفنا نوعين من أجار (الكبد الكلى والدهون) التي يمكن استخدامها لنمو وتكاثر ناجحة EPN مع أو بدون البكتيريا التكافلية لهم.
يجب أن يكون المستخدمون على علم بأن أجار الكبد الكلى هو الوسائط الغنية، وبالتالي ملوثة بسهولة. ويوصى تقنية معقمة في التعامل مع كل من البيض وaxenized لوحات الملقحة خلال جميع مراحل الإجراء. يجب التخلص من لوحات الملوثة بالبكتيريا أو الفطريات على الفور.
عندما تربية aposymbiotic Steinernema نقابة الصحفيين العراقيين، ينبغي الحرص على ليز بشكل صحيح أنسجة الخيطية الإناث، كما أنها يمكن أن تؤوي البكتيريا Xenorhabdus. أيضا، للتحقق من أن IJ هي في الواقع خالية من البكتيريا التكافلية، نوصي طحن عينة من نقابة الصحفيين العراقيين المقطوع حديثا في LB مع موتو باليدص يحركها مدقة حسب (Heungens وآخرون 2002) 7 وتعليق لوحة على وسائط NBTA 1. إذا تم العثور على البكتيريا المستعمرات (بعد الحضانة بين عشية وضحاها) سيكون إما مؤشرا على تقنية axenization الفقيرة أو نتيجة للتلوث.
تربية الديدان الخيطية Steinernema aposymbiotic هي تقنية يمكن أيضا النظر في مجموعة واسعة من الإجراءات والتجارب. وينبغي أن يكون القراء على علم بأن تأثير تربية الديدان الخيطية Steinernema دون المتكافلة على مدى أجيال متعددة قد يكون لها تأثير على اللياقة البدنية الخيطية وبقاء أكثر من مرة جيل. وتشير بعض الدراسات إلى ضرورة الاقتران في النظم الطبيعية 5،11،15-17. ومع ذلك، فقد تم إجراء هذه الدراسات على عدد محدود من الأنواع وهناك حاجة إلى مزيد من الاستكشاف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
أعلنت أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
الكتاب أود أن أشكر أعضاء السابق للمختبر الأوراق المالية: مينغ مين لي، كاثرين Plichta، فيكتوريا ميراندا طومسون وسام كيو كيم لمساهماتها في تحسين العديد من هذه البروتوكولات. وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من منحة المؤسسة الوطنية للعلوم IOS-0840932-0724978 وIOS لSP المالية
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For In vivo Infections | |||
| 100 x 15 Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| Filter paper, 9 cm grade 1 cellulose | Whatman/VWR | 28450-081 | Grade 1 filter paper recommended |
| Insect hosts | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | Galleria mellonella are recommended |
| For Liver-kidney Agar (for 500 ml) | |||
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-092 | |
| Beef liver, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Beef kidney, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Sodium chloride 2.5 g (0.5% final concentration) | Acros/VWR | 200002-434 | any research grade NaCl can be used |
| Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration) | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| 500 ml distilled H2O | |||
| For Lipid Agar (for 1 L) | |||
| 100 x 15 Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| Nutrient broth, 8 g | BD/VWR | 90002-660 | |
| Yeast extract, 5 g | EMD/VWR | EM1.03753.0500 | |
| Magnesium chloride hexahydrate 10 ml (0.2 g/ml) | EMD/VWR | EM-MX0045-1 | |
| Corn oil, 4 ml | Any brand | Locally source; supermarket | Any brand of corn oil can be used |
| Corn syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H2O and swirl for homogeneity | Karo | Locally sourced; supermarket | |
| Agar, 15 g | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| Distilled H2O, 890 ml | |||
References
- Akhurst, R. J. Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes, Neoaplectana and Heterorhabditis. J. Gen. Microbiol. 121, 303-309 (1980).
- Dunphy, G. B., Webster, J. M. The monoxenic culture of Neoaplectana carpocapsae DD 136 and Heterorhabditis heliothidis. Revue Nematol. 12, 113-123 (1989).
- Boemare, N. Biology, taxonomy and systematics of Photorhabdus and Xenorhabdus. Entomopathogenic Nematology. Gaugler, R. , CABI Publishing. Wallingford. (2002).
- Boemare, N. E., Akhurst, R. A. The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. The Prokaryotes. Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -H., Stackebrandt, E. , Springer. New York, NY. 473-488 (2002).
- Ehlers, R. U., Wulff, A., Peters, A. Pathogenicity of axenic Steinernema feltiae. Xenorhabdus bovienii. and the bacto-helminthic complex to larvae of Tipula oleracea (Diptera) and Galleria mellonella (Lepidoptera). Journal Invertebrate Pathology. 69, 212-217 (1997).
- Gaugler, R., Kaya, H. K. Entomopathogenic Nematodes in Biological Control. Boca. , CRC Press. Raton, FL. (1990).
- Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes. Molecular Microbiology. 45, 1337-1353 (2002).
- Kaya, H. K., Gaugler, R.
- Kaya, H. K., Stock, S. P. Techniques in insect nematology. Manual of techniques in insect pathology. Lackey, L. A. , Academic Press. London. 281-324 (1997).
- Koppenhöfer, H. Bacterial Symbionts of Steinernema and Heterorhabditis. Entomopathogenic Nematodes: Systematics, Phylogeny and Bacterial Symbionts. Nguyen, K. B., Hunt, D. J. , Brill. Leiden-Boston. 735-759 (2007).
- Lunau, S., Stoessel, S., Schmidt Peisker, A. J., Ehlers, R. U. Establishment of monoxenic inocula for scaling up in vitro cultures of the entomopathogenic nematodes Steinernema spp and Heterorhabditis spp. Nematologica. 39, 385-399 (1993).
- Orozco, R. A., Lee, M., Stock, S. P. Soil sampling and isolation of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae). J. Vis. Exp. (89), (2014).
- Poinar, G. O. The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neoaplectana sp (Steinernematidae: Nematoda). Nematologica. 12, 105-108 (1966).
- Poinar, G. O. Jr, Thomas, G. M. Significance of Achromobacter nematophilus sp. nov. (Achromobacteriaceae: Eubacteriales) associated with a nematode. Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon. 15, 249-252 (1966).
- Sicard, M., Brugirard-Ricaud, K., Pagès, S., Lanois, A., Boemare, N. E., Brehéli, M., Givaudan, A. Stages of infection during the tripartite interaction between Xenorhabdus nematophila, its nematode vector, and insect hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70, 6473-6480 (2004).
- Sicard, M., Hinsinger, J., LeBrun, N., Pagès, S., Boemare, N., Moulia, C. Interspecific competition between entomopathogenic nematodes (Steinernema) is modified by their bacterial symbionts (Xenorhabdus). BMC Evolutionary Biology. 6, 68-78 (2006).
- Snyder, H., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. New insights into the colonization and release processes of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae. Applied and environmental microbiology. 73, 5338-5346 (2007).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. ed, C. .elegans.W. ormB. ook. , Available from: http://www.wormbook.org (2006).
- Stock, S. P., Goodrich-Blair, H. Nematode parasites, pathogens and associated of insects and invertebrates of economic importance. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. Lacey, L. A. , Elsevier. Yakima, WA. 373-426 (2012).
