Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methode voor de dynamische meting en kwantificering van bloedstroomsnelheid binnen individuele bloedvaten van de muizenlevervaten met behulp van intravitale microscopie-beeldvorming in combinatie met een specifieke methodologie voor beeldverwerving en analyse.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Intravitale Microscopie Imaging van de lever volgende
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Intravitale microscopie (IVM) is een krachtige optische beeldvormende techniek die de visualisatie, bewaking en kwantificering van verscheidene biologische processen in real time en in levende dieren mogelijk gemaakt. Deze technologie is sterk geavanceerde ons begrip van fysiologische processen-pathogeen gemedieerde verschijnselen in specifieke organen.
In deze studie wordt IVM toegepast op de muizenlever en protocollen zijn ontworpen om de beeldpositie in vivo de bloedsomloop van de lever en meet rode bloedcel (RBC) snelheid in afzonderlijke vaten lever. Om de verschillende subtypes vaartuig dat de lever orgaan karakteriseren visualiseren en uitvoeren bloedstroom snelheidsmetingen worden C57BL / 6-muizen intraveneus geïnjecteerd met een fluorescent reagens dat de plasma-lever geassocieerde vasculatuur labels. IVM maakt in vivo, real-time meting van RBC snelheid in een bepaald vaartuig van belang. Vaststelling van deze methodologie zal het mogelijk te makenonderzoeken lever hemodynamiek onder fysiologische en pathologische omstandigheden. Uiteindelijk zal dit imaging-gebaseerde methodologie belang zijn voor het bestuderen van de invloed van L. donovani infectie op de lever hemodynamiek.
Deze methode kan worden toegepast op andere infectieuse modellen en muis organen en kunnen verder worden uitgebreid pre-klinisch testen van een drug effect op de ontsteking door het kwantificeren van het effect op de bloedstroom.
Inleiding
Organ-specifieke hemodynamica zijn belangrijke fysiologische kenmerken van elke zoogdieren orgaan. Afwijkingen in de bloedstroom kan het gevolg zijn van een ontsteking en een teken van orgaanstoornissen 1 zijn. Aldus bloedstroom organisatie structuur en functie lijken kritische parameters voor analyse onder fysiologische en pathologische omstandigheden. De technieken die gewoonlijk zijn gebruikt voor het analyseren van bloedstroming in een bepaald orgaan bevatten verscheidene beperkingen, waaronder de resolutiegrens van de techniek zelf (bijvoorbeeld Doppler beeldvorming van bloedstroming), het vermogen tot het meten van absolute bloedstroom slechts (hoeveelheid bloed per eenheid die een orgaan) (bv Optical Coherence Tomography) en het meten van de gemiddelde veranderingen in snelheid een grote en heterogene populatie van bloedvaten 2,3. Bloedsomloop van de lever koppelt verschillende vaartuig subtypes die heterogeen in omvang, structuur en functie zijn. InDeze studie, intravitale microscopie (IVM) beeldtechnologie toegepast op lever hemodynamica evalueren in vivo, in real time, met een hoge resolutie en parallel met de kenmerken van de individuele bloedvaten die de lever orgaan omvatten ontdekken. De recente ontwikkeling van deze krachtige optische beeldvormende techniek kan de onderzoeker dynamische gegevens te verzamelen op levende dieren bij een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Doordat de directe visualisatie en real time monitoring van specifieke en snelle biologische processen in vivo, IVM biedt een unieke gelegenheid om de onderzoeker op de foto om individuele bloedvaten, en meten en kwantificeren van de snelheid van enkele rode bloedcellen (RBC) binnen een specifiek geselecteerd lever schip.
In deze studie hebben we de IVM techniek in de muizenlever uitgevoerd om de invloed van muis infectie door het hepatotrope Leishmania parasiet lever hemodynamiek onderzoeken. L. donovanimandataris is verantwoordelijk voor viscerale leishmaniasis, ernstige ziekte gekenmerkt door acuut op chronische inflammatoire reacties en pathologie die in meerdere organen, zoals de milt en de lever. In een experimenteel muizenmodel van viscerale leishmaniasis, de lever infectie zonder behandeling terwijl de milt infectie progressief 4. Deze uitkomsten van Leishmania infectie met betrekking tot de individuele organen nog niet volledig begrepen. Onderzoek van de lever en de milt hemodynamiek onder pathologische omstandigheden zal een nieuw licht werpen op gastheer-parasiet interacties en ziekte pathogenese.
