Summary
L'intubation trachéale à médiation (IMIT) instillation de réactifs est une excellente méthode non invasive pour l'étude de la maladie respiratoire, ainsi qu'un procédé pour inculquer réactifs thérapeutiques directement dans le poumon. Il est une méthode rapide et hautement reproductible qui est approprié pour des essais précliniques.
Abstract
Études sur les maladies respiratoires impliquent généralement l'utilisation de modèles murins que les systèmes de substitution. Cependant, il existe des différences physiologiques importantes entre la souris et l'appareil respiratoire humain, en particulier dans leurs voies respiratoires supérieures (URT). Dans certains modèles, ces différences dans la cavité nasale de souris peuvent avoir un impact significatif sur la progression de la maladie et de la présentation dans les voies respiratoires inférieures (LRT) lors de l'utilisation des techniques d'instillation intranasale, limitant potentiellement l'utilité du modèle de souris pour étudier ces maladies. Pour ces raisons, il serait avantageux de développer une technique d'inculquer bactéries directement dans les poumons de souris pour étudier la maladie de TLR en l'absence d'implication de l'URT. Nous avons appelé cette technique spécifique intratrachéale de livraison intubation médiation (GI-TI) instillation du poumon. Cette technique non invasive réduit au minimum le potentiel pour instillation dans la circulation sanguine, ce qui peut se produire au cours de trad plus invasivechirurgicales approches onal intratrachéales d'infection, et limite la possibilité de livraison digestif accessoire de l'appareil. IMIT est un processus en deux étapes dans lequel les souris sont d'abord intubés, avec une étape intermédiaire pour assurer le placement correct du cathéter dans la trachée, suivis par l'insertion d'une aiguille émoussée dans le cathéter de médiation livraison directe de bactéries dans les poumons. Cette approche facilite une efficacité de livraison> 98% dans les poumons avec une excellente distribution de réactif dans l'ensemble du poumon. Ainsi, IMIT représente une nouvelle approche pour étudier les maladies de TLR et administration de produits thérapeutiques directement dans les poumons, l'amélioration de la capacité d'utiliser la souris comme substituts pour étudier les maladies respiratoires chez les humains. En outre, la précision et la reproductibilité de ce système de livraison rend également prête à des normes de pratique de laboratoire (BPL) bons, ainsi que la livraison d'une large gamme de réactifs qui doivent être livrés à haute efficacité pour les poumons.
Introduction
Les souris ont été utilisés pour modéliser les nombreuses manifestations pathologiques chez l'homme, comprenant une multitude de maladies respiratoires. Des modèles de maladies de substitution sont souvent incapables de récapituler tous les aspects d'une maladie modélisé, typiquement en raison des différences physiologiques importantes ou immunitaires dans les deux modèles d'accueil. Ainsi, le but d'améliorer les systèmes de modèle est de développer des approches qui permettent à des substituts reflètent plus étroitement un processus de maladie ou réponse de l'hôte comme on l'observe dans le système hôte d'origine. Il existe plusieurs différences physiologiques importantes entre les souris et les humains dans le mécanisme par lequel ils inspirer l'air. Parmi ces différences sont des différences significatives ratiométriques de taille entre l'URT et LRT. Il a été estimé que les souris possèdent> 100 fois la RUT surface par rapport à l'être humain, contre normalisée totale de 1,2 capacité pulmonaire. Ainsi, les cornets nasaux de la souris permettent plus vaste filtrage de l'air inspiré à faciliter une plus grande vitesse de breathing, qui peut avoir un impact significatif sur les études de pneumonie en cas d'infection de la cavité nasale joue un rôle important dans la progression de la maladie.
