Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Generation af Plasmidvektorer udtrykker FLAG-mærkede proteiner henhold til forordningen for Human elongeringsfaktor-1α Promoter Brug Gibson Assembly

Published: February 9, 2015 doi: 10.3791/52235
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cell Biology and Biochemistry, Texas Tech University Health Sciences Center

Abstract

Gibson samling (GA) kloning tilbyder en hurtig, pålidelig og fleksibel alternativ til konventionelle DNA Cloning metoder. Vi brugte GA at oprette tilpassede plasmider til ekspression af eksogene gener i mus embryonale stamceller (mESCs). Ekspression af eksogene gener under kontrol af SV40 eller human cytomegalovirus promotorer aftager hurtigt efter transfektion ind mESCs. Et middel mod denne formindsket udtryk er at bruge den menneskelige elongeringsfaktor-1 alpha (hEF1α) promotor til at drive genekspression. Plasmidvektorer indeholder hEF1α er ikke så bredt tilgængelig som SV40- eller CMV-holdige plasmider, navnlig de også indeholder N-terminale 3xFLAG-tags. Den her beskrevne protokol er en hurtig metode til at skabe plasmider, der udtrykker FLAG-mærkede CstF-64 og CstF-64 mutant under udtryksmæssige regulering af hEF1α promotoren. GA anvender en blanding af DNA exonuclease, DNA-polymerase og DNA-ligase til at gøre kloning af overlappende ender af eventuelle DNA-fragmenter.Baseret på skabelonen DNA, vi havde til rådighed, designet vi vores konstruktioner at blive samlet til en enkelt sekvens. Vores design anvendt fire DNA-fragmenter: pcDNA 3.1 vektor backbone, hEF1α promoter del 1, hEF1α promoter del 2 (som indeholdt 3xFLAG-tag købt som et dobbeltstrenget syntetisk DNA-fragment), og enten CstF-64 eller specifik CstF-64 mutant. Sekvenserne af disse fragmenter blev overført til en primer generation værktøj til at udforme passende PCR-primere til frembringelse af DNA-fragmenter. Efter PCR blev DNA-fragmenter blandet med vektoren indeholdende den selektive markør, og GA kloning reaktionen blev samlet. Plasmider fra individuelle transformerede bakteriekolonier blev isoleret. Første skærmbillede af plasmiderne blev udført ved restriktionsfordøjelse efterfulgt af sekventering. Afslutningsvis GA tilladt os at oprette tilpassede plasmider til genekspression i 5 dage, herunder konstruere skærme og verifikation.

Introduction

Konventionelle DNA Cloning procedurer afhængige af anvendelse af restriktionsenzymer til at spalte DNA og DNA-ligase at slutte sig til DNA-fragmenter sammen. Generering af brugerdefinerede ekspressionskonstruktioner indeholder forskellige DNA-fragmenter er en sekventiel procedure, der omfatter spaltning af DNA'et med et og / eller flere restriktionsendonucleaser og den efterfølgende indsættelse af DNA-fragmenter gennem ligering. Den største ulempe ved denne procedure er, at egnede restriktionsenzymer for en af de DNA-fragmenter kan være vanskeligt at identificere (dvs. kan have flere spaltningssteder) destruktion vellykket DNA kloning af fuldlængde-proteinet af interesse umulig. Derfor generation af brugerdefinerede ekspressionskonstrukter under transkriptionel regulering af effektiv celletype promotorer med tilpassede protein-tags kræver meget omhyggelig design. Det er også en tids- og arbejdskrævende teknik. For nylig, flere rapporter beskrevet metoder til at samle multiple forskellige syntetiske DNA-fragmenter i en kontinuerlig sekvens på samme tid i enten en- eller to-trins-reaktioner uden anvendelse af restriktionsenzymer 1-3. Den ene trin kloning reaktion (eksklusive alle forberedende trin), afhænger af brugen af en blanding af DNA exonuclease, DNA-polymerase, DNA-ligase 2,3 og de ​​overlappende ender af DNA-fragmenter (figur 1). Da der ikke er brug af restriktionsenzymer kan DNA-fragmenter af en hvilken som helst størrelse og sekvens sammensætning (undtagen stærkt repetitive sekvenser) fusioneres sammen i en sømløs konstruktion. For nylig, et kommercielt kit (Gibson forsamlingsfriheden; GA) for de ét-trins kloning reaktioner blev tilgængelige. Dette sæt giver hurtig og omkostningseffektiv montage af eventuelle DNA-fragmenter i en enkelt vektor med tilpassede promotorer og protein tags.