Ons experimentele model is gebaseerd op het blootstellen en beeldvorming van de lever van een verdoofde muis die intraveneuze injectie van specifieke fluorescente kleurstoffen ontvangen voor de etikettering van de lever intravasculature. De lever is gunstig orgaan voor intra-vitale microscopie. Na het uitvoeren van een kleine incision in de buik, wordt de lever voorzichtig buiten gebracht en geplaatst op nat gaasje en vervolgens op een dekglaasje met de doelstelling om eventuele bewegingsartefacten als gevolg van hartslag en ademhaling. De lever wordt vervolgens binnen het oog van een microscoop lens geplaatst. In vergelijking met de milt en lymfeklieren die het gebruik van twee foton microscopie voor IVM studies nodig, het voordeel van de lever ligt in de homogene 3D architectuur / anatomie die het mogelijk maakt het gebruik van een conventionele confocale microscoop met een maximale penetratiediepte van ongeveer 50 urn voor intravitale microscopie imaging 5-8.
In deze studie worden twee onafhankelijke beeldvormende methoden voor de kwantitatieve meting van RBC snelheid en bloed stroomsnelheid in afzonderlijke bloedvaten. In de eerste werkwijze wordt leverbloedstroom verkregen met behulp van een xy tweedimensionale functie in de tijd. De resulterende XYT gegevens geanalyseerd met de MtrackJ plugin in de vrije ImageJ software, die zorgt voor het volgen van indiUAL RBC in de tijd. In de tweede methode wordt een bloedvat geselecteerd en de bijbehorende bloedstroom wordt geanalyseerd met de lijnaftasting snelle acquisitie modus van de confocale laser scanning microscoop. Het schip van de rente wordt gescand bij hoge frequentie langs de centrale as door een axiale lijn. De bloedstromingssnelheid wordt vervolgens gekwantificeerd op basis van het verschil in contrast tussen ongelabelde donker erytrocyten en fluorescent gelabelde plasma. De fluorescentie-intensiteiten van RBC en plasma verkregen langs de lijn scan zijn tegen de tijd uitgezet om strepen te verkrijgen, de hoeken van die evenredig zijn met de snelheden van een individuele RBC.
Het doel van dit artikel is een eenvoudige en reproduceerbare werkwijze voor beeldvorming en meting bloedstroomsnelheid binnen afzonderlijke bloedvaten van de lever, waarna de beschikbare maken de fundamentele hulpmiddelen voor de succesvolle uitvoering van muis chirurgie, IVM en kwantitatieve analyse van de snelheid van individuele RBC. Tzijn aanpak kunnen de onderzoekers tot nieuwe inzichten in het bloed snelheid te winnen onder pathologische omstandigheden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Ethics statement: Alle dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en protocollen die werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Aix-Marseille Université, Frankrijk. Vrouwelijke C57BL / 6 muizen op 8 - 10 weken oud werden commercieel verkregen en behandeld volgens de regels van Décret N ° 8 87-848, 19 oktober 1987, Parijs. Alle experimenten met L. donovani LD1S parasieten werden uitgevoerd in overeenstemming met bioveiligheid regelgeving van de Franse en Europese wetgeving.
1. Mouse Infectie met L. donovani promastigoot Parasieten
- Bereid het kweekmedium voor in vitro onderhouden van L. donovani promastigoot parasieten, LD1S (MHOM / SD / 62 / 1S-CL2D).
- Gebruik M199 medium. Aangevuld M199-medium met 10% foetaal kalfsserum (warmte-geïnactiveerd bij 56 ° C gedurende 30 min), 25 mM HEPES pH 6,9, 12 mM NaHCO 3, 1 mM gluTamine, RPMI 16040 vitaminemix, 10 mM foliumzuur, 100 mM adenosine, 7,6 mM hemine, 50 U / ml penicilline en 50 mg / ml streptomycine.