Plusieurs approches différentes ont été utilisées pour inculquer des bactéries dans les poumons de souris pour étudier les maladies respiratoires de l'homme-comme. La plus courante de ces approches est l'inoculation intranasale, dans lequel une suspension liquide est appliquée à une ou aux deux narines de souris. Bien que relativement simple, mises en garde telles que le volume d'instillation et le type d'anesthésie utilisé peut influer sur le rendement de l'instillation dans la LRT par inoculation intranasale 3-5. Plus précisément, Miller et al. ont montré que l'instillation intranasale de Francisella tularensis des volumes de moins de 50 pi n'a pas abouti à l'instillation des bactéries dans le TLR 6. Ils ont observé en outre mieux instillation de TLR lors de l'utilisation de l'isoflurane inhalé par opposition à injection de kétamine / xylazine pour l'anesthésie. Cependant, notre expérience avec Yersinia pestis inoculation intranasale indique inoculation plus cohérente peut être réalisé en utilisant la kétamine / xylazine par rapport à l'isoflurane (MBL, données non publiées). Ces différences pourraient être attribuées à des agents pathogènes ou utilisé à des variations dans les procédures de laboratoire, mais surtout mettre en évidence la variabilité potentielle de cette technique. En outre, les poumons récoltés peu de temps après l'instillation intranasale montrent qu'un pourcentage relativement faible de l'inoculum bactérien initial atteint le poumon (dans le cas de Y. pestis, seulement 10% ont été récupérés 1 heure après l'instillation 7), ce qui suggère qu'un grand nombre de bactéries pourraient être retenus dans le TRS (ou avalé dans le tractus gastro-intestinal). Dans certains modèles de maladies, ce dépôt important de bactéries sur la muqueuse de l'URT peut confondre notre compréhension de la progression de la maladie si l'organisme est capable de coloniser la cavité nasale murin d'une manière incompatible avec la maladie humaine. Par exemple, en utilisant in vivo </ Em> imagerie, il a été observé que pseudomallei, qui ne colonise pas l'URT humaine, provoque une infection opportuniste écrasante de la cavité nasale de souris lors de la livraison par la méthode d'instillation intranasale 8.
D'autres procédés pour inculquer des bactéries dans les poumons de souris ont également été utilisés dans la recherche des maladies infectieuses. Cependant, par rapport à l'instillation intranasale ces méthodes ont tendance à exiger plus de compétences techniques et / ou des équipements coûteux sans pour autant éliminer le risque d'infection initiation à plusieurs sites (par exemple, aérosol [URT et TLR]; transorale [tube digestif et TLR]; et intra-trachéale chirurgicale [LRT et sang]). Compte tenu des complications potentielles qui pourraient être associés à des sites secondaires de l'infection, nous avons cherché à développer une approche intra-trachéale qui contourne l'URT et offre pathogène directement dans les poumons de souris anesthésiées, mais limite également inoculat involontaireions dans le sang ou du tube digestif. À cette fin, intratrachéale (GI-TI) instillation d'intubation médiation a été conçu comme une procédure non chirurgicale qui garantit LRT instillation d'inoculum en incluant une étape intermédiaire pour vérifier le placement de cathéter approprié avant l'instillation. Cette méthode est décrite à l'aide de colorant instillation de démontrer visuellement large répartition de l'inoculum dans tout le poumon, et P. aeruginosa instillation de mettre en évidence la livraison très efficace (> 98% de l'inoculum) de cette méthode pour le poumon. Surtout, alors que développé à l'origine pour la livraison bactérienne, IMIT propose également un outil efficace pour: i) l'instillation de diverses molécules à l'étude d'autres modèles de maladies respiratoires, ii) la prestation thérapeutique spécifique du poumon, et iii) des études de la fonction pulmonaire de base, y compris ciblé délivrance d'ARNi dans les poumons.
Protocol
NOTE: Toutes les procédures décrites ici ont été examiné et approuvé par l'Université de Louisville Comité institutionnel de biosécurité (protocole N ° 13 à 056) et institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité (protocole # 13-064).
1. Préparation du colorant
- Diluer à 0,1% (p / v) de bleu de Coomassie dans du PBS et stériliser par filtration à l'aide d'un filtre à seringue de 0,45 uM.
