Abstract
B lymphocyte chaîne lourde d'immunoglobuline (IgH) recombinaison de commutation de classe (RSE) est un procédé dans lequel initialement exprimé IgM passe à d'autres isotypes IgH, comme IgA, IgE et d'IgG. Mesure de IgH RSE in vitro est une méthode clé pour l'étude d'un certain nombre de processus biologiques allant de recombinaison de l'ADN et de réparation à des aspects de l'immunologie moléculaire et cellulaire. Dosage in vitro RSE implique la cytométrie de flux surface de mesure expression Ig sur les cellules B activées. Bien que la mesure de sous-classes d'IgA et IgG est simple, la mesure des IgE par ce procédé est problématique en raison de la liaison des IgE à FceRII soluble / CD23 exprimé sur la surface de cellules B activées. Nous décrivons ici un procédé unique pour la mesure précise de cellules productrices d'IgE-B de souris qui ont subi RSE en culture. La méthode est basée sur le clivage de la trypsine à médiation de complexes IgE-CD23 sur la surface des cellules, ce qui permet la détection de l'IgE-production de cellules de la lignée B par cytoplasmic coloration. Cette procédure offre une solution pratique pour l'analyse par cytométrie en flux de la RSE à l'IgE.
Introduction
Au cours de chaîne lourde d'immunoglobuline (IgH) recombinaison de commutation de classe (RSE) chez les souris et les humains, l'IgH μ exons de région constante (Cp) sont supprimés et remplacés par un ou plusieurs ensembles de aval exons de région constante (C H s) (par exemple, Cy, Cε, et Ca), résultant en un passage de la production de IgM à la production d'autres classes d'Ig (par exemple IgG, IgE, IgA ou). RSE se produit au sein de commutateur (S), régions qui sont de 1 à 10 kb séquences situées en 5 'de chaque ensemble de C H 1 s. L'enzyme activation induite cytidine désaminase (AID) lance la RSE par l'activité cytidine désamination.
IgE est un médiateur clé de la maladie allergique 2 et une meilleure compréhension de la façon dont IgE est produit et réglementé peut ouvrir des portes à de nouvelles approches thérapeutiques pour la maladie atopique. Chez les souris et les humains, IgE est l'isotype Ig plus strictement réglementée. IgE est normalement détecté à des niveaux milliers de times moins que les autres IgH ISOTYPES 3, mais peut être très élevé dans quatre états pathologiques. Toutefois, la RSE à l'IgE ne est pas complètement comprise. In vitro l'activation des cellules B à l'aide d'IL-4 en combinaison avec l'anti-CD40 ou LPS, induit à la fois à la RSE IgG1 et IgE 5. Cellules B activées expriment le récepteur de faible affinité IgE FceRII / CD23 2,6, qui se lie IgE soluble sécrétée dans la culture après la RSE. Par conséquent, lorsque l'analyse de cytométrie en flux, les cellules B avec récepteur IgE liée tache similaire à B cellules exprimant de manière endogène IgE 7. Se il est connu que la souris B cellules expriment le récepteur de faible affinité IgG FcγRIIB1 (CD32) 8, dans notre expérience, il ne semble pas interférer avec la mesure de la commutation de classe d'IgG1. Cependant, lors de la mesure IgE commutation après l'activation des cellules B dans la culture, non spécifique lié à la surface IgE peut obscurcir l'analyse. Avec les méthodes de coloration communes, les cellules non-IgE exprimant colorent positivement pour les IgE.
Décrite ici est une stratégie qui a été utilisée pour mener des essais en matière de RSE et de détecter les véritables cellules IgE exprimant B de souris 9-11. Le traitement des cellules B activées avec de la trypsine, un réactif de laboratoire commun pour digérer les protéines, supprime surface à la fois lié à la membrane cytophylic et IgE. Après perméabilisation et une coloration cytoplasmique pour IgE révèle ainsi les véritables cellules productrices d'IgE.
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Protocol
NOTE: Toutes les expériences décrites ici étaient en accord avec le Comité soin et l'utilisation des animaux institutionnel (IACUC) directives et approuvé par l'Hôpital pour enfants Animal Research (ARCH), Boston, Mass.