De bredt tilgængelige plasmidekspressionsvektorer bruges til at udtrykke eksogene proteiner i mammale cellekultur modeller er ofte under transkriptionel regfolkning af det virale cytomegalovirus (CMV) eller abevirus 40 (SV40) promotorer. Disse virale promotorer giver robust forbigående ekspression af de exogene proteiner i de fleste mammale cellekultur baserede modeller. Imidlertid generering af cellelinjer, der stabilt udtrykker eksogene proteiner er ofte mislykket på grund af transkriptionel inaktivering af CMV eller SV40-promotorer under etablering proces 4,5. Desuden vil SV40 og CMV virale promotorer ikke i tilstrækkelig grad at fremme ekspression af exogene proteiner i celler fra den lymfoide afstamning eller embryonale stamceller 6,7. Løsningen på den iboende begrænsning af virale promotorer er at bruge stærke konstitutive ikke-virale promotorer 8-10. Et godt karakteriseret stærk konstitutiv ikke-viral promotor af human oprindelse er elongeringsfaktor 1α (hEF1α) promotor (hEF1α er involveret i katalyse af GTP-afhængige sammenslutning af aminoacyl-tRNA til ribosomer 11). Imidlertidekspressionsvektorer indeholdende hEF1α promotoren er ikke så bredt tilgængelig som den virale-promotoren indeholdende plasmider, især dem, der også indeholder 3 × FLAG på den aminoterminale ende af proteinet af interesse.

Den 64.000 MW spaltning stimulation faktor protein (CstF-64) er involveret i 3'-enden behandling af de fleste mRNA'er 12,13, herunder replikation-afhængige histon mRNA'er 14,15. CstF-64 udtrykkes i alle somatiske væv 12. Dens RNA genkendelsesmotiv binder til GU-rige RNA-sekvenser på spirende transkripter nedstrøms for spaltning og polyadenyleringsstedet 16. Denne binding af CstF-64 til præ-mRNA fremmer effektiv endonukleolytisk spaltning af den begyndte transcript.

Her er en protokol, der er beskrevet, der anvender PCR-amplifikation af DNA-fragmenterne til en Gibson samling kloning kit (som omfatter kemisk kompetente bakterieceller) producere brugerdefinerede vektorer af 3xFLAG-mærkede mOuse CstF-64 eller mutant CstF-64 til deres aminoterminale ende under ekspressionen af hEF1α promotoren 1.

Protocol

1. I Silico Design af plasmidet og Generation af de overlappende primere

BEMÆRK: Formålet med dette trin er at samle fuldstændige nukleotidsekvens af konstruktionen og designe primere anvendes til at frembringe fragmenter med overlappende ender for GA kloning.

  1. Design en kontinuerlig nukleotidsekvens til at repræsentere den endelige plasmid.
  2. Opnå eller liste over de faktiske plasmider og DNA-fragmenter, der vil blive anvendt som templates i PCR.
    BEMÆRK: DNA-fragmenter, der ikke er let tilgængelige - såsom forskellige kombinationer af tags og promotorer - kan bestilles som en enkelt eller flere syntetiske dobbeltstrengede DNA-fragmenter (sDNA). Disse fragmenter er kommercielt tilgængelige med relativt lave omkostninger og kan være op til 2 kb i længden (se tabel Materialer).
  3. Divider kontinuerlige nucleotidsekvens af konstruktionen samles i trin 1.1 i DNA-fragmenter, der er egnede til PCR. Confirm at fragmenterne matcher tilgængelige plasmider og sDNA fragmenter. Undgå DNA-fragmenter mindre end 200 nt.
  4. Gå til primeren generation værktøj (se tabel i udstyr). Vælg "Set Preferences" menuen. Vælg de relevante indstillinger ved at klikke på fanen "CHANGE PREFS" i "Skift Gibson Assembly Settings" pop-up vindue.
    BEMÆRK: Primer design kan også udføres uden anvendelse af primeren generation værktøj. Men anvendelsen af ​​primeren generation værktøj forenkler processen.
  5. Start bygning konstruktionen ved at vælge "Build Construct" menuen. Sæt opdelte DNA-fragmenter i primer generation værktøj sekventielt fra 5 'til 3'-enden.
    BEMÆRK: DNA-fragment anvendes et plasmid backbone kan hensigtsmæssigt opdeles i to stykker. I det endelige PCR-produkt 5'-enden af ​​denne første fragment og 3'-enden af ​​den sidste fragment er bundet sammen i en kontinuerlig DNEt fragment, der repræsenterer vektoren backbone.
  6. Indsæt den første DNA-fragment, der repræsenterer 5'-enden af ​​vektor-DNA'et i FASTA format (en tekst-baseret repræsentation af nukleotidsekvensen) i "Enter Vector eller Insert fragment" pop-up vindue. Name DNA-fragmentet. Vælg den relevante måde at få DNA-fragmentet, enten som PCR, RE Digest eller syntese. Klik på fanen "fortsæt".
  7. Hvis der er behov for at tilføje ekstra nukleotider / restriktionssteder ved krydset af den endelige konstruktion bruge "Forlæns eller Rev primer spacer" rum, der er fastsat i "Tilføj en insert fragment til forsamlingen" vinduet. Tilføj ekstra nukleotider / restriktionssteder til kun én af DNA-fragmenterne og ikke begge fragmenter. Klik på "Udført" fanen.
  8. Gentag for alle fragmenterne indtil konstruktionen er færdig. Vælg "Vis Primere" menuen og se primersekvenserne.
  9. Gentag for alle konstruktioner (vektor backbones og indsætter), eller til DNA-fragmenter, der er anderledes.