2. Préparation de la culture de Pseudomonas aeruginosa
- 15 heures avant l'instillation, inoculer 3 ml de bouillon de culture avec une seule colonie bactérienne.
- Cultiver la culture 15 heures à 37 ° C sur un agitateur (200 rpm).
- Centrifugeuse 1 ml de culture dans un tube de 1,5 ml à centrifuger 12 000 g pendant 30 sec.
- Retirez le support et remettre en suspension le culot dans 1 ml de PBS.
- Diluer une partie aliquote de la suspension de pâte bactérienne 1:10 dans du PBS et mesurer la DO 600 de la suspension bactérienne diluée pour déterminer laconcentration bactérienne.
- Diluer la suspension bactérienne dans du PBS à la concentration souhaitée de l'inoculum bactérien, en utilisant un volume de 50 ul de livraison pour l'inoculation IMIT.
3. IMIT instillation
- Placer un groupe de souris dans la chambre d'induction d'anesthésie à l'isoflurane et anesthésier en utilisant un 2 - mélange isoflurane / oxygène de 3%.
- A l'apparition initiale de la sédation, la nuque la souris, la souris maintien en position verticale, et d'administrer 10 ul d'une solution de lidocaïne à 2% en aiguille de gavage à l'arrière de la gorge et permettre à la solution de drainer vers le bas à l'épiglotte. Retour de la souris à la chambre de l'anesthésie.
- Prévoir un minimum de 5 min pour permettre la lidocaïne à prendre pleinement effet comme un anesthésique local.
- Lorsque les souris ont atteint le niveau désiré de sédation (taux de ~ 60 bpm à respirer), réduire l'isoflurane à 2% pour maintenir la sédation.
- colorant de précharge ou inoculum bactérien dans 250 pi étanche aux gazseringue ajustement de précision avec une longue aiguille émoussée 22 G.
- Première dresser 150 pi de l'air, mesurée par le piston en téflon de la seringue. Ensuite, dessinez en hausse de 50 ul d'inoculum en avançant le piston en téflon de la barre des 150 pi à la marque de 200 pi sur le corps de la seringue.
NOTE: Lorsque l'échantillon est éjecté dans une souris intubé, la suspension de 50 pi sera livré en premier, suivi par un pl coussin d'air 150 qui distribuera l'inoculum dans l'ensemble du poumon.
- Première dresser 150 pi de l'air, mesurée par le piston en téflon de la seringue. Ensuite, dessinez en hausse de 50 ul d'inoculum en avançant le piston en téflon de la barre des 150 pi à la marque de 200 pi sur le corps de la seringue.
- Retirer une souris de la chambre de l'induction et de jeter sur le dos sur une plate-forme d'intubation. Fixer la souris pour la plate-forme en accrochant ses incisives avec un joint torique attaché à bande Velcro, et la fixation du velcro à la plate-forme. Levez la souris pour une pente de 45 °.
- L'utilisation d'un coton micro applicateur, retirer la langue avec un mouvement de roulement, en utilisant la main dominante.
- Avec la main non dominante, utiliser un ajustement otoscope fonctionnant avec un spéculum d'intubation à la fois maintain langue rétraction et de visualiser la glotte.
- Avec la main dominante, utiliser un fil de guidage enfilée à travers un G cathéter 20 à intuber la souris, d'un coin du cathéter jusqu'à une profondeur de 10 mm dans la trachée de souris (cathéter est en forme d'un manchon en silicone avec 10 mm de cathéter exposé). Retirez le otoscope / spéculum.
- Assurez-vous que la souris a été correctement intubé en fixant le cathéter avec la main non dominante tout en attachant une longueur brièvement connecté Luer de 1/16 "tube transparent contenant un colorant.
NOTE: Le colorant sera rapidement migrer et venir en réponse à la respiration. - Ne pas procéder à des étapes ultérieures si la confirmation de l'intubation n'a pas été établie à ce stade. Si l'intubation a tenté a échoué, réinitialiser le fil de cathéter et le guide pour une tentative supplémentaire d'intubation.