- Culture LD1S parasieten in 10 ml compleet M199 medium bij 26 ° C in een 25 cm2 kolf geventileerd.
- Met behulp van opeenvolgende differentiële centrifugatiestappen, bereiden een bevolking van promastigoot parasieten die zijn verrijkt in metacyclische vormen.
- Oogst een mid-log-fase parasiet cultuur. Reken op een hemocytomer. Resuspendeer 5 x 10 5 parasieten / ml in 10 ml compleet medium M199. Grow de parasiet cultuur in anaerobe omstandigheden tot zij de late stationaire fase (ongeveer 5-6 dagen) te bereiken.
- Draai de LD1S kweek bij 1200 xg gedurende 10 min bij 26 ° C die niet-metacyclische parasieten pellet werd de bovenstaande herstellen en weer draaien bij 2500 xg bij 26 ° C gedurende 10 min.
Opmerking: deze laatste pellet wordt hoogverrijkt in metacyclische promastigoot parasieten. - Resuspendeer de pellet in 100 pl PBS. Verwijderen van een kleine hoeveelheid voor fixatie met 25% glutaaraldehyde 1/100 v: v en tel parasieten met behulp van een hemocytometer.
- Verdun de verrijkte metacyclische parasietenpopulatie tot 1 x 10 7/100 pi in PBS. Injecteer de parasiet suspensie in de staartader van een verdoofde muis (zie hierna) met een 1 ml spuit met een 30 G naald. Bij controledieren, injecteer 100 ul PBS in de staartader.
2. Chirurgische ingrepen
- Ontsmet de werkruimte met een biocide desinfecterende spray en de chirurgische instrumenten 70% ethanol gedurende 30 minuten.
- Bereid een anestheticum, afhankelijk van het gewicht van het dier, bevattende 125 mg / kg ketamine en 12,5 mg / kg xylazine verdund in PBS.
- Weeg de muis en intraperitoneaal injecteren van de juiste dosis van het verdovingsmiddel met een 1 ml spuit met een 30 G naald.
- Houd de muis warm en controleer of de muis is volledig anesthedopen door knijpen de voet pad voordat u verder gaat. Opnieuw Injecteer halve dosis van het anestheticum in de muis elke 60 min.
- Scheer de buik van de muis en reinig deze met Vetedine. Voeg een kleine incisie in de huid en spieren onder de thorax aan de linkerzijde van de buik.
- Leg een stukje vochtig gaas op de buik net onder het open gebied. Expose de lever en plaats het op het gaas. Leg een ander stuk van vochtige gaas boven de lever.
- Plaats een 24 x 60 mm 2-150 urn dik dekglaasje, cyanoacrylaat gebonden aan een metalen frame, de lever voor visualisatie onder een microscoop.
- Bescherm de ogen van de muis met een nat gaasje.
- Na de opnamesessie, euthanaseren van de dieren verdoofd door cervicale dislocatie.
3. Intravitale Microscopie Imaging van de lever Architecture
- Voer de intravitale microscopie experimenten op een omgekeerde confocale microscoop uitgerust met tenhermostatic gecontroleerde kamer, een apochromatische 63x olie glycerol immersie objectief (NA 1,4), Argon (488 nm) en HeNe (543 nm, 633 nm), lasers en een blauwe diode (405 nm).
- Plaats de muis op het podium van de microscoop met het dekglaasje die de lever gezicht naar beneden op de doelstelling. Stel de temperatuur van de kamer tot 29 ° C. Pas de scherpstelling met behulp van de lever autofluorescentie mogelijk te maken voor visualisatie van de sinusoïden.
- Om de vasculatuur te visualiseren, wordt een oplossing van 500 ug BSA-Alexa 647 verdund in 100 pl PBS voor elke muis. Injecteer oplossing intraveneus in de staartader van de verdoofde muis met behulp van een 1 ml spuit met een 30 G naald.
- Om de lever celkernen visualiseren, een oplossing van Hoechst 33342 in PBS. Injecteer deze oplossing bij 8 mg / kg muis intraperitoneaal met een 1 ml spuit met een 30 G naald.
