Abstract
B imunoglobulina linfócitos cadeia pesada (HGI) recombinação mudança de classe (CSR) é um processo em que, inicialmente, expressa IgM muda para outros isotipos CMI, tais como IgA, IgE e IgG. Medição de IgH RSE in vitro é um método fundamental para o estudo de uma série de processos biológicos variam de recombinação e reparação do ADN de aspectos da imunologia molecular e celular. Ensaio in vitro RSE envolve a superfície de medição de citometria de fluxo a expressão de Ig em células B activadas. Embora a medição de IgA e IgG subclasses é simples, medição de IgE por este método é problemático devido à ligação de IgE a FceRII solúvel / CD23 expresso na superfície de células B activadas. Aqui, descrevemos um processo único para a medição precisa de IgE células B de ratinho produtora que tenham sido submetidos a RSE em cultura. O método baseia-se na clivagem mediada por tripsina de complexos IgE-CD23 na superfície das células, permitindo a detecção de células produtoras de IgE da linhagem B por cycoloração toplasmic. Este procedimento oferece uma solução conveniente para a análise de citometria de fluxo de CSR para IgE.
Introduction
Durante cadeia pesada de imunoglobulina (IgH) recombinação mudança de classe (CSR) em ratos e seres humanos, o IgH μ exons região constante (Cμ) são eliminados e substituídos por um dos vários conjuntos de jusante exons região constante (C H s) (por exemplo, Cy, Cε, e Ca), resultando numa passagem da produção de IgM para a produção de outras classes de Ig (por exemplo, IgG, IgE, ou IgA). RSE ocorre dentro de regiões de troca (S), que são sequências de 1-10 kb localizado 5 'em cada conjunto de C H 1 s. A enzima Activação Induzida citidina-desaminase (AID) inicia RSE através da actividade de citidina de desaminação.
IgE é um mediador chave da doença alérgica 2 e uma maior compreensão de como IgE é produzida e regulamentada pode abrir as portas para novas abordagens terapêuticas para a doença atópica. Em ratos e seres humanos, IgE é o isotipo Ig mais rigidamente controlado. IgE é normalmente detectada em níveis milhares de times menos do que outros isotipos de IgH 3, mas pode ser muito elevado em estados de doença 4. No entanto, a RSE para IgE é completamente compreendida. In vitro a activação de células B com IL-4 em combinação com anti-CD40 ou LPS, induz RSE para ambos IgG1 e IgE 5. Células B ativadas expressar a baixa afinidade receptor IgE FceRII / CD23 2,6, que liga IgE solúvel secretada em cultura após CSR. Portanto, quando a análise por citometria de fluxo, as células B com receptor de IgE ligado a mancha de modo semelhante às células B expressando IgE 7 endogenamente. Embora se saiba que o mouse B células expressam a baixa afinidade IgG receptor FcγRIIB1 (CD32) 8, em nossa experiência, não parece interferir com a medição da classe de comutação para IgG1. No entanto, quando se mede a IgE de comutação após a activação das células B em cultura, não específica ligada à superfície IgE pode obscurecer a análise. Com métodos de coloração comuns, as células não-IgE-expressando manchar positivamente para IgE.
Esboçado aqui é uma estratégia que tem sido utilizada para realizar ensaios de RSE e detectar células B expressando IgE verdadeiros de ratos 9-11. O tratamento de células B activadas com tripsina, um reagente de laboratório comum para digerir a proteína, remove tanto cytophylic superfície e ligada à membrana de IgE. Permeabilização e subsequente coloração citoplasmática para IgE revela, assim, as células produtoras de IgE verdadeiros.
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Protocol
NOTA: Todas as experiências descritas aqui foram de acordo com as diretrizes Comitê Cuidados e Uso de Animais Institucional (IACUC) e aprovado pelo Animal Hospital Research para a Infância (ARCH), Boston, Massachusetts.
1. Preparação dos Reagentes
- 1.000x IL-4 Stock: Diluir citocina IL-4 a 20 ng / ml em H2O ou 0,1% de albumina de soro bovino (BSA). Distribuir em alíquotas de 200 ul a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e armazenar a -20 ° C.
- 1.000 vezes anti-CD40: obter do fabricante a 1,0 mg / ml, armazenar a 4 ° C.
- Meios estimulação das células B: Para 425 ml de meio RPMI-1640, adicionar 75 ml de descongelado de fresco de soro fetal de vitelo (FCS), 10 ml de tampão HEPES 1,0 M, 5 ml de caldo de L-glutamina, 5 mL de Penicilina: stock de Estreptomicina, 5 ml essenciais Médio não-essenciais Aminoácidos jul (MAM-NEAA), e 3,5 mínimo de 2-mercaptoetanol. Mantenha o material a 4 ° C por até uma semana. Adicionar IL-4 (20 ng / ml) e anti-CD40 (1,0 ug / ml) imediatamente antes da utilizaçãoapenas com o volume de material necessário.