1. Préparation des réactifs
- 1,000x IL-4 Image: Diluer cytokine IL-4 à 20 pg / ml dans H 2 O ou 0,1% d'albumine de sérum bovin (BSA). Répartir en aliquotes de 200 ul de 1,5 ml microtubes et conserver à -20 ° C.
- 1,000x anti-CD40: Obtenir du fabricant à 1,0 mg / ml, conserver à 4 ° C.
- B médias de stimulation cellulaire: Pour 425 ml de milieu RPMI-1640, ajouter 75 ml de sérum de veau foetal fraîchement décongelé (FCS), 10 ml de 1,0 M de tampon HEPES, 5 ml de L-glutamine actions, 5 ml Pénicilline: stocks streptomycine, 5 ml milieu essentiel non-acides aminés essentiels ul (MEM-NEAA), et 3,5 minimum de 2-mercaptoéthanol. Rangez les supports à 4 ° C pendant une semaine. Ajouter IL-4 (20 ng / ml) et anti-CD40 (1,0 pg / ml) immédiatement avant l'emploiseulement au volume de support requis.
- 2% FCS-tampon FACS: Ajouter 10 ml de FCS à 490 ml de PBS 1x. Conserver à 4 ° C.
- 2x solution de trypsine-EDTA: Diluer 5 ml de 10x trypsine-EDTA solution stock (5,0 g trypsine, 2,0 g par litre EDTA) dans 20 ml de PBS 1x. Magasin de trypsine-EDTA à 2x aliquotes de travail à 4 ° C. On laisse réchauffer à température ambiante avant utilisation.
- Sérum de veau foetal: Gardez FCS décongelés à 4 ° C pendant jusqu'à deux semaines. Placez sur la glace 15 minutes avant la procédure de coloration cytoplasmique.
- Neutre-formol tamponné: Préparer une solution de formaline à 10% (3,7% de paraformaldehyde). Le formol est toxique et donc le manipuler sous une hotte de laboratoire, tout en portant des EPI appropriés. formol de magasin à la température ambiante dans une armoire de stockage de produits chimiques.
- Méthanol: Magasin methanol absolu (100%) à -20 ° C jusqu'à ce que les cellules sont prêtes à être perméabilisées. Notez que le méthanol est inflammable et doit être stocké dans un congélateur approprié.
2.La purification et l'activation des cellules B
- A partir d'une rate de souris fraîchement récoltées, préparer une suspension de cellules isolées par pressage de l'organe doucement à travers un tamis cellulaire de 70 pm avec le plongeur d'une seringue de 3 ml. Dans un tube à centrifuger conique de 15 ml, de recueillir les cellules dans 10 ml de 1 x PBS et centrifuger à 300 g pendant 5 min à 4 ° C.
- Décanter le surnageant et remettre le culot dans 1 ml de Red Blood Cell tampon de lyse pendant 5 min. Neutraliser avec 13,5 ml de PBS 1x et centrifuger à 300 g pendant 5 min.
- (Facultatif) séparer magnétiquement les cellules B en utilisant anti-CD45R (B220) marqué à billes, suivant le protocole de purification MACS selon les instructions du fabricant.
- Stimuler les cellules B purifiées à 1,0 x 10 6 cellules / ml dans réchauffé médias de stimulation des cellules B contenant de l'IL-4 (20 ng / ml) et anti-CD40 (1,0 ug / ml) pendant 5 jours à 37 ° C. Commencer avec 8 ml de culture divisé en deux puits d'une plaque de culture à 6 puits (4 ml chacune).
- Vérifiez culture quotidiennement pour maintenir à 1,0 x 10 6 cellules / ml. Ajuster la concentration en fractionnant dans d'autres puits et la dilution de la culture avec un milieu de stimulation de cellules B contenant des frais d'IL-4 et anti-CD40.
3. trypsine, Fixation et perméabilisation
- Trypsinisation
- Recueillir jusqu'à 1,0 x 10 7 cellules cultivées de dans un tube conique de 15 ml, centrifuger à 300 g pendant 5 min et décanter le surnageant.
