Detecção de True IgE-expressando Rato B células da linhagem

Resumo

A análise in vitro da recombinação de troca de classe em camundongos é desafiadora devido às moléculas de IgE citofílicas ligadas aos receptores Fc na superfície das células B. Descrevemos um método para detecção de IgE usando clivagem mediada por tripsina de IgE ligada à superfície antes da fixação e permeabilização para coloração de fluorescência citoplasmática.

Resumo

B imunoglobulina linfócitos cadeia pesada (HGI) recombinação mudança de classe (CSR) é um processo em que, inicialmente, expressa IgM muda para outros isotipos CMI, tais como IgA, IgE e IgG. Medição de IgH RSE in vitro é um método fundamental para o estudo de uma série de processos biológicos variam de recombinação e reparação do ADN de aspectos da imunologia molecular e celular. Ensaio in vitro RSE envolve a superfície de medição de citometria de fluxo a expressão de Ig em células B activadas. Embora a medição de IgA e IgG subclasses é simples, medição de IgE por este método é problemático devido à ligação de IgE a FceRII solúvel / CD23 expresso na superfície de células B activadas. Aqui, descrevemos um processo único para a medição precisa de IgE células B de ratinho produtora que tenham sido submetidos a RSE em cultura. O método baseia-se na clivagem mediada por tripsina de complexos IgE-CD23 na superfície das células, permitindo a detecção de células produtoras de IgE da linhagem B por cycoloração toplasmic. Este procedimento oferece uma solução conveniente para a análise de citometria de fluxo de CSR para IgE.

Introdução

Durante cadeia pesada de imunoglobulina (IgH) recombinação mudança de classe (CSR) em ratos e seres humanos, o IgH μ exons região constante (Cμ) são eliminados e substituídos por um dos vários conjuntos de jusante exons região constante (C _H s) (por exemplo, Cy, Cε, e Ca), resultando numa passagem da produção de IgM para a produção de outras classes de Ig (por exemplo, IgG, IgE, ou IgA). RSE ocorre dentro de regiões de troca (S), que são sequências de 1-10 kb localizado 5 'em cada conjunto de C _H ¹ s. A enzima Activação Induzida citidina-desaminase (AID) inicia RSE através da actividade de citidina de de....

Protocolo

NOTA: Todas as experiências descritas aqui foram de acordo com as diretrizes Comitê Cuidados e Uso de Animais Institucional (IACUC) e aprovado pelo Animal Hospital Research para a Infância (ARCH), Boston, Massachusetts.

1. Preparação dos Reagentes

1. 1.000x IL-4 Stock: Diluir citocina IL-4 a 20 ng / ml em _H2O ou 0,1% de albumina de soro bovino (BSA). Distribuir em alíquotas de 200 ul a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e armazenar a -20 ° C.
2. 1.000 vezes anti-CD40: obter do fabricante a 1,0 mg / ml, armazenar a 4 ° C.
3. Meios estimulação das células B: Para 425 ml de meio RPMI-1640, adicionar 75 ml de descongelado de fresc....

Resultados

Este procedimento foi implementado com sucesso para estudar CSR para IgE em células B de ratinho. Para demonstrar a eficiência na medição RSE, que estimulou as células B do baço de ratinho com anticorpo anti-CD40 e IL-4 como descrito anteriormente ^11. Depois de cinco dias de estimulação, as células foram recolhidas e processadas utilizando o protocolo descrito acima e coradas com fluorescência marcado IgM, IgG1, IgE, anticorpos e B220 (CD45R). Recolhidas em linfócitos de detonação (Figura 1),.......

Discussão

A estimulação de células B do baço de rato em cultura com anti-CD40 e IL-4 irá simular tipo T helper 2 (T _H 2) interacções, troca de classe encorajador IgG1 e IgE ^5. As células B podem ser ativados para a RSE no âmbito do total esplenocitos ¹² ou células B do baço como purificados ^11. Como foi observado no protocolo (passo 2.3), o enriquecimento de células B é opcional, e fica ao critério do experimentador para determinar se seria benéfico. Separação magnética positiva de célu.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anti-Mouse IgE FITC	BD Pharmingen	553415	clone R35-72
Rato Anti-Mouse IgG1 PE	BD Pharmingen	550083	clone A85-1
Metanol	BDH	BDH1135-4LP	Mantenha em -20 ° C
Falcon Cell Strainer 40 µ m Nylon	Corning	352340
Falcon Cell Strainer 70 µ m Nylon	Corning	352350
Anti-Hu / Mo CD45R (B220) PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-4052-82	clone RA3-6B2
anti-Rato / Rato CD40	eBioscience	16-0402-85	clone HM40-3
RPMI Médio 1640	Gibco	11875-093
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
MEM-NEAA (100x)	Gibco	11140-050
Phosphate Buffered Saline (10x)	Lifetechnologies (Corning)	46-013-CM
MACS CD45R (B220) microesferas	Miltenyi Biotec	130-049-501
MACS	Miltenyi Biotec	130-042-401
IL-4	PeproTech	214-14	Reconstituir em água ou solução de formalina BSA a 0,1%,
tamponado neutro, solução de	Sigma Aldrich	HT501128-4L
(10x)	Sigma Aldrich	T4174-100 ml	5,0 g de tripsina, 2,0 g de EDTA• 4 Na por litro de 0,9% NaCl
Penicilina-estreptomicina	Sigma Aldrich	P0781-100 ml	10.000 U Penicilina; 10 mg/ml Estreptomicina (100x)
L-Glutamina 200	mM Sigma Aldrich	G7513
2-mercaptoetanol (99%)	Sigma Aldrich	M6250-100 ml
Tampão de lise de glóbulos vermelhos	Sigma Aldrich	R7757
Rato Anti-Rato IgM RPE/Cy7	SouthernBiotech	1140-17	clone 1B4B1
HyClone Fetal Calf Serum	Thermo	SH30910.03
B cell Estimulação media			B cell media consiste em RPMI com soro fetal de bezerro (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2.0 mM L-glutamina,  1x Penicilina-Estreptomicina (Penicilina: 100 U/ml, Estreptomicina: 100 µ g/ml), Beta-mercaptoetanol (7 µ L/L), IL-4 (20 ng/ml) e anti-CD40 (1 µ g/ml)

Coluna de purificação tripsina-EDTA 10%