2. Amplifikation af DNA-fragmenter ved PCR under anvendelse Hot Start korrekturlæsning DNA Polymerase (2x Master Mix)

BEMÆRK: Målet for dette trin er at opnå tilstrækkelig DNA til samling under anvendelse af PCR.

  1. Købe PCR-primerne designet i det foregående trin som afsaltet produkter og på det lavest mulige niveau. Fortyndes dem til 10 um i vand eller TE (10 mM Tris-HCI, pH 7,9, 1 mM EDTA).
  2. Køb DNA-fragmenter, der ikke er let tilgængelige som sDNA fragmenter.
  3. Fortynd alle DNA-fragmenter, herunder sDNA fragmenter, som vil blive anvendt som templates for PCR'er til 1 ng / pl i vand.
  4. Saml PCR-reaktioner ved stuetemperatur. Kort fortalt anvender 2,5 pi (fra 10 uM stamopløsning) af hver respektiv primer af primerparret, 1 pi (fra 1 ng / pl stamopløsning) af template-DNA-fragment, 25 μl varm start korrekturlæsning DNA-polymerase (DNA pol; 2x mester mix, se tabel Materialer) og 19 pi vand. Bland rør ved forsigtig flicking og indsamle de væskedråber ved kort centrifugering.
  5. Forstærk samtidigt i separate rør DNA-fragmenter af samme størrelse i henhold til anbefalingerne for DNA pol. Udfør 25-28 PCR-cykler eller bestemme antallet af cyklusser, der producerer tilstrækkelig DNA udbytte.
  6. Kør 10% af reaktionsvolumenet PCR (5 pi) på en standard agarosegelelektroforese farvet med ethidiumbromid (0,2 ug / ml slutkoncentration). Kontroller, at et enkelt DNA-bånd, der repræsenterer PCR-produktet er synlig. Bestemme størrelsen og den relative mængde af DNA-fragmenterne under anvendelse af DNA molekylær vægt standarder. Gentag om nødvendigt PCR for at opnå tilstrækkelig mængde af DNA-fragmenter.

3. Dpnl fordøjelse af PCR-produkter

BEMÆRK: Formålet med dette trin er at Digest resterende plasmid template DNA fra PCR'er i afsnit 2. Dpnl fordøje plasmid-DNA, hvis den er methyleret, såsom det forekommer at plasmid-DNA dyrket i dæmningen + bakteriestammer. Derfor ikke behandles med Dpnl hvis plasmid-DNA vil blive anvendt som et DNA-fragment i GA reaktionen.

  1. Tilsæt 2 pi Dpnl restriktionsenzym til 45 pi af PCR-produkter fremstillet i afsnit 2. Der inkuberes ved 37 ° C i 1 time. Fortsæt med punkt 4 eller fryse ved -20 ° C indtil brug.

4. Oprensning og koncentration af DNA-fragmenterne i løbet af DNA Purification magnetiske perler

BEMÆRK: Formålet med dette trin er at oprense og koncentrere PCR-produkterne opnået i afsnit 2 og 3. Andre PCR oprensningsmetoder kan anvendes.

  1. Ækvilibrere DNA rensning magnetiske perler til stuetemperatur. Re-suspendere perlerne ved kort vortex.
  2. Overfør PCR'er pre-fordøjet with Dpnl til et 1,5 ml rør, og der tilsættes 81 pi DNA rensning magnetiske perler til hvert rør. Inkuber blandingen ved stuetemperatur i 10 min.
  3. Placer rør på den magnetiske opsamler til omkring 2 min. Kassér den klare væske ved hjælp af en pipette. Vask to gange med 200 pi af 80% ethanol i 30 sek.
  4. Lad pellets at tørre. Holde låget af rørene åben, med rørene anbragt på den magnetiske opsamler.
  5. Re-suspendere de tørrede perler i 10 pi af 10 mM Tris-HCI, pH 8,0. Inkuber ved stuetemperatur i 2 min. Spin kort for at samle væsken i bunden af ​​rørene.
  6. Placer rørene på den magnetiske opsamler til 2 min. Fjern 8,5-10 pi af den klare opløsning og læg den i en ny pre-mærket rør. Bestem koncentrationen af DNA-fragmenterne ved UV-spektroskopi (se tabel udstyr).

5. Montering Kloning Reaction Transformation af produkterne i E. coli

<p class = "jove_content"> BEMÆRK: Målet for dette trin er at beregne forholdet 3: 1 af indsatsen: vektor og udfører montage reaktion.