- Laver avec 10 ml de PBS pour éliminer la protéine résiduelle dans le milieu de collecte de cellules. Répétez l'étape de centrifugation et décanter le surnageant.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans le volume résiduel après décantation (environ 100 pi).
- Ajouter avec précaution 800 ul de la température ambiante de 0,1% (2x) de trypsine-EDTA pour les cellules. Verser lentement à un angle sur le côté du tube conique de 45 °.
- Fermer le tube et mélanger doucement en inclinant le tube de sorte que le liquide se écoule le long de la longueur du temps le tube 5-6s. Un précipité blanc filandreux peut se former dans la solution. Limiter le temps de traitement à la trypsine en vertu d'une min.
- Stopper la réaction de traitement à la trypsine avec 1 ml de FCS froid. Diluer le FCS immédiatement en ajoutant 10 ml de PBS froid.
- Centrifugeuse à 300 g pendant 5 min à 4 ° C, puis décanter le surnageant et retrouver les tubes à la glace.
- Fixation
- Resuspendre les cellules dans le volume résiduel après décantation. Si nécessaire, porter le volume à 100 pi avec du PBS froid.
- Dans une hotte, ajouter 800 ul de solution neutre à 10% de formaline tamponnée à pipeter les cellules et de haut en bas. Le tube se réchauffe lors de l'addition de formol. Incuber à 37 ° C pendant 10 min.
- Perméabilisation
- Mettre en place un mélangeur de paillasse de vortex à une vitesse d'agitation douce.
- Dessin 9 ml de froid (-20 ° C) de methanol dans une pipette sérologique de 10 ml.
- Tenir le tube contenant les cellules sur le vortex et commencer doucement shaking les cellules.
- Ajouter methanol froid pour le tube de sorte qu'il tombe goutte à goutte sur les cellules tandis que le tube tremble encore de sorte que le méthanol est continuellement mélange. Après les 2 premiers ml de methanol la vitesse de distribution peut être augmentée à un lent courant.
- Laissez reposer le tube sur la glace pendant 30 min pour achever la perméabilisation. En variante, les cellules peuvent être stockées à -20 ° C pendant jusqu'à un mois.
4. fluorescence Coloration pour IgG1 et IgE commutation Classe
- échantillon de Centrifugeuse à 300 g pendant 5 min et décanter la solution de méthanol. Un précipité blanc peut se sédimenter les cellules.
- Ajouter 10 ml de la température ambiante 1x PBS et centrifuger à 300 g pendant 5 min pour laver les cellules. Répéter une fois. Remarque: Se laver le culot avec la température ambiante PBS dissout précipité supplémentaire qui peut se former après l'étape 4.1.
- Effectuer un lavage supplémentaire avec 10 ml de tampon FACS FCS-2%.
- Distribuer des échantillons à un 96 puits ronde plaque de fondet centrifuger à 300 g pendant 5 min. Décanter le surnageant et mettre la plaque sur la glace.
- Colorer dans 60 pi de tampon FCS-FACS 2% par puits avec les dilutions d'anticorps suivantes: Anti-IgM RPE / Cy7, 1: 200, anti-IgG1 PE, 1: 600, anti-IgE FITC, 1: 100, anti- CD45R (B220) PerCP-Cy5.5, 1: 200
- Après 5 min de la coloration, laver la plaque avec 150 ul de 2% de tampon FCS-FACS et centrifuger pendant 5 min à 300 x g.
- Remettre en suspension dans 400 ul de tampon 2% de FCS et FACS pipette à travers un filtre cellulaire en nylon de 40 pm en une 5 ml FACS tube.
5. Utilisez la Stratégie Gating la suite:
- Isoler CD45R (B220) cellules positives de la population de lymphocytes dynamitage situé sur la / lot SSC FSC (Figure 1).
- A partir des cellules positives B220, utiliser l'intrigue IgE et IgG1 de révéler les populations correspondantes.