REMARQUE: Il est déconseillé de tenter plus de deux intubations d'une souris dans une seule session sans causer un traumatisme à la souris. - Continuer àfixer le cathéter avec la main non dominante tout en insérant la seringue de précision / aiguille émoussée contenant le liquide coussin suspension / air.
- Verser le liquide / air directement dans les poumons dans un seul mouvement fluide et retirer immédiatement l'aiguille / cathéter de la souris.
- Retour de la souris dans une cage et permettre la récupération de l'anesthésie.
4. Caractérisation des IMT livraison
- Après IMIT instillation, euthanasier la souris en CO 2 asphyxie à un post-inoculation de temps approprié.
- Fixer la souris euthanasiés sur une planche de dissection et faire tremper la poitrine et l'abdomen avec EtOH à 70% en utilisant un vaporisateur.
- Si l'évaluation de la distribution d'un agent de formation d'image à travers le poumon, retirer les poumons de l'animal en utilisant une technique stérile et afficher les poumons comme approprié pour l'imagerie.
REMARQUE:. Poumons peuvent être préparés pour les techniques de coloration histologique supplémentaires grâce à la fixation ou la cryoconservation approprié </ Li> - Si l'évaluation de la charge bactérienne du tissu pulmonaire infecté, retirez les poumons de l'animal en utilisant une technique stérile. La place poumons dans un stérile, préalablement pesé 1 sac de prélèvement des oz. Peser et noter le poids de l'échantillon sac + poumons.
- Ajouter 1 ml de PBS stérile 1x pour chaque échantillon sac + tissus. Refermer le sac de l'échantillon.
- Homogénéiser les tissus par les douces ondulations une pipette de 25 ml sérologique sur l'échantillon + sac tissu.
- Générer des dilutions en série de l'homogénat de poumon dans du PBS stérile et plaque sur plaque de gélose (LB, ou le cas échéant à des espèces bactériennes étudiées):
- Réaliser une dilution en série six fois en un demi-fond plaque de 96 puits par Pipettes multicanaux puis la plaque échantillons en triple par multicanaux sur la plaque de gélose.
- Incuber les plaques de gélose pendant une nuit à 37 ° C et dénombrer les unités formant des colonies le jour suivant.
Representative Results
Pour visualiser la distribution de matériel instillé par la méthode de la GI-TI, 50 pi de 0,1% colorant bleu de Coomassie Brilliant a été instillé dans les poumons d'une souris anesthésiée. La souris a été immédiatement euthanasié et les poumons ont été prélevés par autopsie stérile. La figure 1 montre que le colorant a été remis à tous les lobes du poumon.
Pour déterminer la quantité de bactéries remis aux poumons par la méthode de la GI-TI, trois groupes de souris (n = 3) ont été instillées avec trois concentrations différentes de P. aeruginosa (1,21 x 10 8, 1.21x10 7, et 1,21 x 10 6 unités formant des colonies [CFU] par 50 pi). Immédiatement après l'instillation IMIT, les souris ont été euthanasiées, les poumons retirés, et le nombre de bactéries ont été énumérés et comparés à des inoculums (figure 2). Livraison de l'inoculum est très efficace par cette méthode, avec> 98% de l'inoculum récupéré à partir des poumons de instilléles animaux. En outre, IMIT instillation était hautement reproductible quelle que soit la concentration de l'inoculum (R2 = 0,9951).
Figure 1: IMIT instillation distribue inoculum à travers les poumons Les poumons de souris instillées avec 50 ul de 0,1% de Coomassie colorant bleu Bleu de spectacle distribués dans tous les lobes..
Figure 2:. IMIT instillation de bactéries dans les poumons des souris ont été instillées avec P. aeruginosa et le nombre de bactéries inculquées dans les poumons (log 10 UFC - récupéré) ont été comparées à l'inoculum estimée (log 10 UFC - livré). Chaque cercle représente la CFU / poumon d'une souris individuelle (n = 3 pour chaquedose bactérienne).
