Summary

진정한 검출 마우스 B 리니지 세포를 IgE 항체가 발현

Published: December 01, 2014
doi:

Summary

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

Abstract

B 림프구 면역 글로불린 중쇄 (IGH) 클래스 스위치 재조합 (CSR)은 처음에 IgM 항체 등의 IgA, IgE 항체와 IgG의 다른 고등학교의 이소 타입으로 전환 표현 된 것을 특징으로하는 과정이다. 시험 관내 IGH CSR의 측정은 분자 세포 면역학의 측면 DNA 재조합 및 수리에 이르기까지 생물학적 공정 수의 연구를위한 중요한 방법이다. 관내 CSR 분석은 활성화 된 B 세포에 대한 유세포 측정면 IG 표현식을 수반한다. 의 IgA와 IgG의 서브 클래스의 측정이 간단하지만,이 방법으로 IgE 항체의 측정으로 인해 용해 IgE 항체가 FcεRII에 결합에 문제가있다 / CD23 활성화 B 세포의 표면에 발현. 여기에서 우리는 문화에 CSR을받은 마우스 B 세포를 IgE 항체가 생산의 정확한 측정을위한 고유 한 절차를 설명합니다. 방법 B에 의해 CY 계통 세포의 IgE가 생산의 검출을 허용 세포 표면에 대한 IgE CD23 복합체 트립신 – 매개 절단에 기초toplasmic 염색. 이 절차에 대한 IgE의 CSR 유세포 분석을위한 편리한 해결책을 제공한다.

Introduction

마우스와 인간 면역 글로불린 중쇄 (IGH) 클래스 스위치 재조합 (CSR) 중, 고등학교의는 일정한 지역 엑손 (Cμ가) 삭제 및 다운 스트림 일정한 지역 엑손의 여러 세트 중 하나 (C의 H s의) (예를 들어 Cγ로 대체 μ IG 다른 클래스 (예를 들면 IgG를, IgE 항체, 또는 적 IgA)의 제조에 대한 IgM 항체의 생산에서 발생 Cε 스위치 및 Cα). CSR은 C H의 1의 각 세트 5 '위치 1-10킬로바이트 시퀀스는 스위치 (S) 지역 내에서 발생합니다. 활성화 – 유도 시티 딘 데 아미나 제 (AID) 효소는 시티 딘의 탈 아미노 활동을 통해 CSR을 시작합니다.

IgE 항체는 알레르기 질환 2의 주요 중재자 및 IgE의 생산 및 아토피 질환에 대한 새로운 치료 방법으로 문을 열 수 있습니다 규제 방법에 대한 이해이다. 마우스와 인간에서의 IgE는 가장 엄격하게 규제 IG 이소 타입이다. IgE 항체는 일반적으로 팀의 수준 수천에서 감지ES 다른 IGH 미만 3 아이소 타입이지만 높은 질환 상태 4에서 증가 될 수있다. 그러나 IgE 항체에 CSR은 불완전하게 이해된다. B 세포의 체외 활성화는 IL-4 항 CD40 또는 LPS 중 하나와 조합은, 모두의 IgG1과 IgE의 5 CSR을 유도하여. 활성화 된 B 세포를 용해 IgE 항체가 CSR 후 문화 분비 결합 선호도가 낮은의 IgE 수용체 FcεRII / CD23 2,6-을 표현한다. 유동 세포 계측법으로 분석 할 때 따라서, 수용체에 결합 된 IgE의 얼룩 B 세포는 유사 내생 적 IgE 항체 (7)를 발현하는 세포를 B로. 그것은 그 마우스 B를 알려져 있지만 세포는의 IgG1에 클래스 전환의 측정에 방해가 나타나지 않는 우리의 경험에서 선호도가 낮은 IgG의 수용체 FcγRIIB1 (CD32) 8을 표현한다. 배양에서 B 세포 활성화 후 IgE의 전환을 측정하는 경우에는, 표면 – 결합 특이성 IgE 항체는 분석을 가릴 수있다. 공통 염색 방법과 비 IgE 항체 발현 세포가 IgE에 대해 긍정적으로 염색.

