Protocol
Nota: Todas as fontes estão listadas na Tabela 1.
1. Armazenar o frango Embriões
- Incubar ovos de galinha da estirpe Gallus gallus horizontalmente a 37 o C, com aproximadamente 40% de umidade e virar ovos uma vez ou duas vezes por dia. Voltando ovos é importante para evitar o embrião de aderir a casca do ovo.
- Não para não transformar o ovo no 24 horas antes da criação da cultura de outra forma o embrião será localizado ventral à massa de gema e será danificado ao abrir o ovo no passo 3. Além disso, manter os ovos a 4 o C graus para não mais do que uma semana antes de incubação para o desenvolvimento "parada", mas isso não é o ideal.
2. Encenação de frango Embriões
- Fase, os embriões de galinha usando o Hamburger e Hamilton 12 de tabela de representação. O palco ideal para a criação da cultura ex-ovo é HH fase 19-20 (cerca de 3 dias de incubação) because este é logo após a cabeça gira em 53 hpf.
Nota: 19-20 HH fase caracteriza-se pelas seguintes características morfológicas: somitos são estendidas para a maioria da cauda, no entanto, a própria extremidade da cauda permanece não segmentada, o botão de cauda está enrolado, o alantóide é pequena e tem vasculatura limitado, as pernas-botões são maiores do que os de asa-botões e os olhos são unpigmented ou têm uma tonalidade acinzentada.
3. Retirar o embrião da Shell
- Antes de retirar o embrião a partir do shell, pulverizar o shell com etanol 70% e deixe-a secar. Não vire o ovo rapidamente pois isso irá danificar o embrião.
- Tomando cuidado para não alterar a orientação do ovo, cuidadosamente quebrar o ovo no lado inferior (ou seja, o lado que foi ventral durante a incubação) e libertar o embrião para um barco de pesagem estéril (88 x 88 x 23 mm). Limpe pesar barcos com etanol 70%. Inspeccionar o embrião para assegurar que o saco vitelino não está danificado. Se a gema hcomo quebrado, descartar o embrião, como ele não vai sobreviver.
- Observar o embrião para garantir que ele é viável; o coração está batendo, vasculatura parece normal, e não há anormalidades óbvias estão presentes. Certifique-se de que as bordas do barco pesar são secos.
- Usando uma pipeta, gota 40 mL de penicilina / estreptomicina (5000 unidades de penicilina, estreptomicina a 5 mg por ml) na parte superior da albumina para ajudar a prevenir a infecção.
4. Preparar a câmara de umidade
- Colocar uma pequena pilha de KIM-toalhetes e / ou uma almofada absorvente feita de algodão, no fundo de um recipiente de plástico estéril (12 x 12 x 6 cm) limpa com etanol a 70%.
- Adicione água destilada estéril para umedecer os KIM-toalhetes e / ou algodão (aproximadamente 150 ml de água).
5. Montagem do Ex Cultura Ovo
- Inserir o barco pesar contendo o embrião no topo da pe de enchimento húmido. Em seguida, coloque a metade de um estéril petri-prato quadrado (9.5 x 9.5 cm) na parte superior do tele pesam barco para formar uma tampa solta.
- Cobrir o recipiente de plástico com a sua tampa. Pressione para baixo dois cantos da tampa, garantindo uma vedação parcial que ainda permite uma boa circulação de ar no interior da câmara.
- Com cuidado, coloque a configuração para o 37 o C incubadora até estágio desejado.
- Coloque recipientes de água na incubadora para ajudar a controlar a humidade, se uma incubadora com humidade controlada não está disponível. Esteriliza-se toda a água nas câmaras de humidade e na incubadora e encher como for necessário durante o período de incubação. 40% de umidade é ideal.