  1. Brug mindst 100 ng af DNA-fragment, der repræsenterer vektor skelettet eller DNA fragment, der bærer den selektive markør. Beregn 3-fold molært overskud til DNA-fragmenter, der vil blive anvendt som indstik.
  2. Konverter det molære-overskud i ng behov i det enkelte insert.
    BEMÆRK: En nem måde at gøre beregningerne er at bruge en web-baseret program (se tabel i udstyr).
  3. Bland beregnede mængder af DNA-fragmenter i en PCR-rør, justere lydstyrken til 10 pi. Tilsæt 10 ul af GA mester mix (2x, se tabel Materialer). Inkuber reaktionen ved 50 ° C i 1 time til samling af 4 - 6 fragmenter eller 15 min til samling af 2-3 fragmenter i en PCR thermal cycler.
  4. Fortsæt med transformation af samlingen produkt i kompetente E. coli eller fryse produkterne ved -20° C, indtil brug.
  5. Følg transformation procedure, der følger med kemiske eller elektro kompetente celler. Normalt bruge 2 pi af forsamlingen reaktion pr transformation reaktion.
  6. Efter transformation er færdig, spredes de transformerede celler på agarplader suppleret med passende selektiv antibiotikum.

6. Plasmid Isolation, restriktionsenzymfordøjelse og sekventering

BEMÆRK: Formålet med dette trin er at isolere plasmid-DNA fra E. coli, så at verificere konstruktionen ved restriktionsspaltning og sekventering.

  1. Udbrede flere enkeltkolonier for mini preps og plasmid isolation. Brug 2-5 ml natten over LB flydende kultur suppleret med passende antibiotika. Isoler de tilsvarende plasmider ved at følge fremgangsmåden, der er beskrevet i mini prep kit, der anvendes.
  2. Bestem mængden og koncentrationen af ​​plasmiderne opnået ved anvendelse spectrofotometer.
  3. Udfør restriktionsfordøjelse med en eller flere restriktionsendonucleaser til ~ 0,5 ug af de oprensede plasmider. Brug restriktionsenzymer, der giver tydeligt mønster af fordøjelse karakteristisk for DNA-konstruktionerne.
  4. Bekræft DNA kloning succes ved DNA-sekventering under anvendelse af specifikke eller standard primere. Analyser sekventeringsdata for nøjagtighed.

Representative Results

En arbejdsgang af protokollen, der blev fulgt, er vist i figur 2A. Vi ønskede at klone CstF-64 og mutant CstF-64-proteiner fusioneret til 3xFLAG-tag under ekspressionel regulering af hEF1α promotoren (figur 2B og figur 3). Et plasmid indeholdende hEF1α efterfulgt af 3xFLAG-tag ikke var til rådighed for os. Men følgende plasmider var tilgængelige: pcDNA 3,1 myc-His (A; en generøs gave fra Michaela Jansen), hEF1α indeholdende plasmid (en generøs gave fra Mladen Yovchev) og muse taskforcens arbejde-64 plasmider 12 (figur 3). Hele sekvensen for konstruktionen (r) blev samlet ved hjælp af nukleotid og tekst redigeringsfunktioner (Figur 3, se tabel på udstyr). Efterfølgende blev sekvensen (s) opdelt i fire praktiske stykker (figur 2B, røde blokke og figur 3), der svarer til de tilgængelige plasmid DNA'er. Forstærkning primers blev designet ved hjælp primer generation værktøj (se tabel af udstyr) med begrænsninger 4 - 6 fragmenter med minimal overlapning på 25 nt, oprettet i "Skift Gibson Assembly Settings" pop-up vindue. Nhel- og NotI restriktionssites blev medtaget i primer design med henblik på at identificere korrekt samlede plasmider. Nhel ligger i primersekvensen mellem pcDNA 3.1 og 5'-enden af ​​den hEF1α promotoren. Notl-sted er placeret efter stopcodonet (UGA) taskforcens arbejde-64 og pcDNA 3.1 vektor rygrad. Ved samtidig fordøjelse med begge enzymer DNA-fragment, der består af hEF1α promotor, 3xFLAG og CstF-64 eller mutant CstF-64 vil blive frigivet (se nedenfor og figur 2B). Primere blev bestilt i den mindst mulige omfang og afsaltet. Den anden del af hEF1α promotor, der indeholder 3xFLAG-tag DNA-fragment (490 bp, figur 2B, figur 3) blev købt som en enkelt sDNA fragment (see Table of Materials). DNA-fragmenter, der anvendes i samlingen reaktion blev amplificeret ved anvendelse af DNA Pol (se tabel Materialer). DNA-fragmenter af hEF1α promotor del 1, hEF1α promoter del 2, fuld længde og mutant CstF-64 blev opformeret samtidig i et separat rør i 28 cyklusser (figur 4A), efter anbefalingerne fra leverandøren af DNA Pol (se tabel Materialer for hver cyklus denaturering var 7 sekunder ved 98 ° C, annealing 45 sekunder ved 55 ° C, forlængelse 90 sek ved 72 ° C). I første omgang blev pcDNA 3.1 rygrad forstærkes i 22 cykler (ved hjælp af de samme betingelser som ovenfor med undtagelse af forlængelsestiden, som blev sat til 3 minutter ved 72 ° C). Men det resulterende DNA udbyttet ikke var tilstrækkelig til at blive anvendt i en samling reaktion (figur 4A). Derfor er en yderligere amplifikation blev udført for at opnå tilstrækkelig DNA.