Discussion
IMIT instillation offre des améliorations importantes aux modèles de maladies respiratoires existantes dans la capacité d'inculquer reproductible réactifs directement dans les poumons. Il est une approche rapide qui est idéalement situé pour une équipe de deux chercheurs, l'un des qui gère la logistique de l'anesthésie et de mise en cage, et l'autre qui exécute la technique de la GI-TI. De grandes études peuvent être réalisées à l'aide IMIT avec un engagement de temps moyen de 2 - 3 min par souris. Parce que l'approche fait usage de l'isoflurane comme anesthésique, les souris récupérer rapidement de l'anesthésie, la réduction du temps de garde des animaux de surveillance grâce à la récupération.
L'aspect le plus difficile techniquement de la méthode de la GI-TI est la première étape de l'intubation souris. Les personnes qui apprennent à effectuer IMIT sont en mesure de se concentrer sur cette première étape de la pose du cathéter et veiller à ce que l'intubation a été réalisé grâce à la confirmation visuelle de mouvement de colorant. L'avantage de cette approche est que poumon-specIFIC instillation est garantie grâce à l'utilisation de la confirmation de l'intubation, ce qui augmente la confiance à la fois du nouveau chercheur ainsi que l'expert de tenter d'intuber un animal difficile. Les éléments clés de l'optimisation de la probabilité d'une intubation sont: i) la réalisation d'un sédation profonde pour laisser le temps de travail suffisant, ii) le placement correct de la spéculum dans la bouche pour permettre une bonne visualisation de l'épiglotte, iii) le placement de bonne profondeur de la spéculum de sorte que la langue reste en retrait tout au long de la procédure, et iv) l'utilisation de la plate-forme basculante pour soutenir les mains du chercheur ainsi que la procédure se déroule détendu et avec une approche stable.
Une des limites de la procédure de IMIT est liée à la fréquence des événements IMIT d'instillation. À cause du traumatisme potentiel associé à une intubation raté, il est déconseillé de plus de deux tentatives d'intubation être effectuées en une seule séance (jusqu'à deux accidents). IMITa un excellent potentiel dans sa capacité à être utilisé pour fournir des traitements dans les poumons de souris, les schémas thérapeutiques mais qui font usage de livraison très fréquent de réactif dans les poumons peuvent ne pas convenir pour la GI-TI. Il est possible que la GI-TI pourrait être utilisé tous les jours pour fournir des réactifs dans un poumon de souris sans causer de traumatisme important, mais que lorsqu'ils sont réalisés par un chercheur hautement qualifié, comme la majorité des traumatismes liés à l'intubation est pensé pour être associé à un événement d'intubation manquer . Cette IMIT haute fréquence doit être discuté avec les vétérinaires locaux et IACUC.
Une limitation potentielle supplémentaire de la GI-TI est la taille de la souris qui est intubé. La procédure de IMIT décrit ci-dessus a été développé en utilisant des souris d'environ 17 à 22 g, où un cathéter de 20 G a été trouvé être d'une taille adaptée à la trachée de souris dans cette gamme de tailles. Grandes cathéters ont été utilisés avec succès chez la souris âgées; le développement initial de la GI-TI made utilisation d'un cathéter 18 G dans souris BALB / c qui sont> 20 g. Il est important, si les tailles de cathéters de remplacement sont utilisées, les aiguilles doivent être franches qui proviennent adapter à la lumière du cathéter et sont coupés à une longueur qui étend seulement 1 mm au-delà de l'extrémité du cathéter. Intubation de souris plus petites que 17 g peut être possible mais pas recommandé en raison de l'expertise requise, et nécessitait l'utilisation de cathéters plus petits et spéculums sont que décrit ci-dessus.