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Representative Results
Este ex ovo método permite a observação de embriões a partir de estágios iniciais de desenvolvimento (HH 19/20) para estágios finais de desenvolvimento (HH 40-41) (Figura 1A e 1B). Configurando a cultura no HH 19-20 aumenta a capacidade de sobrevivência dos embriões na cultura. Antes do giro (antes de 53 hpf) a capacidade de sobrevivência é muito baixa em cultura e após a etapa 21, o embrião tende a ficar mais para o shell sobre a remoção de modo são obtidas menos embriões intactos. Em geral, a capacidade de sobrevivência do embrião no ex ovo cultura é alta até HH 35-36 (90-100%), mas não queda nos estágios mais avançados de desenvolvimento (cerca de 40% sobrevivem para HH 40-41). Além disso, embora tenha sido demonstrado que o desenvolvimento normal, aparece nestes estágios tardios e padronização do esqueleto não é afectada 4,15, observou-se que os membros estão dobrados em esses estágios finais, sugerindo que o grau ou o momento da ossificação pode ser afectada. Isto éconsiderando não surpreende a necessidade de cálcio a partir da casca para a ossificação. Uma comparação detalhada do desenvolvimento do embrião em comparação aos controles está em andamento e está fora do escopo deste artigo métodos.
A obtenção de acesso para o embrião durante o desenvolvimento é importante por duas razões principais. Primeiro, os pesquisadores são capazes de ver o desenvolvimento em uma base diária, sem ter que quebrar o lacre e feche a janela. Por exemplo, os indivíduos são capazes de observar membro e desenvolvimento do olho em múltiplos estágios (Figura 1C e 1D). Em segundo lugar, ex ovo cultura permite maior acesso (sem restrições) para o embrião, permitindo assim manipulações mais fácil ou cirurgias.
Manipulações embrionárias na maioria das vezes, têm de ser realizada utilizando-se um estereomicroscópio. Usando o ex ovo método de cultura descrito aqui, em oposição ao método / filme plástico Styrofoam 6,7,8 o embrião set-up é facilmente colocado under o microscópio, é menos profundo e não vai tombar. Isso permite que o pesquisador para posicionar a câmara de umidade precisamente quando necessário e para girá-lo para otimizar o acesso ao embrião, já que não há barreiras (casca de ovo) que obscurecem o embrião e desde que a câmara é muito estável. Em geral, o apoio do embrião recebe do barco pesar permite uma ligeira pressão a ser aplicada ao embrião durante a manipulação, sem o set-up tombar.
Diversos métodos de biologia do desenvolvimento pode ser realizado sobre os embriões neste sistema de cultura. Estes incluem observações detalhadas de órgãos (por exemplo, olhos, cérebro, etc.) ou desenvolvimento do tecido (por exemplo, o crescimento de vasos sanguíneos) ou aplicação de agentes teratogénicos. As manipulações incluem enxerto de tecidos sobre as membranas corioalantóicas para estudar o efeito da combinação de diferentes camadas de tecido ou de estudar o crescimento de tumores e metástases 14. Outra manipulação popular, realizada durante o desenvolvimento é bead ou barreira implantação. Implantação do grânulo permite que um investigador para embeber um inibidor ou para o factor de grânulo e, em seguida, implantar o talão localmente para inibir ou induzir genes localmente na área de interesse. Isso geralmente é feito usando AffiGel ou heparina grânulos (Figura 2A). Por exemplo, proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs) pode ser inibido localmente durante a indução da crista neural derivada de osso 4, 15, ou no limbo 13 desenvolvendo bud. Depois de um grânulo é implantado, o embrião pode ser retornado para a incubadora e vai continuar a desenvolver-se. Isto permite aos investigadores visualizar os efeitos a jusante da inibição de um gene particular (neste caso, BMP), tais como a inibição da formação de esclerótica ossículo no anel esclerótico (Figura 2B e 2C) 15. Da mesma forma, as barreiras podem facilmente ser inserido entre camadas de tecido, a fim de estudar a sinalização tecido-a-tecido e a microinjecção de corantes também podem ser facilmente realizados. 