PCR-produkter opnåed fra et plasmid template skal fordøjes med Dpnl restriktionsenzym til fjernelse af plasmid-DNA, som ellers ville forurene de resulterende samling reaktionsprodukter og vil frembringe falsk positive lægemiddelresistente bakterielle kolonier. Derfor blev PCR-produkterne fordøjet med Dpnl restriktionsenzym, som spalter methyleret og hemi-methyleret plasmid-DNA isoleret fra Dam + E. coli-stammer. PCR-produkter opnået ved anvendelse af syntetiske DNA-fragmenter, som skabeloner ikke behøver at blive fordøjet med Dpnl siden kemisk syntetiseret DNA indeholder ikke methylerede eller hemi-methylerede baser.

DNA-fragmenter blev oprenset og koncentreret over DNA rensning magnetiske perler (se tabel Materialer) som beskrevet i protokollen trin 4. De PCR'er til pcDNA 3.1 vektorrygraden blev kombineret sammen, og mængden af DNA rensning magnetiske perler anvendes blev justeret i overensstemmelse hermed. DNA Udbyttet blev bestemtanvendelse af et spektrofotometer (tabel 1 og tabel af udstyr). Reaktioner Assembly for CstF-64 og mutant CstF-64-konstruktionerne blev samlet på is (tabel 1). En 3-fold molært overskud af DNA-fragmenterne, der betragtes som "skær" blev anvendt (tabel 1, figur 3). Det endelige volumen af ​​de blandede DNA-fragmenter blev justeret til 10 pi med vand og 10 pi samling Master mix (2x) blev tilsat. Reaktionerne blev blandet og inkuberet ved 50 ° C i 1 time. Positiv kontrol reaktion blev også samlet ifølge henstillingen fra GA kit manual og inkuberes samtidigt med CstF-64 og mutant CstF-64 reaktioner. Som anbefalet i protokollen blev 2 pi af hver af reaktionerne samling omdannet i kemisk kompetente E. coli leveres med montage kloning kit (se tabel Materialer). Transformationen blev udført som beskrevet i kittetmanual. Positive kloner blev selekteret på ampicillin agar / LB-plader. 6 kolonier pr hver enhed reaktion blev tilfældigt valgt til at blive opformeret. Plasmid-DNA'er blev isoleret under anvendelse af et plasmid isolation mini kit (se tabel Materialer). I silico fordøjelse af konstruktionerne med restriktionsenzymerne Nhel og Notl resulterede i to fragmenter med størrelser på 4.590 bp, 3032 bp for CstF-64 og 4.590 bp, 2.711 bp for mutant CstF-64 (figur 2B og figur 4B). Fordøjelse med restriktionsenzymerne HindIII og NotI resulterede i tre fragmenter med følgende størrelser: 5.872 bp, 1005 bp og 745 bp (CstF-64) og 5.872 bp, 1005 bp og 424 bp (mutant CstF-64, figur 2B og figur 4C). Faktisk fordøjelse af de isolerede plasmider viste de forventede karakteristiske mønstre (figur 4B, C). Bemærk, at 424 bp DNA-fragment fremstillet ved fordøjelse med Hindlll og Notl af CstF-64-mutantplasmider på figur 4C er svagt farvet på grund af sin lille størrelse. 2 ud af 6 isolerede plasmider blev sendt til sekventering. Vi sekventeret hEF1α promotoren og CstF-64 eller mutant CstF-64 dele af konstruktioner at kontrollere, at der ikke er nogen deletioner, insertioner eller substitutioner. Vi anbefaler stærkt sekventering af DNA-konstruktionerne som følge af denne eller enhver PCR-baseret protokol. Sekventeringen viste, at en af ​​hver sekventeret plasmid indeholdt den forventede sekvens i regionen hEF1α, 3xFLAG-tag og CstF-64 eller mutant CstF-64. Hver af de andre plasmider havde en punktmutation indført under amplifikationen af ​​det tilsvarende DNA-fragment. Ekspression af plasmidet indeholdende CstF-64 i mus embryonale stamceller, produceret rigelig mængde af exogent protein sammenlignes med vildtype-ekspression 17.