여기에 설명 된 마우스 (9)로부터 참의 IgE 발현 B 세포를 CSR 세이를 수행하고 검출하는데 이용 된 전략 – 11. 트립신으로 활성화 된 B 세포의 치료는 일반적인 실험실 시약은 단백질을 소화, 세포 친화 및 막 모두 결합 된 표면의 IgE는 제거합니다. 세포질 IgE에 대한 후속 투과성으로 염색 따라서 진정한 IgE 항체 생산 세포를 보여준다.

Protocol

참고 : 여기에 설명 된 모든 실험은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 가이드 라인에 따라했고, 동물 연구 아동 병원 (ARCH), 보스턴, 질량에 의해 승인했다. 시약 1. 준비 1000 배 스톡 IL-4 : H 2 O 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)의 20 μg의 / ㎖ 묽은 IL-4 사이토 카인. -20 ℃에서 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브 및 상점을 200㎕ 분량 씩 분주한다. 1,000 배 안티 CD40 : 4 ℃에서 1.0 ㎎ /…

Representative Results

이 절차가 성공적으로 마우스 B 세포에서 IgE 항체에 CSR을 연구하기 위해 구현되었습니다. 앞서 설명한 바와 같이 11 CSR 측정에서 효율을 입증하기 위해, 우리는 항 CD40 및 IL-4와 마우스 비장 B 세포를 자극. 자극 5 일 후, 세포를 수거하고, 프로토콜 형광 표지 IgM이, IgG1에, IgE 항체, 및 B220 (CD45R) 항체 상술과 염색을 이용하여 처리 하였다. (도 1), + 세포의 IgE에 명확한 인구 깔끔하?…

Discussion

항 CD40 및 IL-4와 문화에 마우스 비장 B 세포의 자극의 IgG1과 IgE의 5 T 도우미 2 형 (T H 2) 상호 작용을 격려 클래스 전환을 시뮬레이션합니다. B 세포는 비장 세포 총 12 또는 정제 된 비장의 B 세포 (11)의 맥락에서 CSR을 위해 활성화 될 수있다. 프로토콜 (단계 2.3)에서 설명한 바와 같이, B 세포 농축은 선택 사항이며, 그것은 유익 할 것이다 있는지 확인 실험자의 판단이?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

DRW는 NIH 보조금 AI089972과 AI113217,에 의해 점막 면역학 연구 팀에 의해 지원하고, 버로우즈 웰컴 기금 의료 과학자에 대한 경력 상을 보유하고있다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Mouse IgE FITC BD Pharmingen 553415 clone R35-72
Rat Anti-Mouse IgG1 PE BD Pharmingen 550083 clone A85-1
Methanol BDH BDH1135-4LP Keep at -20 °C
Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon Corning 352340
Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon Corning 352350
Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 eBioscience 45-4052-82 clone RA3-6B2
anti-Mouse/Rat CD40 eBioscience 16-0402-85 clone HM40-3
RPMI Medium 1640 Gibco 11875-093
HEPES (1M) Gibco 15630-080
MEM-NEAA (100X) Gibco 11140-050
Phosphate Buffered Saline (10X) Lifetechnologies (Corning) 46-013-CM
MACS CD45R (B220) microbeads  Miltenyi Biotec 130-049-501
MACS purification column Miltenyi Biotec 130-042-401
IL-4 PeproTech 214-14 Reconstitute in water or 0.1% BSA
Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% Sigma Aldrich HT501128-4L
Trypsin-EDTA Solution (10X) Sigma Aldrich T4174-100mL 5.0g Trypsin, 2.0g EDTAŸ4Na per Liter of 0.9% NaCl
Penicillin-Streptomycin Sigma Aldrich P0781-100mL 10,000U Penicillin; 10 mg/mL Streptomycin (100X)
L-Glutamine 200mM Sigma Aldrich G7513
2-mercaptoethanol (99%) Sigma Aldrich M6250-100mL
Red cell lysis buffer Sigma Aldrich R7757
Rat Anti-Mouse IgM RPE/cy7 SouthernBiotech 1140-17 clone 1B4B1
HyClone Fetal Calf Serum Thermo SH30910.03
B cell Stimulation media B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1X MEM-NEAA, 2.0mM L-glutamine,  1X Penicillin-Streptomycin (Penicillin:100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/mL), and anti-CD40 (1 µg/mL)

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Cite This Article
Gallagher, M. P., Shrestha, A., Magee, J. M., Wesemann, D. R. Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells. J. Vis. Exp. (94), e52264, doi:10.3791/52264 (2014).

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