- Gebruik de normale sequentiële modus, de 63x immersie objectief en de scanner bij 400 Hz het imago van de levercelkernen en de lever vaatstelsel. Zet de 405 nm blauwe diode voor Hoechst excitatie en 633 nm laser voor BSA-Alexa 647 excitatie. Zet de Argon 488 nm laser en definiëren een grote overname band naar de lever autofluorescentie visualiseren.
4. Intravitale Microscopie Imaging van de lever voor Blood Flow Speed Measurement
- Open de LAS software van de microscoop (LAS-AF viewer Versie 3.1.0 build 8587). Selecteer de resonantie scanner modus bij het openen van de microscoop software.
- Klik op het tabblad configuratie om de hardware te stellen. Klik op de laser en selecteer de HeNe 633 laser. Klik op Instellingen en selecteer 12 bits resolutie.
- Klik op de overname menu. In het venster balk pad instellingen, selecteert u het doel 63x en het opzetten van de 633 laservermogen tot 100%. Activeer de signaalversterking en uit ingestelde parameters door Alexa-633 te selecteren uit de PM1-3 drop-down menu.
- In het tabblad verwerven, selecteer de 'XYT' overnamemodus. Stel formaat breedte op 1.024 x 1.024. Selecteer snelheid bij 8.000 Hz. Selecteer de pinhole van 3 Airy eenheden. Selecteer een zoomfactor van 3. Heeft de bidirectionele modus niet selecteren.
5. Kwantitatieve Analyse van RBC Velocity Met de xyt Images (Methode 1)
- Klik op het pictogram 'Live' om de bloedstroom op een live-modus te visualiseren. Kies het gebied van belang en selecteer een bepaald bloedvat voor analyse. Zet het schip van belang zijn voor horizontale positie door aanpassing van de 'X', 'Y' en scan veld rotatie coördinaten op USB bedieningspaneel.
- Stop de 'Live' modus zodra het vat van belang is ingesteld. Wijzig de ingestelde breedte naar 1024 x 256 in de overname-modus instellen venster, lijn gemiddelde = 1, kader gemiddelde = 1, selecteer "stacks" 150. Klik op 'start' om beelden te verwerven.
- Voor de kwantitatieve analyse van RBC snelheid met behulp van de "xyt" afbeeldingen openen de ImageJ software. Selecteer de 'Bestand'tab in ImageJ, klik op "Open" en kies vervolgens het bestand van belang.
- Ga naar de "plugin" menu in ImageJ, selecteert LOCI en Bio-formaten te importeren opties. In dit venster selecteert u de stapel bekijken van parameters als 'HyperStack'. In de optie stapel volgorde, selecteert u de optie: "xyzct". Opmerking: Dit opent een venster met alle reeks overnames.
- Klik op 'Plugins' op het ImageJ menu en selecteer MTrackJ optie. Klik op het pictogram 'add' op het kleine venster en klik op de RBC op te sporen. Klik op dezelfde RBC in elk volgende frame en klik op het pictogram "maatregel" om de snelheid te meten.
Opmerking: Het bestand gegenereerd kan in .exl formaat worden opgeslagen. - Track minste vijf erytrocyten per schip en analyseren van ten minste drie afzonderlijke vaten van dezelfde grootte.
6. Kwantitatieve Analyse van RBC Velocity Met de xt Line Images (Methode 2)
- Klik op 'Live' om het bloed f visualiserenlaag in de live-modus. Selecteer een bepaald bloedvat voor analyse. Zet het schip van belang zijn voor de horizontale positie. Stop de 'Live' modus zodra het vat van belang is ingesteld.
- Selecteer de 'xt' scanning mode en zet de centrale lumen van de geselecteerde schip langs de lijn scan. Set formaat breedte bij 1.024 x 512, snelheid = 8,000Hz, lijn gemiddelde = 32, time = 512. Klik op 'start' en het verwerven van de xt lijn beelden.
- Genereer strepen voor de kwantitatieve analyse van RBC snelheid door het openen van de .lif bestand en de xt lijn beeld van belang openen. In LAS-AF software, selecteer "experimenten", opent de .lif en selecteer de afbeelding. Opmerking: Het zal automatisch een kymograaf openen.