Figur 1
Figur 1. Skematisk repræsentation af Gibson Assembly mekanismen. DNA-fragmenter med overlappende ender blev isotermisk samlet i en enkelt kontinuerlig sekvens. Den overlappende ender først tygges tilbage med 5 'exonuklease, som gradvis varmeinaktiveret. Derfor vil forskellige DNA fragmenter med overlappende ender anneale isotermt. DNA-polymerase vil udfylde de huller og varmestabil DNA-ligase ligerer de nicks. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
Figur 2. (A) Rutediagram over protokollen beskrevet til samling kloning. (B) Repræsentation af plasmidet, pGA-CstF-64 genereres ved hjælp af GA kit Rød - DNA-fragmenter, der anvendes ved samling reaktion:. PcDNA3.1; hEF1α promoter del 1 (hEF1a - 1); hEF1α promoter del 2 (hEF1a - 2) bestilles som en syntetisk DNA; muse CstF-64 (mCstF-64). Blå - åbne læserammer. Violet - virale og ikke-virale promotorer. Green -. Spaltnings- og polyadenyleringsområder Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Design af Gibson samling CstF-64 plasmid. Sorte bokse repræsenterer DNA-fragmenter, der var tilgængelige til at designe en enkelt Gibson samling CstF-64 i silico sekvens. Efterfølgende blev sekvensen opdelt i fire DNA stykker, som blev amplificeret ved PCR. Bemærk, at på grund af lille størrelse 3xFLAG-tag sekvensen var udformet som en sDNA sammen med hEF1α pr omoter del 2. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 4
Figur 4. PCR af de DNA-fragmenter anvendt i kloning reaktioner og repræsentative restriktionsenzymfordøjelse af de opnåede plasmider (A) Repræsentative PCR'er under anvendelse af varm start high-fidelity 2x mastermix for DNA-fragmenter, der anvendes i samling reaktioner:. (B) repræsentant plasmider af hEF1α, fuld længde CstF-64, pcDNA 3.1 konstrukt (PGA-CstF-64) og hEF1α mutant CstF-64, pcDNA 3.1 konstrukt (PGA-mutCstF-64) fordøjet med Nhel og Notl. (C) af de samme plasmider som i B spaltet med Hindlll og Notl-enzymer."_blank"> Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Navn af DNA-fragmenter Forventet størrelse (bp) Concn. (Ng / pl) Fortyndet til (ng / pl) pi anvendes i GA CstF-64 fra Fortyndet pi anvendes i GA mutCstF-64, fra Fortyndet Molforhold (ins: vec)
pcDNA 3.1 (vektor) 4618 158 ufortyndet 1 1
hEF1_ promoter del 1 825 213 75 1 1 3: 1
hEF1_ promotor del 2 for CstF-64 516 229 50 1 3: 1
CstF-64 1.796 161 ufortyndet 1 3: 1
hEF1_ promotor del 2 for mutant CstF-64 516 199 50 1 3: 1
mutant CstF-64 1.448 201 171 1 3: 1

Tabel 1. Udbytte af DNA-fragmenter efter koncentration på magnetiske perler, fortynding og er nedsat af reaktionerne forsamling.

Discussion

Bør indledes vellykkede anvendelse af GA kloning altid ved en omhyggelig udformning af den komplette konstrukt (figur 2 og figur 3).

Omhyggelig kontrol af primersekvenserne designet af primeren generation værktøj er også stærkt anbefales. Primere til GA kan genereres uden brug af primeren generation værktøj. , Brug af værktøjet er dog anbefales, fordi det forenkler processen. Generelt skal primeren for GA kloning har to funktionelt forskellige sekvenser. Den første sekvens er DNA-fragment-specifikke og tillader amplificering af fragmentet ved hjælp af PCR. Den anden sekvens overlapper med den tilstødende fragment, som er nødvendig for GA samling. En typisk sekvens DNA-fragment-specifikke ville være 18-22 nt i længden. DNA-fragmentet specifikke sekvenser anvendt til at amplificere det samme DNA skal have lignende smeltetemperaturer og GC-indhold. Overlappende sekvens bør være mindst 15nt i længde med en smeltetemperatur på mindst 48 ° C. Samlingen af ​​mere end 4 DNA-fragmenter vil kræve overlappende sekvens til at være mindst 20 nt. Længere overlapninger vil tillade øget specificitet annealing resulterer i mere korrekt samlet DNA-fragmenter. Det anbefales at undgå sekvenser, der er skæv i deres GC eller AT indhold i udviklingen overlappende sekvenser, fordi skæve sekvenser kan bringe korrekt DNA forsamling.

Vi foreslår også anvendelse som en negativ kontrol, som ikke bør have nogen lægemiddelresistente bakteriekolonier, blot DNA-fragmentet svarende til vektorrygraden i en GA reaktion. Alternativt en af ​​DNA-fragmenter, der omfatter "indsatser" udelades fra GA reaktion, som også bør resultere i nogen resistente bakteriekolonier. Grunden ingen kolonier vil vokse vil være manglen på overlappende ender af tilstødende DNA-fragmenter, som vil gøre samling af rundete plasmid.