Nous avons utilisé IMIT pour la livraison de plusieurs agents pathogènes des voies respiratoires, en plus de P. aeruginosa, y compris B. pseudomallei 9 et 10 Klebsiella pneumoniae. Le modèle de la GI-TI a fait d'importants progrès pour nos études de B. maladies respiratoires pseudomallei, après avoir identifié que l'inoculation intranasale entraîne, une morbidité URT-connexe début de souris plutôt que le critère de la maladie systémique observée dans la maladie humaine 9. B. pseudomallei est un Tier 1 Select l'agent de l'impact de la biodéfense, et que ces modèles de maladies respiratoires, sont en cours d'élaboration pour l'exposition aux aérosols qui modèles liés à la biodéfense un itinéraire potentiel d'entrée pour les agents pathogènes en armes. Parce que les modèles courants d'aérosol entraîner une infection à la fois l'URT et TLR, les mêmes potentiels phénotypes de morbidité début nous avons identifié pour le modèle intranasale de B. maladies respiratoires pseudomallei peut demander au modèle d'aérosol. Une adaptation future du modèle de la GI-TI pourrait être une administration par aérosol intubation médiation (IMAD), dans laquelle des souris sont intubé pour livraison cible d'aérosol dans les poumons seulement. Ventilateurs mécaniques sont actuellement disponibles pour maintenir l'anesthésie isoflurane, qui pourrait être adapté pour fournir un, plutôt que sur la base liquide, défi de l'agent pathogène en aérosol.
IMIT a été développé initialement comme une approche pour optimiser la distribution des bactéries dans les poumons, mais a aussi une application pour la fourniture d'autres réactifs dans les poumons de souris. Comme disjuré ci-dessus, l'administration intranasale de composés chez des souris se traduit par une faible efficacité, livraison très variable des réactifs dans l'organe cible du poumon. L'administration intranasale de positons tomographie par émission (PET) réactifs d'imagerie dans les poumons de souris a donné une livraison efficacité de 40% 11, alors que nous avons démontré que la GI-TI offre une excellente alternative à d'autres la livraison du poumon approches avec son> 98% d'efficacité de la livraison et de la distribution multilobaire. Cette amélioration de la délivrance ciblée dans le poumon a le potentiel d'augmenter la reproductibilité de la libération de produits thérapeutiques pour le traitement de maladies pulmonaires. IMIT pourrait de même offrir des avantages aux études de: i) l'impact des irritants pulmonaires environnement, ii) cancer du poumon études phénotypiques, iii) siRNA spécifiques poumon knock-down.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC | 000A3467 | Base should be detached when working in a BSC |
| Operating Otoscope Head | Welch Allyn | 21700 | |
| Otoscope 3.5 V Li Battery | Welch Allyn | 71900 | |
| Mouse Intubation Specula short, Autoclaveable | Hallowell EMC | 200A3589S | |
| Incisor Loops | Hallowell EMC | 210A3490A | |
| Cotton fine tip applicator | Puritan | 871-PC DBL | Used for tongue retraction |
| I.V. Catheter, 20 G | Exel Int | 26741 | Optional: fit a silicon sleeve with 10 mm exposed catheter surface |
| Gas tight syringe, 250 ul | Hamilton | 81120 | Used for delivery of liquid inoculum by IMIT |
| Blunt Needle, 22 G | Hamilton | 91022 | Trim to length to protrude 1 mm from 20 G catheter |
| Guide wire (Fiber optic wire, 0.5 mm) | TheFiberOpticStore.com | FOF .50 | Cut to 6" length: used as guide wire for intubation |
| Tuberculin syringe, 1 ml | Becton Dickinson | 309659 | Assemble with fiber optic wire as guide wire |
| Brilliant Blue R (Coomassie) | Sigma | B0149 | |
| Tygon tubing, 1/16" | Saint Gobain | ALC00002 | |
| Male Luer 1/16" barb | Cole Parmer | 45503-22 | |
| Female Luer 1/16" barb | Cole Parmer | 45500-00 | |
| Lidocaine, USP | Spectrum | LI102 | pH lidocaine into solution at 2%(w/v) pH7.0 |
| Sample bag, 1 oz | Whirl-Pak | B01067 | |
| U-bottom 96 well plate, sterile | Greiner | 650161 |
References
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