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Representative Results
Cette procédure a été mise en œuvre avec succès pour étudier la RSE à l'IgE dans les cellules B de souris. Pour démontrer l'efficacité de la mesure de RSE, nous avons stimulé les lymphocytes B spléniques de souris avec des anticorps anti-CD40 et IL-4 comme décrit précédemment 11. Après cinq jours de stimulation, les cellules ont été recueillies et traitées en utilisant le protocole décrit ci-dessus et colorées avec marqué par fluorescence IgM, IgG1, IgE, des anticorps et B220 (CD45R). Fermé sur les lymphocytes de dynamitage (Figure 1), une population précise de cellules IgE + ne peuvent pas être proprement discriminatoires sans traitement à la trypsine (Figure 2a). Cependant, trypsinisation des cellules avant la fixation et perméabilisation permet la séparation des cellules productrices d'IgE (figure 2b) en raison de la suppression des IgE lié à une surface.
Figure 1: Forwlymphocytes ard rapport à la diffusion latérale FACS parcelle de cellules spléniques de la souris B après cinq jours de stimulation dans la culture avec de l'IL-4 et anti-CD40. dynamitage représentent 63% du total des acquis événements.
Figure 2:. Effet de la trypsine sur coloration cytoplasmique des IgE et IgG1 dans les cellules B activées (a, b) les parcelles de FACS (ci-dessus) et des histogrammes (ci-dessous) gated sur dynamitage cellules B spléniques de souris 129 de fond mixtes / B6 après activation dans la culture pendant 5 jours avec anti-CD40 et IL-4. Fixation et perméabilisation methanol seul (a) et avec addition de trypsine (b) sont représentés.
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Discussion
La stimulation de la rate de souris les cellules B dans la culture avec anti-CD40 et IL-4 simule T auxiliaires de type 2 (T H 2) les interactions, la commutation de classe IgG1 et encourageant de 5 IgE. cellules B peuvent être activés pour la RSE dans le contexte de splénocytes un total de 12 ou de cellules B spléniques purifiées comme 11. Comme indiqué dans le protocole (étape 2.3), l'enrichissement des cellules B est facultative, et est à la discrétion de l'expérimentateur pour déterminer se il serait bénéfique. Séparation magnétique positive des cellules B en utilisant CD45R (B220) marqué à billes est utilisé ici. Après la séparation, il est recommandé de vérifier la pureté de cellules par FACS pour que la concentration des cellules B peut être ajusté à 1,0 x 10 6 cellules / ml pour la cytokine appropriée et la stimulation d'anticorps. En outre, il convient de noter que l'IL-4 qui a subi une protéine de gel / dégel aurait diminution de l'activité.
Trypsinisation des cellules avant fixation et perméabilisation permet de Accurmangé la mesure de la commutation de classe par cytométrie de flux (Figure 2). Trypsinisation correcte des cellules est essentiel à la bonne application de cette procédure. Comme FCS peut inhiber la trypsine, un lavage PBS 1x est réalisée avant l'étape de traitement à la trypsine. Nous avons trouvé une incubation de 30 secondes à la température ambiante est suffisante pour la digestion complète. Plus longues durées peuvent sensiblement affecter la viabilité cellulaire.
Avant l'analyse, il est essentiel de se laver les cellules plusieurs fois avec du PBS pour éliminer les traces de méthanol. Méthanol report peut modifier liaison 13 anticorps et peut précipiter les protéines de FCS utilisés dans le flux aval analyse cytométrique 14. À cet égard, d'autres procédés de perméabilisation de la saponine (par exemple) peut être une alternative à l'utilisation du methanol. Le methanol est un solvant organique qui dissout les lipides de la membrane, tandis que les détergents perturber l'intégrité de la membrane 15. Un avantage de methanol perméabilisation est la capacité de stockage étenduedes cellules fixées à -20 ° C 14.