- Meet de tijd (t, verkregen op de Y-as) vereist voor een deeltje strook (weergegeven reflectie donker) naar een bepaalde afstand (d, verkregen op de X-as) Beoordelingen dit kymograaf. Selecteer het gereedschap "draw line" en trek een lijn horizontaal naar de streep. Let op de afstandpm en de tijd in seconden gegenereerd in de tab resultaat bij de onderkant van het beeld.
- Bereken de snelheid als V = afstand / tijd met behulp van de verkregen uit de kymograaf waarden.
- Kwantificeren minste vijf deeltjes stroken xt per beeld en ten minste drie afzonderlijke vaten van dezelfde grootte.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De specifieke architecturale ordening van de sinusoïden van de lever kan worden gevisualiseerd basis van de eigenschap autofluorescente van deze organen (figuur 1, paneel B en C, groen), intraperitoneale injectie van Hoechst voor de etikettering van hepatocyten nuclei (figuur 1B, blauw) en de intraveneuze injectie van fluorescent BSA voor kleuring van de lever bloedsomloop (figuur 1C, red). De lever is samengesteld uit verschillende subtypes vat met verschillende functi...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De recente ontwikkeling van intravitale microscopie van de muizenlever opent nieuwe mogelijkheden voor het onderzoeken van de fysiologische reactie op infectie in vivo en in real time 5,9,10. Organ bloedstroom kritische fysiologische parameter die vaak wordt veranderd bij vele ziekten. Echter, de status van de lever hemodynamiek onder fysiologische en besmettelijke aandoeningen blijft een slecht onderzocht gebied. In deze studie IVM-gebaseerde werkwijzen, die eerder zijn aangepast voor de studie van ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd gesteund door de INSERM, de Universiteit van Aix-Marseille en een Career Development Award van HFSPO verkregen door CL Forestier.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| BSA-Alexa 647 | lifetechnologies | A34785 | |
| Dextran-FITC 500 mol wt | SIGMA | 46947 | |
| Ketamine | PanPharma | 20434 | |
| Xylazine | Bayer | KP07KEU | |
| Vetedine | Pharma Animal | 6869029 | |
| Cyanoacrylate liquid | Cyanolit | 5833300005 | |
| Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013 | Molecular machines | 50103 | |
| Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm | DiaPath | 61061 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS-SP5 | |
| LAS-AF viewer | Leica software | Version 3.1.0 buid 8587 |
Referenties
- Vollmar, B., Menger, M. D. The hepatic microcirculation: mechanistic contributions and therapeutic targets in liver injury and repair. Physiol. Rev. 89, 1269-1339 (2009).
- Srinivasan, V. Absolute blood flow measured by optical methods. SPIE Newsroom. , (2011).
- Seifalian, A. M., Stansby, G. P., Hobbs, K. E., Hawkes, D. J., Colchester, A. C. Measurement of liver blood flow: a review. HPB. Surg. 4, 171-186 (1991).
- Engwerda, C. R., Ato, M., Kaye, P. M. Macrophages, pathology and parasite persistence in experimental visceral leishmaniasis. Trends Parasitol. 20, 524-530 (2004).
- Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6, e1000805(2010).
- Lee, W. Y., et al. An intravascular immune response to Borrelia burgdorferi involves Kupffer cells and iNKT cells. Nat. Immunol. 11, 295-302 (2010).
- Geissmann, F., et al. Intravascular immune surveillance by CXCR6+ NKT cells patrolling liver sinusoids. PLoS Biol. 3, e113(2005).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat. protocols. 10, 258-268 (2015).
- Thiberge, S., et al. In vivo imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat. protocols. 2, 1811-1818 (2007).
- Vacchina, P., Morales, M. A. In vitro screening test using Leishmania promastigotes stably expressing mCherry protein. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 1825-1828 (2014).
- Ferrer, M., Martin-Jaular, L., Calvo, M., del Portillo, H. A. Intravital microscopy of the spleen: quantitative analysis of parasite mobility and blood. J. Vis. Exp. , (2012).
- Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nat. Methods. 7, 655-660 (2010).
- MacPhee, P. J., Schmidt, E. E., Groom, A. C. Intermittence of blood flow in liver sinusoids, studied by high-resolution in vivo microscopy. Am. J. Phys. 269, G692-G698 (1995).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