I beskrevne protokol overlappende sekvenser af 25 nt at generere primersæt blev anvendt på grund af antallet af DNA-fragmenter anvendes (figur 3). Anbefalingen af primeren generation værktøj hjemmeside (se tabel af udstyr) er at bruge mindst 20 nt overlappende sekvenser at samle 4 - 6 DNA-fragmenter. Desuden længere overlappende sekvens vil sikre korrekt komplementering af DNA-strengene (se figur 1) at øge antallet af nøjagtigt samlede produkter.

I øjeblikket flere systemer til problemfri kloning er tilgængelige. Men nogle af disse systemer stadig bruge restriktionsenzymer (dvs. Golden Gate kloning 18). Andre bruger proprietære blandinger af enzymer er baseret på vacciniavirus DNA-polymerase og enkeltstrenget DNA-bindende protein fra den samme biologiske kilde 19. Begge systemer er begrænset i forhold til GA ved Shorter længde af overlappende sekvenser. Fordi kortere overlappende sekvenser muligvis ikke tilvejebringe tilstrækkelig specificitet til udglødningstrin af tilgrænsende DNA-fragmenter, hvilket gør en korrekt samling af mere end 23 DNA-fragmenter problematisk. Disse mangler ikke er til stede i GA-systemet.

Størrelsen af de DNA-fragmenter, som skal amplificeres bør også overvejes for ikke at overskride den størrelse pålideligt amplificerbare ved hjælp af PCR (dvs. mindre end 8 kbp i længde). Selv med forbedringerne i funktion af DNA-polymeraser i de sidste 10 år vil store DNA-fragmenter amplificeres med mindre effektivitet og nøjagtighed. Hvis det er nødvendigt, kan større DNA-fragmenter opnået fra andre kilder alternativ til PCR, fx ved plasmid isolation og passende DNA fordøjelse med restriktionsenzymer. Specifikt for den protokol, der er beskrevet i den aktuelle manuskript vores rationelt at anvende PCR var baseret på størrelsen af ​​de tilgængelige DNA-fragmenter, som var alle mindre end5 kbp. Hvis der er mere end én PCR-produkt identificeres ved agarosegelelektroforese anbefales gel oprensning af den ønskede fragment størrelse ved hjælp af enhver af de tilgængelige molekylærbiologiske teknikker eller passende kits. I den nuværende protokol anvendes en varmestabil DNA-polymerase (se tabel Materialer). Men enhver DNA-polymerase levere high fidelity og udbytte vil være egnet til brug med denne protokol. Hvis high-fidelity DNA-polymeraser forskellige end beskrevet i protokollen er tilgængelige, skal du bruge oprettet betingelser som beskrevet i de respektive vejledninger. I den nuværende protokol, kemisk kompetente E. coli celler anvendes som følger med GA kit. Alternativt kemisk eller elektro kompetente E. coli stammer, såsom DH5a eller DH10B kan anvendes.

Samlingen kloning 2x mester mix er let at bruge med minimale hands-on tid. Imidlertid er nøjagtig pipettering nødvendig på grund af de små mængder needed at blive blandet sammen. God molekylærbiologi teknik skal udnyttes på alle tidspunkter også.

GA kloning giver ubegrænsede muligheder for en konstruktion af DNA-fragmenter, plasmider og vektorer, som er længere end 3 kbp i størrelse. Desuden har det en større indvirkning på syntetisk biologi, fordi det giver mulighed for syntese og samling af for eksempel en hel bakterie (Mycoplasma mycoides) genom eller en gær (Saccharomyces cerevisiae) kromosom 20,21. Teknikken kan også anvendes til konventionel kloning skal generere sømløse konstruktioner.

Afslutningsvis GA kloning tilbyder hurtig, pålidelig og fleksibel alternativ til den konventionelle DNA Cloning procedure.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Michaela Jansen ved Texas Tech University Health Sciences Center, Lubbock, TX og Mladen Yovchev ved University of Pittsburgh Medical Center, Pittsburgh, PA for generøst at give pcDNA 3.1 myc-His (A) og hEF1α promotor, der indeholder plasmider . Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development af National Institutes of Health under tildeling nummer R01HD037109 (til CCM). Yderligere støtte var fra Laura W. Bush Institute for kvinders sundhed (til CCM og PNG). Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health.