Il ya quelques limitations à garder à l'esprit lorsque vous utilisez cette procédure. Parce que la trypsine clive résidus de protéines, des taches peuvent apparaître différents FACS après le traitement, ou peuvent perdre la capacité de se lier à des épitopes cible tout à fait. En outre, une perte du nombre de cellules après traitement à la trypsine peut se produire. Toutefois, cela ne semble pas affecter la précision des mesures des IgE RSE comme nous l'avons constaté que cette méthode soit clairement comparables aux données de commutation de classe recueillies auprès de mesurer les sécrétions d'anticorps de clones d'hybridomes individuels 11.
D'autres procédés ont été rapportés pour détecter les cellules productrices d'IgE-B de souris. Une méthode utilise une procédure de lavage acide pour enlever lié au récepteur IgE avant la coloration pour membranaire IgE sur les cellules IgE exprimant 16-18. Un autre procédé utilise un anticorps monoclonal anti-IgE pour bloquer tout IgE surface avant de la cellule permeabilization et la coloration intracellulaire pour l'IgE des cellules exprimant 19 l'IgE. En outre, une étude récente profilé un FACS panneau huit couleurs pour identifier les populations cellulaires B IgE-commutés chez les humains en excluant IgM +, + IgD, IgA et IgG + B + sous-ensembles cellulaires 20. Par rapport à ces autres méthodes, le procédé décrit ici permet d'éviter l'utilisation de solutions de lavage pour la dénaturation d'acides, et des anticorps en excès ne sont pas nécessaires.
Un avantage de cette procédure est qu'elle ne prescrit pas d'anticorps monoclonaux spécifiques pour la mesure de la RSE à l'IgE. Autres anticorps monoclonaux anti-IgE ont été montrés pour détecter seulement les molécules d'IgE endogènes. Le clone d'hybridome R1E4 produit un anticorps monoclonal IgE anti souris de rat spécifique seulement pour des molécules de surface endogènes, non cytophile IgE liée à 21,22 CD23, mais ne est pas disponible dans le commerce. Le protocole décrit ci-dessus est pratique et économique car elle utilise reage de laboratoire communnts. L'anticorps anti-IgE utilisée ici se lie probablement liée au récepteur de IgE à un site sensible à la trypsine pour le clivage à médiation par IgE car le signal en raison de cytophile IgE est réduite après le traitement (figure 2). Cependant les chercheurs d'exécution de ce protocole ont la liberté de choisir parmi une gamme de clones disponibles dans le commerce pour des expériences. En outre, le concept de l'utilisation de la trypsine pour éliminer les protéines de surface cellulaire peut être étendue à la détection d'autres marqueurs de cellules par analyse FACS.
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Acknowledgments
DRW est financé par des subventions du NIH AI089972 et AI113217, et par les études Immunologie équipe muqueuses, et titulaire d'une bourse de carrière pour les scientifiques médicaux du Burroughs Wellcome Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Mouse IgE FITC | BD Pharmingen | 553415 | clone R35-72 |
| Rat Anti-Mouse IgG1 PE | BD Pharmingen | 550083 | clone A85-1 |
| Methanol | BDH | BDH1135-4LP | Keep at -20 °C |
| Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
| Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
| Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-4052-82 | clone RA3-6B2 |
| anti-Mouse/Rat CD40 | eBioscience | 16-0402-85 | clone HM40-3 |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| MEM-NEAA (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Lifetechnologies (Corning) | 46-013-CM | |
| MACS CD45R (B220) microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-501 | |
| MACS purification column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| IL-4 | PeproTech | 214-14 | Reconstitute in water or 0.1% BSA |
| Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma Aldrich | T4174-100 ml | 5.0 g Trypsin, 2.0 g EDTA•4 Na per Liter of 0.9% NaCl |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100 ml | 10,000 U Penicillin; 10 mg/ml Streptomycin (100x) |
| L-Glutamine 200 mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| 2-mercaptoethanol (99%) | Sigma Aldrich | M6250-100 ml | |
| Red cell lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| Rat Anti-Mouse IgM RPE/Cy7 | SouthernBiotech | 1140-17 | clone 1B4B1 |
| HyClone Fetal Calf Serum | Thermo | SH30910.03 | |
| B cell Stimulation media | B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2.0 mM L-glutamine, 1x Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/ml), and anti-CD40 (1 µg/ml) |
References
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