- 2% de FCS em FACS Buffer: Adicionam-se 10 ml de FCS e 490 mL de PBS 1x. Mantenha a 4 ° C.
- 2x solução de tripsina-EDTA: Diluir 5 ml de 10x solução estoque de tripsina-EDTA (tripsina 5,0 g, 2,0 g de EDTA por litro) em 20 ml de PBS 1x. Loja de tripsina-EDTA em 2x alíquotas trabalhando a 4 ° C. Deixa-se aquecer até à temperatura ambiente antes do uso.
- Soro fetal bovino: Manter FCS descongeladas a 4 ° C por até duas semanas. Colocar em gelo 15 min antes do processo de coloração citoplasmática.
- Neutro-tamponada de formalina: Prepare uma solução de formol a 10% (3,7% de paraformaldeído). Formalin é tóxico e, portanto, lidar com ele sob uma fume hood laboratório enquanto usava EPI adequado. Formalina loja à temperatura ambiente em um armário de armazenamento de produtos químicos.
- Metanol: loja metanol absoluto (100%) a -20 ° C até as células estão prontas para ser permeabilizadas. Note-se que o metanol é inflamável e deve ser armazenado em freezer apropriado.
2.Purificação e activação de células B
- A partir de um baço recém-colhida rato, preparar uma suspensão de células individuais, pressionando suavemente o órgão através de um filtro de células 70 um com o êmbolo de uma seringa de 3 ml. Num tubo de centrífuga de 15 mL cónico, recolher as células em 10 ml de PBS 1x e centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 ml de células vermelhas do sangue tampão de lise durante 5 min. Neutraliza-se com 13,5 ml de PBS 1x e centrifugar a 300 xg durante 5 min.
- (Opcional) magneticamente separar as células B, utilizando anti-CD45R (B220) marcado com grânulos, seguindo o protocolo de purificação MACS acordo com as instruções do fabricante.
- Estimular as células B purificadas a 1,0 x 10 6 células / ml em meios aquecida a estimulação das células B contendo IL-4 (20 ng / ml) e anti-CD40 (1,0 ug / ml) durante 5 dias a 37 ° C. Comece com 8 ml de cultura divididos em dois poços de uma placa de cultura de 6 poços (4 ml cada).
- Verifique culture diária para manter a 1,0 x 10 6 células / ml. Ajustar a concentração através da divisão em outras cavidades e a diluição da cultura com meio de estimulação das células B fresco contendo IL-4 e anti-CD40.
3. A tripsinização, Fixação e permeabilização
- Tripsiniza�o
- Recolhe-se a 1,0 x 10 7 de células de cultura num tubo de 15 ml, centrifugar a 300 xg durante 5 minutos, e decanta-se o sobrenadante.
- Lava-se com 10 ml de PBS para remover a proteína residual a partir do suporte de recolha de células. Repetir o passo de centrifugação e decantar o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento de células no volume residual após decantação (cerca de 100 uL).
- Adiciona-se cuidadosamente 800 ul de 0,1% temperatura ambiente (2x) de tripsina-EDTA para as células. Dispensar lentamente num ângulo de 45 ° para o lado do tubo cónico.
- Fechar o tubo e misturar suavemente pela inclinação do tubo de modo que o líquido corre ao longo do comprimento do tubo de tempo 5-6s. Um precipitado pegajoso, branco pode formar-se na solução. Limite o tempo de tripsinização para menos de um min.
- Extingue-se a reacção tripsinização com 1 ml de FCS a frio. Dilui-se o FCS imediatamente por adição de 10 ml de PBS frio.
- Centrifuga-se a 300 xg durante 5 min a 4 ° C, depois decanta-se o sobrenadante e devolver os tubos em gelo.
- Fixação
- Ressuspender as células do volume residual, após decantação. Se necessário, levar o volume até 100 ml com PBS frio.
- Numa hotte, adicionar 800 ul de solução de formalina tamponada neutra a 10% para as células e pipetar para cima e para baixo. O tubo vai aquecer após a adição de formalina. Incubar a 37 ° C durante 10 min.
- Permeabilização
- Configurar um misturador de bancada vortex a uma velocidade agitação suave.
- Desenhar 9 ml de frio (-20 ° C) de metanol em 10 ml de uma pipeta serológica.
- Segurar o tubo contendo as células ao longo do misturador de vórtice e suavemente começar tremendog das células.
- Adicionar metanol frio para o tubo assim que cai gota a gota sobre as células, enquanto o tubo está ainda agitação, de modo que o metanol é se mistura continuamente. Depois dos primeiros 2 ml de metanol a velocidade de distribuição pode ser aumentada para um caudal lento.