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Synthetic double-stranded DNA fragment (sDNA) Integrated DNA Technologies We used gBlocks, which can be up to 2 kb in length. However, there are many commercial sources of synthetic DNA available.
DNA purification magnetic beads Beckman Coulter A63880 Agencourt AMPure XP - PCR Purification system
Plasmid Isolation Mini Kit Omega Bio-Tek Inc D6942-01 E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I
Gibson Assembly Cloning Kit New England BioLabs E5510S
DNA polymerase New England BioLabs M0494S Q5 Hot Start High Fidelity 2x Master Mix
DpnI New England BioLabs R0176S
NheI New England BioLabs R3131S
NotI New England BioLabs R3189S
HindIII New England BioLabs R3104S
Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop device
EditSeq DNASTAR Part of Lasergene Core Suite
SeqBuilder DNASTAR Part of Lasergene Core Suite
Word Microsoft Part of Microsoft Office
NEBuilder New England BioLabs primer generation tool: http://nebuilder.neb.com
NEBioCalculator New England BioLabs ligation calculator: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in enzymology. 498, 349-361 (2011).
  2. Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A. 3rd, Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature methods. 7, 901-903 (2010).
  3. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature methods. 6, 343-345 (2009).
  4. Bowtell, D. D., Johnson, G. R., Kelso, A., Cory, S. Expression of genes transferred to haemopoietic stem cells by recombinant retroviruses. Molecular biology & medicine. 4, 229-250 (1987).
  5. Challita, P. M., Kohn, D. B. Lack of expression from a retroviral vector after transduction of murine hematopoietic stem cells is associated with methylation in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 2567-2571 (1994).
  6. Lutzko, C., Senadheera, D., Skelton, D., Petersen, D., Kohn, D. B. Lentivirus vectors incorporating the immunoglobulin heavy chain enhancer and matrix attachment regions provide position-independent expression in B lymphocytes. Journal of Virology. 77, 7341-7351 (2003).
  7. Meilinger, D., et al. Np95 interacts with de novo DNA methyltransferases, Dnmt3a and Dnmt3b, and mediates epigenetic silencing of the viral CMV promoter in embryonic stem cells. EMBO reports. 10, 1259-1264 (2009).
  8. Chan, K. K., Wu, S. M., Nissom, P. M., Oh, S. K., Choo, A. B. Generation of high-level stable transgene expressing human embryonic stem cell lines using Chinese hamster elongation factor-1 alpha promoter system. Stem cells and development. 17, 825-836 (2008).
  9. Chung, S., et al. Analysis of different promoter systems for efficient transgene expression in mouse embryonic stem cell lines. Stem cells. 20, 139-145 (2002).
  10. Qin, J. Y., et al. Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter. PloS one. 5, e10611 (2010).
  11. Lund, A., Knudsen, S. M., Vissing, H., Clark, B., Tommerup, N. Assignment of human elongation factor 1alpha genes: EEF1A maps to chromosome 6q14 and EEF1A2 to 20q13.3. Genomics. 36, 359-361 (1996).
  12. Wallace, A. M., et al. Two distinct forms of the 64,000 Mr protein of the cleavage stimulation factor are expressed in mouse male germ cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6763-6768 (1999).
  13. MacDonald, C. C., McMahon, K. W. Tissue-specific mechanisms of alternative polyadenylation: testis, brain, and beyond. Wiley interdisciplinary reviews. RNA. 1, 494-501 (2010).
  14. Sabath, I., et al. 3'-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. Rna. 19, 1726-1744 (2013).
  15. Yang, X. C., et al. A complex containing the CPSF73 endonuclease and other polyadenylation factors associates with U7 snRNP and is recruited to histone pre-mRNA for 3'-end processing. Molecular and cellular biology. 33, 28-37 (2013).
  16. Grozdanov, P. N., Macdonald, C. C. High-Throughput Sequencing of RNA Isolated by Cross-Linking and Immunoprecipitation (HITS-CLIP) to Determine Sites of Binding of CstF-64 on Nascent RNAs. Methods in molecular biology. 1125, 187-208 (2014).
  17. Youngblood, B. A., Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. CstF-64 supports pluripotency and regulates cell cycle progression in embryonic stem cells through histone 3' end processing. Nucleic acids research. , (2014).
  18. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PloS one. 3, e3647 (2008).
  19. Irwin, C. R., Farmer, A., Willer, D. O., Evans, D. H. In-fusion(R) cloning with vaccinia virus DNA polymerase. Methods in molecular biology. 890, 23-35 (2012).
  20. Annaluru, N., et al. Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome. Science. 344, 55-58 (2014).
  21. Gibson, D. G., et al. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science. 329, 52-56 (2010).

Tags

Molekylærbiologi menneskelig EF1α promotor SV40 promotor CMV-promotor Gibson samling embryonale stamceller protein ekspression FLAG-tag syntetisk biologi
Generation af Plasmidvektorer udtrykker FLAG-mærkede proteiner henhold til forordningen for Human elongeringsfaktor-1α Promoter Brug Gibson Assembly
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C.… More

Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1α Promoter Using Gibson Assembly. J. Vis. Exp. (96), e52235, doi:10.3791/52235 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter