Metodo chirurgico per Virally Mediated Gene consegna all'orecchio mouse interno attraverso la finestra rotonda a membrana

Summary

L'approccio chirurgico post-auricolare descritto consente una somministrazione rapida e diretta nel timpano della scala cocleare del topo, riducendo al minimo la perdita di sangue e la mortalità animale. Questo metodo può essere utilizzato per la terapia cocleare utilizzando la somministrazione molecolare, farmacologica e virale a topi postnatali attraverso la membrana rotonda della finestra.

Abstract

La terapia genica, utilizzato per realizzare il recupero funzionale di sordità neurosensoriale, promette di concedere una migliore comprensione dei meccanismi molecolari e genetici alla base che contribuiscono alla perdita dell'udito. Introduzione di vettori nell'orecchio interno deve essere fatto in modo che l'agente ampiamente distribuisce tutta la coclea minimizzando lesioni alle strutture esistenti. Questo manoscritto descrive un approccio chirurgico post-auricolare che può essere utilizzato per il mouse terapia cocleare usando molecolari, farmacologico, e consegna virale per topi giorno postnatale 10 e anziani attraverso la membrana finestra rotonda (RWM). Questo approccio chirurgico consente la consegna rapida e diretta nella scala timpanica, riducendo al minimo la perdita di sangue ed evitare la mortalità degli animali. Questa tecnica comporta trascurabile o nessun danno alle strutture essenziali dell'orecchio interno e medio nonché muscoli del collo mentre tutto conservando udito. Per dimostrare l'efficacia di questa tecnica chirurgica, la glutam vescicolaremangiato transporter 3 knockout (VGLUT3 KO) topi verrà utilizzato come esempio di un modello murino di sordità congenita che recupera l'udito dopo la consegna del VGLUT3 all'orecchio interno tramite un virus adeno-associato (AAV-1).

Introduction

La terapia genica è stato a lungo suggerito come un potenziale trattamento per la perdita dell'udito genetica, ma il successo in questo settore è rimasta inafferrabile ^1. Ad oggi, le metodologie viralmente mediati hanno prevalso grazie alla capacità teorica di indirizzare specifici tipi cellulari all'interno della coclea relativamente inaccessibile. Entrambi adenovirus (AV) e il virus adeno-associato (AAV) sono stati utilizzati per la consegna del gene cocleare. AAV sono vantaggiosi nella coclea per una serie di motivi. Sono virus replica-carenti e possono efficacemente trasferire molecole transgenici a diversi tipi di cellule, tra cui i neuroni, u....

Protocol

NOTA: tutte le procedure e la gestione degli animali rispettate le linee guida etiche NIH e requisiti del protocollo approvati Care and Use Committee della University of California Animal Istituzionale, San Francisco.

1. Preparare la Animal di Chirurgia

1. Eseguire interventi chirurgici in un ambiente pulito, spazio dedicato. Autoclave tutti gli strumenti chirurgici, sterilizzare con una sterilizzatrice vetro tallone prima dell'intervento.
   NOTA: In questo protocollo, utilizzare giorno postnatale 10-12 (P10-12) topi FVB. Età diverse e ceppi di topi possono essere utilizzati per soddisfare le esigenze di uno specifico pro....

Results

Per verificare le caratteristiche tecniche e l'utilità di un approccio post-auricolare per la terapia molecolare cocleare, AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP e AAV2-GFP sono state consegnate in topi P10-12 all'orecchio interno tramite l'RWM. Questo approccio dimostra espressione del transgene successo all'interno delle cellule ciliate interne (IHC) (VGLUT3 Figura 1 e Figura 2 e GFP GFP figura 3A), le cellule ciliate esterne (OHC) (GFP Figura 2) e cellule di supporto.......

Discussion

In questo lavoro, si descrive in dettaglio una tecnica che può essere utilizzato per la terapia genica cocleare, con l'obiettivo di ripristino o salvataggio normale funzione uditiva che viene compromessa da un difetto genetico. Come è tipicamente atraumatica, questo approccio è sicuro per il trasferimento di geni cocleare o altri potenziali terapie molecolari ^30. Altri approcci per la terapia cocleare sono stati descritti, tra cui un approccio ventrale ^24, cocleostomia ^31,32 e sacco .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamina	Butler Schein
Xilazina	AnaSed
Acepromazina	Fornito da UCSF LARC
Analgesia del carprofene	Fornito da UCSF LARC
Betadine Betadine	Puredue Pharma
desametasone unguento oftalmico (TobraDex)	Alcon
Termoforo	Braintree scientific, inc.
Ago 25G	BD	305127
pipetta capillare in borosilicato	World precision instruments, inc.	1B100F-4
Sutura PDS*plus Antibatterico	Ethicon	PDP149
Colla tissutale (Vetcode)	Butler Schein	31477
Coniglio Anticorpo anti-GFP	Invitrogen	A11122
Microscopio da dissezione	Leica		MZ95
Micropipetta fiammata/marrone	Estrattore Sutter Instrument Co
Modello P-97
Sistema TDT BioSig III	Tecnologie