- Deixe o tubo de sentar em gelo durante 30 min para completar a permeabilização. Alternativamente, as células podem ser armazenadas a -20 ° C durante até um mês.
4. A fluorescência de coloração para IgG1 e IgE Classe Switching
- Amostra Centrifugar a 300 xg durante 5 minutos e decantar a solução de metanol. Um precipitado branco podem sedimentar com as células.
- Adicionar 10 ml de 1x PBS temperatura ambiente e centrifugar a 300 xg durante 5 minutos para lavar as células. Repetir uma vez. Nota: A lavagem do pellet com temperatura ambiente PBS dissolve precipitado extra que podem formar após o passo 4.1.
- Realizar uma lavagem adicional com 10 ml de 2% FCS-tampão de FACS.
- Distribuir amostras de 96 poços rodada placa de fundoe centrifugar a 300 xg durante 5 min. Decantar o sobrenadante e colocar a placa no gelo.
- Mancha em 60 ul de tampão de 2% de FCS em FACS por poço com as seguintes diluições de anticorpos: anti-IgM RPE / Cy7, 1: 200, anti-IgG1 de PE, 1: 600, FITC anti-IgE, 1: 100, Anti CD45R (B220), PerCP-Cy5.5, 1: 200
- Após 5 min de coloração, lavar a placa com 150 ul de 2% de FCS-tampão de FACS e centrifugar durante 5 minutos a 300 x g.
- Ressuspender em 400 ul de tampão de 2% de FCS em FACS e por meio de uma pipeta de 40 um coador de células de nylon para um tubo de 5 ml de FACS.
5. Use a Estratégia Gating seguir:
- Isolar CD45R (B220) células positivas da população de linfócitos jateamento localizado no / parcela SSC FSC (Figura 1).
- A partir das células positivas B220, utilizar o lote de IgE e IgG1 para revelar as populações correspondentes.
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Representative Results
Este procedimento foi implementado com sucesso para estudar CSR para IgE em células B de ratinho. Para demonstrar a eficiência na medição RSE, que estimulou as células B do baço de ratinho com anticorpo anti-CD40 e IL-4 como descrito anteriormente 11. Depois de cinco dias de estimulação, as células foram recolhidas e processadas utilizando o protocolo descrito acima e coradas com fluorescência marcado IgM, IgG1, IgE, anticorpos e B220 (CD45R). Recolhidas em linfócitos de detonação (Figura 1), uma população de células claras IgE + não podem ser discriminados de modo limpo sem tratamento com tripsina (Figura 2a). No entanto, a tripsinização de células antes da sua fixação e permeabilização permite a separação das células produtoras de IgE (Figura 2b), devido à remoção da IgE ligada à superfície.
Figura 1: FORWlinfócitos ard vs. dispersão lateral FACS lote de células de baço de rato B após 5 dias de estimulação em cultura com IL-4 e anti-CD40. jateamento compõem 63% do total adquirido eventos.
Figura 2:. Efeito da tripsina sobre coloração citoplasmática de IgE e IgG1 nas células B activadas (a, b) parcelas de FACS (acima), e os histogramas (abaixo) seleccionadas na decapagem células B do baço de 129 / B6 mistos ratos depois da activação de fundo na cultura durante 5 dias, com anti-CD40 e IL-4. Fixação e permeabilização metanol sozinho (a) e com adição de tripsina (b) são mostradas.
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Discussion
A estimulação de células B do baço de rato em cultura com anti-CD40 e IL-4 irá simular tipo T helper 2 (T H 2) interacções, troca de classe encorajador IgG1 e IgE 5. As células B podem ser ativados para a RSE no âmbito do total esplenocitos 12 ou células B do baço como purificados 11. Como foi observado no protocolo (passo 2.3), o enriquecimento de células B é opcional, e fica ao critério do experimentador para determinar se seria benéfico. Separação magnética positiva de células B, utilizando CD45R (B220) marcado com grânulos é utilizada aqui. Após a separação, é recomendado verificar a pureza por FACS de células de modo a que a concentração de células B pode ser ajustada a 1,0 x 10 6 células / ml para a estimulação de citocinas e anticorpo adequado. Também deve notar-se que a IL-4 de proteína que sofreu ciclos de congelamento / descongelamento poderia ter actividade diminuída.
A tripsinização de células antes da fixação e permeabilização permite o raciocínio se aplicaComeram medição da mudança de classe via citometria de fluxo (Figura 2). Tripsiniza�o adequada das células é vital para o sucesso da aplicação deste procedimento. Como FCS pode inibir a tripsina, uma lavagem de PBS 1x é realizada antes da etapa de tripsinização. Encontrou-se uma incubação de 30 segundos à temperatura ambiente é suficiente para a digestão completa. Durações mais longas podem afetar significativamente a viabilidade celular.