Figura 1. Vendo o embrião ex ovo. (A) estágio HH 20 embrião de galinha após a remoção da casca, a seta aponta para o embrião com membranas embrionárias vascularizados. (B) A HH estágio 40 embriões em uma câmara de umidade aberto. (C) HH fase 35 embrião mostrando brotos dos membros iniciais (seta). (D) Stage HH 41 embrião mostrando o desenvolvimento posterior de estruturas como o olho (seta). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Exemplo de Noggin embebido talão Implantação Experiment 4. (A) Embrião HH fase 35 exposto através de um pequeno furo rasgado nas membranas que se sobrepõem a fim de ter acesso ao olho subjacente para a implantação do grânulo. Ampliação elevada da esfera Affigel adjacente a uma papila conjuntival é mostrado em baixo-relevo. Barra de escala em C é de 75 mm. (B) A fosfatase alcalina manchado olho direito após a implantação Noggin talão (seta) mostrando lacuna no anel dos ossículos, HH 38 (C) AP manchado olho esquerdo mostrando nenhuma interrupção ao anel dos ossículos (controle ), HH 38. Detalhes desta experiência são fornecidos em Duench e Franz-Odendaal 4. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Ex ovo cultura e de janelas ambos têm vantagens e desafios. Aqui vamos comparar as vantagens e os desafios do isopor cup ex ovo método eo método de janelas para o nosso ex otimizado ovo método mostrado aqui. Nosso método permite a manipulação e fácil observação do embrião de galinha em estágios finais de desenvolvimento e os nossos aperfeiçoamentos da ex tradicional ovo método 1, 2, 3 torná-lo também muito fácil de usar em aulas de graduação de laboratório de ensino.
Embora muitos pesquisadores preferem o método de janelas para estudar o desenvolvimento de frango porque é simples de executar e tem excelente capacidade de sobrevivência para estágios finais de desenvolvimento (HH 41-42), tem limitações. A maior delas é a capacidade limitada para ver toda a embrião após HH fase 30. Após fase HH 30, a janela na casca do ovo precisa ser muito grande, a fim de ver o crescimento, embrião em movimento. Este grande janela é difficult para selar completamente (levando a problemas com a esterilidade e sobrevivência), e obter uma boa iluminação no interior do ovo pode ser um desafio. Além disso, os embriões em estágios avançados são grandes e de difícil acesso (ou manipular) através da janela.
O ex ovo método descrito aqui fornece acesso desinibida completo para o embrião. Uma vez que o barco de pesagem é colocado na câmara de humidade, a toda a configuração é muito estável. A câmara de humidade inteira pode ser colocada sob um microscópio de dissecação e ampliação elevada pode ser usada para observar todo o embrião. Em comparação, o método copo de isopor tem uma câmara de umidade que é alto (altura do copo) e isso faz com que seja muito difícil de colocar no âmbito dos objectivos do microscópio. O projeto do copo também é muito menos estável do que o plano pesar barco e estes copos pode ser facilmente derrubado. Nossos melhorias para o ex ovo método tornar este método simples de usar em sala de aula ou laboratório e permite que o student de ter acesso completo aos embriões de fase HH 19 até HH 40; fases, quando grande organogênese está ocorrendo. A maior desvantagem do nosso ex ovo método é esterilidade. A fim de prevenir a infecção, o nosso método inclui a adição de antibióticos. Outra dose de antibiótico pode ser administrado para o embrião em fases posteriores. Os antibióticos administrados durante a cultura de set-up, também não parecem afectar o desenvolvimento do embrião. A esterilização de recipientes com etanol 70% antes da utilização pode aumentar dramaticamente a capacidade de sobrevivência.
No geral, o ex ovo método é ideal para visualização e manipulação de embriões sem limitações de acesso ou estágio de desenvolvimento. Pesquisas anteriores já haviam mostrado que a cultura dos embriões ex ovo não afeta negativamente a padronização 4,15. Por exemplo, não se ver qualquer mudança na padronização ou indução do esqueleto, apesar da ausência da casca do ovo. Nosso método melhorado resolve múltipla cESAFIOS que existem com o ex tradicional atual ovo método 1,2, 3.
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Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros competitivos em relação às informações apresentadas neste manuscrito.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Paul Poirier, o produtor de mídia, em Mount Saint Vincent University por seu trabalho em filmagem e edição de uma parte do vídeo deste manuscrito. Reconhecemos a Ciência Natural e do Conselho de Pesquisa em Engenharia do Canadá para financiamento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4458 | Make small aliquots to avoid freeze/thaw events |
| Square Petri Dish | 9.5 cm x 9.5 cm | ||
| Weigh Boat | Fischer Scientific | 8732113 | 88 x 88 x 23 mm |
| Ziplock container | Ziplock | N/A | 12 cm x 12 cm x 6 cm |
References
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