Antes da análise, que é essencial para lavar as células várias vezes com PBS para remover os vestígios de metanol. Metanol transição só pode alterar a ligação do anticorpo 13 e pode precipitar proteínas a partir de FCS utilizados na análise de citometria de fluxo a jusante 14. A este respeito, outros métodos de permeabilização (isto é, saponina) pode ser uma alternativa ao uso de metanol. O metanol é um solvente orgânico que dissolve lípidos da membrana, enquanto que os detergentes perturbar a integridade da membrana 15. Um benefício de metanol permeabilização é a capacidade de armazenamento prolongadode células fixadas a -20 ° C 14.
Existem algumas limitações para manter em mente quando se utiliza este procedimento. Porque tripsina cliva resíduos de proteínas, algumas manchas de FACS podem parecer diferentes após o tratamento, ou pode perder a capacidade de se ligar ao alvo epitopos completamente. Além disso, uma perda no número de células após o tratamento com tripsina pode ocorrer. No entanto, isso não parece afetar a precisão das medições de IgE de RSE que temos encontrado este método a ser claramente comparáveis aos dados coletados a partir de troca de classe medir as secreções de anticorpos de clones de hibridoma 11 individuais.
Outros métodos têm sido relatados para detectar produtoras de IgE células B de ratinho. Um método utiliza um procedimento de lavagem com ácido para remover a IgE ligada ao receptor antes da coloração para a IgE ligada à membrana em células expressando IgE 16-18. Outro método utiliza um anticorpo monoclonal anti-IgE para bloquear toda a superfície antes de IgE permeabiliz célulação e coloração intracelular para IgE das células expressando IgE-19. Além disso, um estudo recente de um perfilado de oito cores FACS painel para identificar populações de células B IgE comutados em seres humanos através da exclusão + IgM, IgD +, IgG + IgA + B e subconjuntos de células 20. Comparado com estes métodos, o método aqui descrito evita a utilização de desnaturantes lavagens com ácido e excesso de anticorpos não são necessárias.
Uma vantagem deste procedimento é que ele não prescreve anticorpos monoclonais específicos para a medição do RSE para IgE. Anticorpos monoclonais anti-IgE alternativas têm sido mostrados para detectar apenas moléculas de IgE endógenos. O clone de hibridoma produz um R1E4-rato anti-IgE monoclonal anticorpo específico apenas para as moléculas da superfície endógenas, não citofílico IgE ligada a CD23 21,22, mas não está comercialmente disponível. O protocolo descrito acima é conveniente e econômico porque usa REAGE laboratório comumnts. O anticorpo anti-IgE utilizado aqui provavelmente se liga à IgE a um local sensível a clivagem mediada por tripsina, uma vez que o sinal de IgE devido às citofílico IgE é reduzido após o tratamento ligado ao receptor (Figura 2). No entanto pesquisadores execução deste protocolo tem a liberdade de escolher entre uma variedade de clones disponíveis comercialmente para experimentos. Além disso, o conceito de utilização de tripsina para remover as proteínas da superfície celular pode ser estendido para a detecção de outros marcadores de células por análise por FACS.
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Acknowledgments
DRW é suportado pelo NIH bolsas AI089972 e AI113217, e pela mucosa Estudos Imunologia Team, e detém um Prémio Carreira para médicos cientistas do Fundo Wellcome Burroughs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Mouse IgE FITC | BD Pharmingen | 553415 | clone R35-72 |
| Rat Anti-Mouse IgG1 PE | BD Pharmingen | 550083 | clone A85-1 |
| Methanol | BDH | BDH1135-4LP | Keep at -20 °C |
| Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
| Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
| Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-4052-82 | clone RA3-6B2 |
| anti-Mouse/Rat CD40 | eBioscience | 16-0402-85 | clone HM40-3 |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| MEM-NEAA (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Lifetechnologies (Corning) | 46-013-CM | |
| MACS CD45R (B220) microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-501 | |
| MACS purification column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| IL-4 | PeproTech | 214-14 | Reconstitute in water or 0.1% BSA |
| Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma Aldrich | T4174-100 ml | 5.0 g Trypsin, 2.0 g EDTA•4 Na per Liter of 0.9% NaCl |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100 ml | 10,000 U Penicillin; 10 mg/ml Streptomycin (100x) |
| L-Glutamine 200 mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| 2-mercaptoethanol (99%) | Sigma Aldrich | M6250-100 ml | |
| Red cell lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| Rat Anti-Mouse IgM RPE/Cy7 | SouthernBiotech | 1140-17 | clone 1B4B1 |
| HyClone Fetal Calf Serum | Thermo | SH30910.03 | |
| B cell Stimulation media | B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2.0 mM L-glutamine, 1x Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/ml), and anti-CD40 (1 µg/ml) |
References
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